专利名称：酶制备富集对映体的β－氨基酸的方法
技术领域：
本发明涉及制备富集对映体的β-氨基酸的方法。
作为β-氨基羧酸的制备方法，已经建立了借助非对映异构盐的常规外消旋体拆分方法(建议路线为H.Boesch et al.，Org.Proc.Res.Developm.2001，5，23-27)，特别是借助苯乙基酰胺锂非对映体选择性加成的拆分方法(A.F.Abdel-Mafid，J.H.Cohen，C.A.Maryanoff，Curr.Med.Chem.1999，6，955-970)。尽管会带来许多不利，但是后者方法已经被深入细致地研究并且优选使用。一方面，需要化学计量量的手性试剂，与催化不对称方法相比这是主要的缺点。此外，需要昂贵且危险的辅助物质如正丁基锂来通过去质子化而活化化学计量试剂。另外，在约-70℃的低温进行反应对于得到满意的立体选择性是重要的，这意味着对相关反应器材料有高的要求，也就有附加的成本和高的能量消耗。
尽管由生物催化来制备光学活性的β-氨基羧酸在目前仅处于次要的地位，但特别是生物催化反应的经济和生态学优点，它是特别希望的。不需要使用化学计量量的手性试剂，只需要使用很少的催化量的酶，酶是对自然和环境友好的催化剂。此外，与大量合成的含金属催化剂相比，除了它们的催化特性和高活性外，这些在水介质中高效使用的生物催化剂具有不需要使用含金属、尤其是含重金属并因此是有毒原料的优点。
例如，在现有技术中，β-氨基羧酸的对映体选择性N-酰化已经被经常报道。
因此，L.T.Kanerva等在TetrahedronAsymmetry，Vol.7，No.6，p.1707-1716，1996中描述了不同环脂族β-氨基羧酸乙酯在有机溶剂中使用2，2，2-三氟乙酯并用来自Candida antarctica的脂肪酶SP 526或者来自Pseudomonas cepacia的脂肪酶PS作为生物催化剂的对映体选择性N-酰化。
V.M.Sanchez等研究了使用来自Candida antarctica的脂肪酶经由N-酰化β-氨基羧酸酯制备的生物催化(±)-乙基-3-氨基丁酸酯外消旋体的拆分(TetrahedronAsymmetry，Vol.8，No.1，p.37-40)。
EP-A-8 890 649公开了在水解酶存在下通过羧酸酯的对映体选择性酰化从外消旋氨基酸酯中制备光学活性氨基酸酯且接着分离未反应氨基酸酯对映体的方法，其中水解酶选自酰胺酶、蛋白酶、酯酶和脂肪酶。
WO-A-98/50575涉及在立体选择性地酰化外消旋β-氨基羧酸的条件下，使酰基给体的外消旋β-氨基羧酸与青霉素G酰基转移酶在一定条件下接触，从而获得手性β-氨基羧酸及其相应酯的方法，而其它的对映体基本上未反应，因此获得手性的β-氨基羧酸。也已经研究了相反的反应顺序(V.A.Soloshonok，V.K.Svedas，V.P.Kukhar，A.G.Kirilenko，A.V.Rybakova，V.A.Solodenko，N.A.Fokina，O.V.Kogut，I.Y.Galaev，E.V.Kozlova，I.P.Shishkina，S.V.Galushko，Synlett 1993，339-341；V.Soloshonok，A.G.Kirilenko，N.A.Fokina，I.P.Shishkina，S.V.Galushko，V.P.Kukhar，V.K.Svedas，E.V.Kozlova，TetrahedronAsymmetry，1994，5，1119-1126；V.Soloshonok，N.A.Fokina，A.V.Rybakova，I.P.Shishkina，S.V.Galushko，A.E.Sochorinsky，V.P.Kukhar，M.V.Savchenko，V.K.Svedas，TetrahedronAsymmetry，1995，6，1601-1610；G.Cardillo，A.Tolomelli，C.Tomasini，Eur.J.Org.Chem.1999，155-161)。该方法的缺点是产物混合物很难进行随后的对映体选择性水解。分离游离β-氨基羧酸后，获得很难分离的苯乙酸与N-苯乙酰基-β-氨基羧酸的混合物。
