专利名称：N取代α氨基酸的酶催化拆分方法
技术领域：
本发明涉及一种外消旋光学异构体生物化学拆分方法，特别涉及一种N取代α氨基酸外消旋光学异构体的酶催化拆分方法。
背景技术：
非蛋白氨基酸具有独特的生物学功能和药用价值，使其成为研究和开发的新方向和热点之一。N取代α氨基酸是非蛋白氨基酸衍生物中的一类化合物，是合成药物，农药，液晶材料的重要原料。它通常具有两个异构体，由单一构型的N取代α氨基酸出发，可以为药物分子引入手性，如(S)-2-[(2-甲基-6-乙基)苯基氨基]丙酸是手性除草剂异丙甲草胺的关键中间体。
目前制备单一构型N取代α氨基酸通常采用化学拆分方法(5002606；United States Patent；Magden H.M.，Binnigen C.V.；1991)，然而，化学方法需要消耗较多的有机溶剂、污染环境、反应后处理也比较复杂。另外反应所需要的高温有可能导致产物的外消旋化、降解等副反应的发生，从而影响N取代α氨基酸的光学纯度。利用酶进行高选择性和高效的有机合成是当今合成化学的热点之一，其中以酶催化制备单一手性化合物备受瞩目，研究相当活跃。采用酶法对N取代α氨基酸进行拆分同化学方法相比，具有底物专一性好，立体选择性强，反应条件温和，产品易分离等化学方法所不能比拟的优点。
发明内容
本发明提供了一种在温和条件下，酶催化拆分N取代α氨基酸外消旋光学异构体，制备高光学纯和高化学纯的N取代α氨基酸的方法。
本发明提供的脂肪酶催化拆分N取代α氨基酸外消旋光学异构体方法，按如下步骤进行(a)使结构式为 的外消旋N-取代α氨基酸酯、缓冲溶液和脂肪酶，在恒温搅拌或振荡下反应，达到最高转化率后，终止反应，反应混合物含有一种构型N取代α氨基酸和未反应的另一种构型N取代α氨基酸酯；(b)该混合物用乙醚萃取除去未反应的另一种构型N取代α氨基酸酯；(c)水层酸化到PH5.5，用乙醚萃取；(d)乙醚层用无水硫酸钠干燥后，旋转蒸发，得到一种构型N取代α氨基酸；(e)含未反应的另一种构型N取代α氨基酸酯的乙醚层经旋转蒸发，进一步酶催化水解，加入缓冲液和另行选择的脂肪酶，在恒温搅拌或振荡下反应，达到最高转化率后，终止反应；(f)水层酸化到PH5.5，用乙醚萃取；(g)乙醚层用无水硫酸钠干燥后，旋转蒸发，得到另一种构型N取代α氨基酸。
上述(a)的反应可用以下反应式表示
本发明所拆分的结构式为 的N-取代α氨基酸酯式中R1和R2分别可以是直链烷烃、支链烷烃、烷烃衍生物、芳香烃及芳香烃衍生物；R3可以是直链烷烃，优选C1-C5的直链烷烃。
本发明所选用的脂肪酶可以是动物、微生物等各种来源的脂肪酶。
本发明所用的脂肪酶可以是游离酶也可以是固定化酶。
本发明所使用的游离脂肪酶与底物的质量比可以是1∶20-1∶1、固定化脂肪酶与底物的质量比可以是3∶1-9∶1。
本发明所使用的缓冲溶液可以是pH7.0-8.5范围的任何类型缓冲溶液。
本发明酶催化反应时间为4-96小时。
本发明恒温温度可选择范围为20-45℃。
本发明酸化剂可用盐酸、硫酸、磷酸、醋酸的溶液。
