温度稳定型β-吡喃糖苷酶的制作方法
【专利摘要】本发明涉及具有β-吡喃糖苷酶活性的温度稳定型多肽，其底物包括β-吡喃葡萄糖苷和β-吡喃木糖苷。这些多肽可以单独地或者作为融合蛋白例如在酵母或细菌中进行表达，并随后进行纯化。在本发明范围内的多肽可以单独地或者与其他用于分解植物原料的酶相混合地进行使用，尤其是用于含木质素纤维素的生物质，特别是半纤维素和其成分木聚糖的酶促分解。所述酶适合于在纺织品加工中使用，用作洗涤剂的添加物或者在食品和饲料工业中使用。
【专利说明】温度稳定型β-吡喃糖苷酶
[0001]描述
[0002]背景
[0003]鉴于日益下降的化石燃料储备和日益上升的CO2排放，利用来自植物生物质的再生原料作为备选能源变得越来越重要。由于工业化国家和新工业化国家的连续且飞速增长的能源需求，除了更有效地利用化石产能量物质外，还必须找到等价的备选物作为能源(Lyko 等人，2009，J.Biotechnol.142(1):78-86)。
[0004]因此，生物精炼的概念移入到研究的焦点之中，其中植物生物质不仅作为能量提供者而且也作为原料提供者来进行利用。生物精炼的目标是充分利用再生原料以制备化学药品、动力燃料和能量。来自含木质素纤维素的原始材料和残留材料的干生物质例如秸杆和木头用作木质素纤维素-生物精炼的起始材料。
[0005]一个特别的兴趣涉及利用源自农业和林业残留物例如秸杆和木头的含木质素纤维素的原料，因为这些是成本低的并且不与食品工业和饲料工业竞争(Lyko等人，2009，J.Biotechnol.142 (I): 78-86 ;Kumar 等人，2008，J.1nd.Microbiol.Biotechnol.35 (5):377-391 ；Peters,2007,Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.105:1-30 ；Kamm 等人，2006, Biochem.Mol.Biol.1nt.44(2): 283-292)。木质素纤维素是地球上在数量上最经常出现的生物聚合物，并且由纤维素、半纤维素和木质素组成。纤维素的份额为大约30-60%，半纤维素的份额为大约20-40%，和木质素的份额处于大约10-30%。与由不分支的葡萄糖单元组成的纤维素不同，半纤维素由可以具有额外的碳水化合物分支的戊糖和己糖组成。与此相反，木 质素是酹分子的聚合物(Peters, 2007, Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.105:1-30)。
[0006]木质素纤维素在生物精炼中的应用需要将原料转化为可利用的糖。为此，通过机械的、热的和/或化学的方法对木质素纤维素进行预处理，以使纤维素和半纤维素更好地供随后的酶促水解使用(Hendriks 和 Zeeman, 2009, Bioresour.Technol.100 (I): 10-18)。在酶促水解的情况下，纤维素分解酶和木聚糖分解酶尤其发挥着决定性的作用。这些属于糖苷水解酶的酶能够裂解纤维素和半纤维素中的糖苷键。
[0007]除了使用来自嗜温微生物的纤维素分解酶和木聚糖分解酶外，热稳定型酶的利用引起逐渐增长的关注，因为它们适合于在高温下进行的过程，其中底物的溶解度和因此可接近性得到提高(Turner等人，2007, Microb.Cell.Fact.6:9)。此外，热稳定型酶由于增加的底物特异性以及针对溶剂和洗涤剂的稳定性而出众(Viikari等人，2007, Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.108:121-145 ；Antranikian G.(2008)Industrial relevanceof thermophiles and their enzymes-ThermophiIes-Biology and Technology at hightemperatures, Robb Fea 编辑(CRC Press, Taylor&Francis, Boca Raton),第 113-160 页)。
[0008]木聚糖
[0009]木聚糖(自然界中第二最常见的多糖)是半纤维素的主要成分。它被安排在纤维素与木质素之间的原纤维内，并且在微原纤维的粘结中承担重要的作用。木聚糖由β-1，4-连接的吡喃木糖单元的均聚物骨架组成。这要么是线性的和未取代的，要么此外也可以是经乙酰化的或用阿拉伯糖基基团和吡喃葡糖醛酸基基团取代的。因此，区分为同聚木聚糖、阿拉伯木聚糖、葡糖醒酸木聚糖和葡糖醒酸阿拉伯木聚糖(Saha, 2003, J.1nd.Microbiol.Biotechnol.30(5):279-291 ；Bergquist 等人，2001，Methods Enzymol330:301-319 ；Kulkarni 等人,1999, FEMS Microbiol.Rev.23 (4): 411-456)。在大多数情况下，木聚糖作为复杂的、高度支化的杂聚物存在(Collins等人，2002)。