为了得到富集对映体的羧酸，很久前就已知将它们与脂肪酶反应。在US 5518903中，该原理已经被转化为N-保护的β-氨基酸酯，但是却有不同的成功程度。当只有外消旋N-丁氧基羰基-β-氨基丁酸的相应苄基酯可以通过脂肪酶以高度对映体选择性方式拆分时，残留的所用甲基酯和正丁基酯仅实现ee值在70％附近。需要注意的是从相应甲基酯到正丁基酯的转变明显伴随着所制备酸ee值的降低。例如，用得自Asahi的脂肪酶从N-Boc-β-氨基丁酸起始的酯水解在8天后以37％的产率给出相应酸的ee值为45％ee。使用得自Amano的脂肪酶PS时，相同反应在7天内以41％的产率可以获得富集到61％ee的化合物。相比而言，相应的甲基酯为70％ee。
最近Faulconbridge等报道的结果表明用Amano的脂肪酶PS在pH 8时发生芳香β-氨基酸乙酯的酯水解，具有可接受的产率和非常好的对映体过量(Tetrahedron Letters 2000，41，2679-81)。获得产物的对映体纯度高达99％，但是该合成仅仅在悬浮液中进行，有一些缺点。一方面，已经发现尽管在这些条件下结晶是选择性的，但是如比较例2中所述，反应本身导致了85.1％ee的较低的ee值。总之，这意味着一方面由于形成不希望的对映体而造成产率的损失，另一方面由于改变的结晶条件，与轻微的方法变化有关，在工业规模中ee值还可能容易地降到99％ee以下，或者甚至降到98％ee以下。但是，药物应用需要尽可能高的ee值＞98％ee，尤其是＞99％ee。另外例如，为了能确保良好的酶超滤分离，在纯液体介质中进行反应和在悬浮液中进行反应都是希望的。最优地，在这种步骤下产生高的ee值，这并不能由现有的文献方法所实现(关于这一点也参见比较例1和2)。
Nagata等报道了使用有机溶剂在单相反应介质中的酶水解(S.Katayama，N.Ae，R.Nagata，TetrahedronAsymmetry，1998，9，4295-4299)。在此情况下，使用环状β-氨基酸酯。使用由丙酮(90％)和水(10％)组成的混合溶剂在20小时的反应时间后实现了94％ee的对映体选择性和50％转化率的最好结果。使用较低比例的水得到较差的结果。通常，与少量水混溶的溶剂相比，使用容易溶于水的溶剂是更优越的。因此使用由水和20％丙酮饱和的二异丙醚作为有机介质仅得到58％ee的ee值。相比而言，除了含THF的丙酮外，更容易溶于水的溶剂证明是适合的(95％ee)，但是，在这种情况下，为了实现任何程度地完全转化都需要长的反应时间(96小时)。
但是迄今为止，这种具有存在有机溶剂特征的成功合成还仅限于制备环状β-氨基酸酯。在环状β-氨基酸酯文献的具体最优条件下(见上述)，希望的开链侧基目标化合物的制备都得到非常低的产率和不可接受的长反应时间(比较例1)。
从现有技术中并没有更详细地提及、但是可以很明显地看出的这种或其它的目标，可以根据本发明的要点通过具有权利要求1特征的方法而实现。从属权利要求2到8涉及本发明优选的实施方案。
制备富集对映体的N-未保护的、特别是开链的β-氨基酸的方法可以通过在由水和有机溶剂组成的两相系统中，用水解酶酶水解N-未保护的、特别是开链的β-氨基酸酯的对映体混合物来实现，结果本发明的设定目标可以以非常令人惊奇，但是另一方面又没有不利因素的方式实现。就此而言，本发明不仅可以令人惊奇地达成比迄今已知的有机/水相系统中基本上更高的反应性，而且可以得到更好的对映体选择性。两相系统中的反应甚至可以被最优化至产生≥99％ee的产物(实施例4)。此外，令人感兴趣的是与在纯的水相系统中实验(比较例2，81.5％ee)相比，本发明实施例3的ee值(89％ee)是明显更好的。因此，与水相标准介质相比，本发明方法除了具有有机溶剂的处理优点外，另外还具有在产物中产生更高对映体选择性的优点。