本发明所用的反应装置可因反应量多少设计，如果在实验室，可以把反应体系设在0.5mL到1000mL之间，用单颈三角烧瓶、圆底烧瓶，磁力搅拌，热电耦控温，或放到恒温摇床中振荡；如果在反应釜中大量生产，可用机械搅拌，水浴恒温。
本发明还提供一种测定N取代α氨基酸转化率和对映体过量值的方法转化率的检测通过高效毛细管电泳，以三乙胺/乙酸缓冲液作为背景电解质溶液，反向电场强度340V/cm，电泳温度20℃，样品浓度50mg/L，紫外检测器200nm。
对映体过量值检测通过高效毛细管电泳，以三乙胺/乙酸缓冲液作为背景电解质溶液，采用环糊精作为手性选择剂，不需要处理毛细管柱，反向电场强度340V/cm，电泳温度20℃，样品浓度50mg/L，紫外检测器200nm，就可以使N取代α氨基酸对映体得到较好分离。
本发明利用脂肪酶催化拆分制备N取代α氨基酸方法具有以下优点(1)酶催化拆分反应条件温和，基本没有副产物生成，可以得到高化学纯和光学纯的目标化合物N取代α氨基酸。
(2)拆分反应效率高，经过两步酶法拆分过程可以得到高化学纯和光学纯的另一构型的N取代α氨基酸，这样可以降低成本。
(3)实验操作简单，不需要减压蒸馏、柱层析等复杂的纯化过程，仅需要简单的萃取操作过程，就可以得到高化学纯和光学纯的N取代α氨基酸。而且萃取所需要的有机溶剂—乙醚经低温旋转蒸发后可重复使用；(4)反应完全在纯缓冲溶液体系中进行，避免了化学方法中的大量有机溶剂的使用，减少了环境污染。
以下实施例旨在说明本发明实施例一100mL反应瓶中，分别加入外消旋2-[(2-甲基-6-乙基)苯基氨基]丙酸苄基酯(5mmol)，磷酸缓冲液(pH7.0)，枯草杆菌脂肪酶(100mg)，37℃恒温摇床中开始反应。反应48小时后结束反应，用乙醚萃取除去未反应的(S)-2-[(2-甲基-6-乙基)苯基氨基]丙酸苄基酯，水层用0.1mol/L HCL酸化到pH5.5，然后用乙醚进行萃取，乙醚层经无水硫酸钠干燥后，旋转蒸发，得到高化学纯和光学纯的(R)-2-[(2-甲基-6-乙基)苯基氨基]丙酸产品，产量0.48g，化学纯度94％，旋光纯度90％e.e.p。
未反应的(S)-2-[(2-甲基-6-乙基)苯基氨基]丙酸苄基酯(0.5g)加入到含有南极假丝酵母脂肪酶(0.1g)的磷酸缓冲液(pH8.0)中，25℃恒温摇床中开始反应，反应4小时后，结束反应，用0.1mol/LHCL酸化到pH5.5，然后用乙醚进行萃取，乙醚层经无水硫酸钠干燥后旋转蒸发，得到高化学纯和光学纯的(S)-2-[(2-甲基-6-乙基)苯基氨基]丙酸产品，产量0.46g，化学纯度96％，旋光纯度92％e.e.p。
以下证明(S)-2-[(2-甲基-6-乙基)苯基氨基]丙酸的绝对构型通过旋光仪测定拆分后得到的2-[(2-甲基-6-乙基)苯基氨基]丙酸的比旋光度同专利(5002606；United States Patent；Magden H.M.，Binnigen C.V.；1991)所报告的(S)-2-[(2-甲基-6-乙基)苯基氨基]丙酸的比旋光度相比较，可以判定拆分得到的酸的绝对构型。
以下方法测定(S)-2-[(2-甲基-6-乙基)苯基氨基]丙酸的转化率和对映体过量值转化率的检测通过高效毛细管电泳，以三乙胺/乙酸缓冲液作为背景电解质溶液(100mmol/L，pH＝5.5)，反向电场强度340V/cm，电泳温度20℃，样品浓度50mg/L，紫外检测器200nm。
对映体过量值检测通过高效毛细管电泳，以三乙胺/乙酸缓冲液作为背景电解质溶液(100mmol/L pH＝5.5)，采用2，6-O-二甲基-β-环糊精(40mmol/L)作为手性选择剂，不需要处理毛细管柱，反向电场强度340V/cm，电泳温度20℃，样品浓度50mg/L，紫外检测器200nm，就可以使2-[(2-甲基-6-乙基)苯基氨基]丙酸对映体得到较好分离。
实施例二100mL反应瓶中，分别加入外消旋2-[(2-甲基-6-乙基)苯基氨基]丙酸叔丁酯(5mmol)，碳酸钠缓冲液(pH8.5)，猪胰脂肪酶(0.4g)，37℃恒温摇床中开始反应，96小时后结束反应，用乙醚进行萃取除去未反应的(S)-2-[(2-甲基-6-乙基)苯基氨基]丙酸叔丁酯，水层用0.1mol/L H2SO4酸化到pH5.5，然后用乙醚进行萃取，乙醚层经无水硫酸钠干燥后旋转蒸发，得到高化学纯和光学纯的(R)-2-[(2-甲基-6-乙基)苯基氨基]丙酸产品，产量0.50g，化学纯度98％，旋光纯度94％e.e.p。
未反应的(S)-2-[(2-甲基-6-乙基)苯基氨基]丙酸叔丁酯(0.6g)加入南极假丝酵母脂肪酶(0.1g)，磷酸缓冲液(pH8.0)，25℃恒温摇床中开始反应。反应4小时后，结束反应，用0.1mol/L H2SO4酸化到pH5.5，然后用乙醚进行萃取，乙醚层经无水硫酸钠干燥后旋转蒸发，得到高化学纯和光学纯的(S)-2-[(2-甲基-6-乙基)苯基氨基]丙酸产品，产量0.40g，化学纯度96％，旋光纯度92％e.e.p。
拆分得到的酸的绝对构型的证明、转化率和对映体过量值测定同实施例三100mL反应瓶中，分别加入外消旋2-[(2-甲基-6-乙基)苯基氨基]丙酸甲酯(5mmol)，磷酸缓冲液(pH7.5)，柱状假丝酵母脂肪酶(0.3g)，40℃恒温摇床中开始反应，反应70小时后结束反应，用乙醚萃取除去未反应的(R)-2-[(2-甲基-6-乙基)苯基氨基]丙酸甲酯，水层用0.1mol/L醋酸酸化到pH5.5，然后用乙醚萃取，乙醚层经无水硫酸钠干燥后旋转蒸发，得到(S)-2-[(2-甲基-6-乙基)苯基氨基]丙酸产品，产量0.5g，化学纯度99％，旋光纯度99％e.e.p。
未反应的(R)-2-[(2-甲基-6-乙基)苯基氨基]丙酸甲酯(0.5g)加入假单胞菌脂肪酶(0.2g)，磷酸缓冲液(pH8.0)，45℃恒温摇床中开始反应。反应60小时后结束反应，用0.1mol/L醋酸酸化到pH5.5，然后用乙醚进行萃取，乙醚层经无水硫酸钠干燥后旋转蒸发，得到高化学纯和光学纯的(R)-2-[(2-甲基-6-乙基)苯基氨基]丙酸产品，产量0.4g，化学纯度96％，旋光纯度92％e.e.p。
拆分得到的酸的绝对构型的证明、转化率和对映体过量值的测定同实施例一。