原则上，本领域技术人员随意选择适当的酯基团。他将基于经济和反应工程学方面进行他的选择。用于形成酯的有利的醇特别是那些容易从反应混合物中任选通过蒸馏除去的醇。本发明方法中特别优选使用β-氨基酸烷基酯或者β-氨基酸芳基酯。极其优选使用适当的正丙酯、异丙酯、正丁酯、仲丁酯、异丁酯或叔丁酯。
反应参数的选择同样是本领域技术人员可以胜任的。他将基于常规实验对每种情况分别确定这些参数。在所有情况下，对于本发明主题的酶方法而言，pH范围从4到10，优选从6到9，而且最优选从7到8.5是适当的。已经证明Amano供应的脂肪酶PS在约pH8时是特别适合的。
关于温度，原则上要求与pH值相同。在此再次根据酶工作的最佳温度，可以对每种情况确定其尽可能最优的温度。对于来自喜温有机体的酶，温度可能高达100℃。其它的酶仅在＜0℃到-15℃下最优工作，可能在冰基质中工作。反应期间设定的温度应该优选在15到40℃的范围内，更优选20到30℃。
本领域技术人员负责选择所用的酶。许多适当的酶可以从Organic Synthesis，Ed.K.Drauz，H.Waldmann，VCH，1995，p.165及其引用的文献中的酶催化剂中选择。对于酯的水解，优选使用脂肪酶，更优选使用Amano供给的来自Pseudomonas cepacia的脂肪酶PS。
为了应用，所考虑的多肽可以以游离态形式作为均匀纯化的化合物或者作为由重组方法制备的酶来使用。另外，多肽还可以作为完整客体有机体的组分使用，或者与按要求纯化的主体有机体可消化的细胞材料结合使用。
还可以使用固定形式的酶(Sharma B.P.；Bailey L.F.and MessingR.A.(1982)，Immobilisierte Biomaterialien-Techniken undAngwendungen，Angew.Chem.94，836-852)。有利地，固定可以通过冷冻干燥进行(Paradkar，V.M.；Dordick，J.S.(1994)，Aqueous-LikeActivity of α-Chymotrypsin Dissolved in Nearly Anhtdrous OrganicSolvent，J.Am.Chem.Soc.116，5009-5010；Mori，T.；Okahata，Y.(1997)，A variety of lipi-coated glycoside hydrolases as effective glycosyltransfer catalysts in homogenous organic solvents，Tetrahedron Lett.38，1971-1974；Otamiri，M.；Adlercreutz，P.；Matthiasson，B.(1992)，Complex formation between chymotrypsin and ethyl cellulose as a meansto solubilize the enzyme in active form in toluene，Biocatalysis 6，291-305)。非常特别优选的是在表面活性剂存在下的冷冻干燥，表面活性剂例如Aerosol OT、或聚乙烯吡咯烷酮、或聚乙二醇(PEG)、或Brij 52(二乙二醇单十六烷基酯)(Kamiya，N.；Okazaki，S.-Y.；Goto，M.(1997)，Surfactant-horseradish peroxidase complex catalytically active inanhydrous benzene，Biotechnol.Tech.11，375-378)。
极其优选在Eupergit上，尤其是在Eupergit C和Eupergit250L(Roehm)上固定(概略地参见E.Katchalski-Katzir，D.M.Kraemer，J.Mol.Catal.BEnzym.2000，10，157)。同样优选在Ni-NTA上通过与His标记(六组氨酸)附着改性的多肽结合来固定(Petty，K.J.(1996)，Metal-chelate affinity chromatography inAusubel，F.M.et al.，eds.Current Protocols in Molecular Biology，Vol.2，New York；JohnWiley and Sons)。
同样还可以作为CLECs来使用(St.Clair，N.；Wang，Y.-F.；Margolin，A.L.(2000)，Cofactor-bound cross-linked enzyme crystals(CLEC)ofalcohol dehydrogenase，Angew.Chem.Int.Ed.39，380-383)。
通过这些措施，还可能从由于有机溶剂而变得不稳定的多肽中产生能够在含水和有机溶剂混合物中或者在全部有机介质中工作的多肽。
本发明主题反应可以在为此提供的任何容器中进行。这些反应容器详细而言为常规间歇式反应器、环管反应器或酶-膜反应器(Bommarius，A.S.；Drauz，K.；Groeger，U.；Wandrey，C.；MembraneBioreactors for the Production of Enantiomerically Pure a-AminoAcids，inChirality in Industry(eds.；Collins，A.N.；Sheldrake，G.N.；Crosby，J.)1992，John Wiley and Sons，p.371-397)。
适当的作为可以在既定的反应条件下与水形成两相、也就是说因此是不溶的或者水溶性不好的而且可以在本发明方法中使用的有机相是所有种类的不溶或水溶性不好的有机溶剂及其混合物。特别地，这些溶剂是醚、酮、酯、饱和或未饱和的直链或支链烃。
就此而言，甲基叔丁基醚(MTBE)、二异丙醚、乙酸乙酯、己烷、庚烷、环己烷、甲基环己烷和甲苯、以及它们的任何适当希望的混合物都被证明是特别适合的。
如果使用以吸附形态存在、任选地吸附在水不溶性载体材料和/或少量组分或稳定剂上的酶时，已经证明假定酶和载体的分离是容易的，那么有利地是在反应中使用酶之前，分离不可溶载体和/或少量组分或稳定剂，以便不发生由所用酶的不溶性载体材料所产生的产物污染。例如，可有利地使用的由Amano提供的脂肪酶PS被吸附到二氧化硅载体上。在这种情况下，为了从反应系统中除去硅酸，在向反应介质中加入反应物前，应该过滤酶的水溶液。作为一个原则，酶的活性或者方法的稳定性不负面影响此程序。
在本发明的范围内，“N-未保护”被理解成指酸的β-氮原子没有被反应条件下稳定的N-保护基团所保护。这些保护基团尤其被认为是通常的保护基团，例如Z、Boc、Fmoc、Eoc、Moc、乙酰基等。
(C1-C8)-烷基被认为是甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基、庚基或辛基，以及所有的成键异构体。这些基团可以被(C1-C8)-烷氧基、(C1-C8)-卤烷基、OH、卤素、NH2、NO2、SH或者S-(C1-C8)-烷基单取代或多取代。
(C2-C8)-烯基被理解成是除甲基外，至少含有一个双键的如上所述的(C1-C8)-烷基基团。
(C2-C8)-炔基被理解成是除甲基外，至少含有一个三键的如上所述的(C1-C8)-烷基。
(C1-C8)-酰基被理解成是经由-C＝O-官能团与分子结合的(C1-C8)-烷基。