实施例四100mL反应瓶中，分别加入外消旋2-(3-氟甲基苯基氨基)丙酸异丙酯(5mmol)，磷酸缓冲液(pH8.0)，假单胞菌脂肪酶(0.2g)，45℃恒温摇床中开始反应，反应60小时后，用乙醚进行萃取除去未反应的(S)-2-(3-氟甲基苯基氨基)丙酸异丙酯，水层用0.1mol/L HCL酸化到pH5.5，然后用乙醚进行萃取，乙醚层经无水硫酸钠干燥后旋转蒸发，得到(R)-2-(3-氟甲基苯基氨基)丙酸产品，产量0.5g，化学纯度99％，旋光纯度92％e.e.p。
未反应的(S)-2-(3-氟甲基苯基氨基)丙酸异丙酯(0.5g)加入到含有南极假丝酵母脂肪酶(0.1g)的磷酸缓冲液(pH8.0)中，25℃恒温摇床中开始反应，反应4小时后，结束反应，用0.1mol/LHCL酸化到pH5.5，然后用乙醚进行萃取，乙醚层经无水硫酸钠干燥后旋转蒸发，得到高化学纯和光学纯的(S)-2-(3-氟甲基苯基氨基)丙酸产品，产量0.45g，化学纯度96％，旋光纯度85％e.e.p。
拆分得到的酸的绝对构型的证明、转化率和对映体过量值的测定同实施例一。
实施例五100mL反应瓶中，分别加入外消旋2-异丙基氨基丙酸苄基酯(5mmol)，磷酸缓冲液(pH8.0)，南极假丝酵母脂肪酶(0.2g)，25℃恒温摇床中开始反应。反应4小时后结束反应，用乙醚萃取除去未反应的(R)-2-异丙基氨基丙酸苄基酯，水层用0.1mol/L HCL酸化到pH5.5，然后用乙醚萃取，乙醚层经无水硫酸钠干燥后旋转蒸发，得到(S)-2-异丙基氨基丙酸产品，产量0.55g，化学纯度99％，旋光纯度98％e.e.p。
未反应的(R)-2-异丙基氨基丙酸苄基酯(0.5g)加入假单胞菌脂肪酶(0.2g)，磷酸缓冲液(pH8.0)，45℃恒温摇床中开始反应。反应60小时后结束反应，用0.1mol/L HCL酸化到pH5.5，然后用乙醚进行萃取，乙醚层经无水硫酸钠干燥后旋转蒸发，得到高化学纯和光学纯的(R)-2-异丙基氨基丙酸产品，产量0.45g，化学纯度99％，旋光纯度98％e.e.p。
拆分得到的酸的绝对构型的证明、转化率和对映体过量值的测定同实施例一。
实施例六100mL反应瓶中，分别加入外消旋2-[(2，6-二甲基)苯基氨基]丁酸甲酯(5mmol)，磷酸缓冲液(pH8.0)，固定化假单胞菌脂肪酶(9.0g，)(假单胞菌脂肪酶以分子筛为载体固定化)，37℃恒温摇床中开始反应，反应50小时后结束反应，反应混合物滤去酶，用乙醚进行萃取除去未反应的(S)-2-[(2，6-二甲基)苯基氨基]丁酸甲酯，水层用0.1mol/L HCL酸化到pH5.5，然后用乙醚萃取，乙醚层经无水硫酸钠干燥后旋转蒸发，得到高化学纯和光学纯的(R)-2-[(2，6-二甲基)苯基氨基]丁酸产品，产量0.52g，化学纯度91％，旋光纯度90％e.e.p。
未反应的(S)-2-[(2，6-二甲基)苯基氨基]丁酸甲酯(0.5g)加入南极假丝酵母脂肪酶(0.1g)，磷酸缓冲液(pH8.0)，25℃恒温摇床中开始反应，反应4小时后，结束反应，用0.1mol/L HCL酸化到pH5.5，然后用乙醚进行萃取，乙醚层经无水硫酸钠干燥旋转蒸发，得到高化学纯和光学纯的(S)-2-[(2，6-二甲基)苯基氨基]丁酸产品，产量0.5g，化学纯度99％，旋光纯度98％e.e.p。
滤出的固定化脂肪酶经处理后，可以重复使用多次。
转化率和对映体过量值的测定同实施例一。
权利要求
1.一种脂肪酶催化拆分N取代α氨基酸外消旋光学异构体的方法，按如下步骤进行(a)使结构式为 外消旋N取代α氨基酸酯，缓冲液和脂肪酶，在恒温搅拌或振荡下反应，达到最高转化率后，终止反应，反应混合物中含有一种构型N取代α氨基酸和未反应另一种构型N取代α氨基酸酯；(b)该混合物用乙醚萃取除去未反应的另一种构型N取代α氨基酸酯；(c)水层酸化到pH5.5，用乙醚萃取；(d)乙醚层用无水硫酸钠干燥后，旋转蒸发，得到一种构型N取代α氨基酸；(e)含有未反应的另一种构型N取代α氨基酸酯的乙醚层经旋转蒸发后，进一步酶催化水解，加入缓冲液和另行选择的脂肪酶，在恒温搅拌或振荡下反应，达到最高转化率后，终止反应；(f)水层酸化到pH5.5，用乙醚萃取；(g)乙醚层用无水硫酸钠干燥后，旋转蒸发可得另一种构型N取代α氨基酸。
2.按照权利要求1的方法，其中N取代α氨基酸酯结构式中R1和R2分别可以分别是直链烷烃、支链烷烃、烷烃衍生物、芳香烃及芳香烃衍生物，R3可以是直链烷烃。
3.按照权利要求1或2的方法，其中R3可以是C1-C5的直链烷烃。
4.按照权利要求1的方法，其中脂肪酶可以是动物、微生物等各种来源的脂肪酶。
5.按照权利要求1或4的方法，所用的酶可以是游离酶也可以是固定化酶。
6.按照权利要求1或4的方法，其中所使用的游离脂肪酶与底物的质量比可以是1∶20-1∶1、固定化脂肪酶与底物的质量比可以是3∶1-9∶1。
7.按照权利要求1的方法，其中恒温温度可选择范围为20-45℃。
8.按照权利要求1的方法，其中酶催化反应时间为4-96小时。
9.按照权利要求1的方法，使用的缓冲液可以是pH7.0-8.5范围的任何类型缓冲溶液。
10.一种测定N取代α氨基酸转化率和对映体过量值的方法(a)转化率的检测通过高效毛细管电泳，以三乙胺/乙酸缓冲液作为背景电解质溶液，反向电场强度340V/cm，电泳温度20℃，样品浓度50mg/L，紫外检测器200nm；(b)对映体过量值检测通过高效毛细管电泳，以三乙胺/乙酸缓冲液作为背景电解质溶液，采用环糊精作为手性选择剂，不需要处理毛细管柱，反向电场强度340V/cm，电泳温度20℃，样品浓度50mg/L，紫外检测器200nm，就可以使N取代α氨基酸对映体得到较好分离。
全文摘要
本发明涉及一种N取代α氨基酸外消旋异构体的酶催化拆分方法。包括如下步骤使N－取代α氨基酸酯在缓冲液中和脂肪酶反应，反应混合物用乙醚萃取，水层酸化，乙醚萃取，乙醚层干燥，旋转蒸发，得到一种构型N取代α氨基酸；未反应的另一种构型N取代α氨基酸酯通过酶的第二次拆分可得到另一种构型N－取代α氨基酸。该方法条件温和，基本没有副产物；操作简单，拆分反应效率高，得到的目标化合物具有高化学纯度和光学纯度。本发明还提供一种测定N取代α氨基酸转化率和对映体过量值的方法。
文档编号C12P41/00GK1632129SQ20041001123
公开日2005年6月29日 申请日期2004年11月19日 优先权日2004年11月19日
发明者曹淑桂, 郑良玉, 张锁秦, 高贵, 赵丽芳, 杨雪莹 申请人:吉林大学