(C3-C8)-环烷基被理解成是环丙基、环丁基、环戊基、环己基、或环庚基等。它们可以被一个或多个卤素原子和/或含N、O、P、S原子的基团所取代、和/或具有含有N、O、P、S原子的环基团，例如1-，2-，3-，4-哌啶基、1-，2-，3-吡咯烷基、2-，3-四氢呋喃基、2-，3-，4-吗啉基。此类基团可以被(C1-C8)-烷氧基、(C1-C8)-卤烷基、OH、卤素、NH2、NO2、SH、S-(C1-C8)-烷基、(C1-C8)-酰基、(C1-C8)-烷基单取代或多取代。
(C6-C18)-芳基被理解成是含有6到18个碳原子的芳基基团。特别地，它们包括苯基、萘基、蒽基、菲基、联苯基。此类基团可以被(C1-C8)-烷氧基、(C1-C8)-卤烷基、OH、卤素、NH2、NO2、SH、S-(C1-C8)-烷基、(C1-C8)-酰基、(C1-C8)-烷基单取代或多取代。
(C7-C19)-芳烷基是经由(C1-C8)-烷基与分子结合的(C6-C18)-芳基。
(C1-C8)-烷氧基是经由氧原子与所述分子键合的(C1-C8)-烷基。
(C1-C8)-烷氧羰基是经由-OC(O)-官能团与所述分子结合的(C1-C8)-烷基。相同地描述类似地应用于其它的氧羰基。
(C1-C8)-卤烷基是由一个或多个卤素原子取代的(C1-C8)-烷基。
在本发明的范围内，(C3-C18)-杂芳基表示具有3到18个碳原子并且在环上含有诸如氮、氧、或硫杂原子的五、六或七员芳环系统。这些杂芳香化合物被特别认为是如下基团1-，2-，3-呋喃基、1-，2-，3-吡咯基、1-，2-，3-噻吩基、2-，3-，4-吡啶基、2-，3-，4-，5-，6-，7-吲哚基、3-，4-，5-吡唑基、2-，4-，5-咪唑基、吖啶基、喹啉基、菲啶基、2-，4-，5-，6-嘧啶基。此类基团可以被(C1-C8)-烷氧基、(C1-C8)-卤烷基、OH、卤素、NH2、NO2、SH、S-(C1-C8)-烷基、(C1-C8)-酰基、(C1-C8)-烷基单取代或多取代。
(C4-C19)-杂芳烷基被理解成是相应于(C7-C19)-芳烷基的杂芳香系统。
适当的卤素是氟、氯、溴和碘。
在本发明的范围内，术语富集对映体被理解成指与其光学对映体混合的对映体的比例在＞50％到＜100％的范围内。
所示结构涉及所有可能的非对映体和对映体以及它们可能的混合物。
引用的参考文献被认为是包括在本发明的公开事实内。
权利要求
1.通过用水解酶来酶水解N-未保护的、特别是开链的β-氨基酸酯的对映体混合物制备富集对映体的N-未保护的、特别是开链的β-氨基酸的方法，其中水解在由水和给定反应条件下与水形成两相的有机溶剂组成的两相系统中发生。
2.如权利要求1的方法，其特征在于使用β-氨基酸烷基酯或者β-氨基酸芳基酯。
3.如权利要求2的方法，其特征在于使用相应的正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、或叔丁基酯。
4.如前述权利要求之一的方法，其特征在于反应的pH值为4-10，优选6-9，并且最优选7-8.5。
5.如前述权利要求之一的方法，其特征在于反应中的温度为-15-+100℃，优选为+15-+40℃，并且最优选为+20-+30℃。
6.如前述权利要求之一的方法，其特征在于使用脂肪酶，优选使用来自Pseudomonas cepacia的脂肪酶PS。
7.如前述权利要求之一的方法，其特征在于反应在酶-膜反应器中实施。
8.如前述权利要求之一的方法，其特征在于使用醚、酮、酯、饱和的或未饱和的直链或支链烃作为有机溶剂。
全文摘要
本发明涉及在由水和给定反应条件下能与水形成两相的有机溶剂组成的两相系统中，通过N－未保护的β－氨基酸酯的酶酯拆分来制备富集对映体的β－氨基酸的方法。
文档编号C12P13/00GK1456676SQ03123428
公开日2003年11月19日 申请日期2003年5月7日 优先权日2002年5月8日
发明者哈拉尔德·格勒格尔, 黑尔格·维尔纳 申请人:德古萨股份公司