[0010]将木聚糖完全水解成单糖需要许多种酶，其共同参与分解(Collins等人，2005，FEMS Microbiol.Rev.29 (1):3-23 ；Bergquist 等人，2001，MethodsEnzymol330:301-319)o内切木聚糖酶裂解木聚糖骨架内的糖苷键，并由此主要形成更短的低聚木糖，但也形成木糖、木二糖和木三糖(Polizeli等人，2005，Appl.Microbiol.Biotechnol.67 (5):577-591 ；Dwivedi 等人，1996，Appl.Microbiol.Biotechnol.45(1-2):86_93)。β -木糖苷酶从低聚木糖和木二糖的非还原端裂解出木糖单体，而木聚糖通常不被作为底物利用(Collins等人，2005，FEMS Microbiol.Rev.29 (I): 3-23 ；Polizeli 等人，2005，Appl.Microbiol.Biotechnol.67 (5): 577-591 )。其他酶，例如α-阿拉伯呋喃糖苷酶、α -葡糖醛酸糖苷酶和乙酰木聚糖酯酶，参与杂木聚糖的侧基的释放。α-阿拉伯呋喃糖苷酶从支化的阿拉伯木聚糖和阿拉伯聚糖上裂解出阿拉伯糖，而α-葡糖醛酸糖苷酶水解在吡喃木糖基骨架和葡糖醛酸之间的α-1，2-键。乙酰化的木聚糖由乙酰木聚糖酯酶来进行水解，该酶裂解下木聚糖的乙酰基基团(Jaeger等人,2006, Biokatalyse.Angewandte Mikrobiologie, Antranikian G.编辑，SpringerVerlag,第135-160页)。不仅在真菌和细菌中，而且也在古细菌中鉴定出了木聚糖分解酶。
[0011]糖苷水解酶
[0012]糖苷水解酶是水解在碳水化合物之间或者在碳水化合物和不含碳水化合物的残基之间的糖苷键的酶。它们裂解许多以α-和β_糖苷形式连接的底物，并且在其底物特异性方面是不同的。基于氨基酸序列的相似性或者说氨基酸序列的同一性百分t匕，将糖苷水解酶分类为所谓的糖苷水解酶家族(GH家族)，在此，除了相似的氨基酸序列外，家族成员显示出相似的三维结构和相同的反应机制(Henrissat, 1991，Biochem.J.280 (Pt2):309-316)。
[0013]GH家族的列表可以在互联网上从CAZy数据库(“Carbohydrate-ActiveenZymes”)中获知(Cantarel等人，2009)。根据其反应机制，将糖苷水解酶划分为两类:
(I)在异头碳原子的构型发生翻转的情况下裂解糖苷键的酶，和(2)在保持异头构型的情况下水解糖苷键的酶(Davies 和 Henrissat, 1995, Structure3 (9): 853-859 ；McCarter 和Withers, 1994, Curr.0pin.Struct Biol4(6):885-892)。在大多数糖苷水解酶中，天冬氨酸残基和/或谷氨酸残基被鉴定为催化氨基酸，然而，其他氨基酸残基也可能参与糖苷键的裂解(Davies 和 Henrissat, 1995, Structure3 (9): 853-859)。
[0014]糖苷水解酶由催化结构域构成，并且可以包含额外的碳水化合物结合结构域。后者通过柔韧的连接体与催化结构域相连接，并且使得酶能够与底物结合(Shoseyov等人，2006 ；Boraston 等人，2004，Biochem.J.382 (Pt3): 769-781)。糖苷水解酶的命名法由Henrissat 等人(1998，FEBS Lett.425(2):352-354)作了统一。
[0015]因此，通过以三个字母的形式指明底物来得到酶和编码其的基因的名称。在关于底物的名称后面跟着的是该酶所属于的GH家族的编号，和指明次序(以该次序鉴定出这些酶)的字母。为了区分来自不同生物的相似的酶，把关于物种的缩写写在前面。
[0016]来自嗜热细菌的内切木聚糖酶
[0017]已知一系列来自嗜热细菌的内切木聚糖酶，它们根据Henrissat等人(1998，FEBSLett.425(2): 352-354)，按照氨基酸序列的相似性，被归类入糖苷水解酶家族10、11和43。热解纤维素菌属(Caldicellulosiruptor)的细菌产生在65_70°C的温度和ρΗ5.5-6.5下具有最大活性的的内切木聚糖酶。许多内切木聚糖酶也由梭菌属(Clostridium)这样的厌氧细菌形成。
[0018]除了内切木聚糖酶活性外,来自热纤维梭菌(C.thermocellum)的酶XynC和XynX还显示出内切葡聚糖酶的活性(Jung 等人,1998, Biochem.Mol.Biol.1nt.44 (2): 283-292 ；Hayashi 等人，1997，J.Bacteriol.179(3):4246-4253)。从内切木聚糖酶 XynC 和 XynY知晓，它们位于多纤维素酶体中(Hayashi等人，1997，J.Bacteriol.179(13):4246-4253 ；Fontes 等人，1995，Biochem.J.307 (Ptl): 151-158)。
[0019]热稳定型内切木聚糖酶由海栖热袍菌(Thermotoga maritima)和那不勒斯栖热袍菌(T.neapolitana)产生。这些显示出在85-105 °C下的最大活性，以及在90 °C下直至22小时或在95 °C下12小时的半衰期(Zverlov等人，1996Appl.Microbiol.Biotechnol.45(1-2):245-247 ；Saul 等人，1995，Appl.Environ.Microbiol.61 (11):4110-4113 ；ffinterhalter 和 Liebl，1995,Appl.Environ.Microbiol.61 (5): 1810-1815)。其他内切木聚糖酶由来自地芽孢杆菌属(Geobacillus)、红嗜热盐菌属(Rhodothermus)、热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacterium)和高温双岐菌属(Thermobifida)的嗜热细菌形成。
[0020]来自嗜热细菌的β -木糖苷酶
[0021]迄今已知的β_木糖苷酶由热解纤维素菌属、梭菌属、地芽孢杆菌属、热厌氧菌属(Thermoanaerobacter)和热厌氧`杆菌属的嗜热细菌形成。根据Henrissat等人(1998，FEBSLett.425(2): 352-354)，基于氨基酸序列的相似性将它们分类为糖苷水解酶家族3、39、43和52。除了 β -木糖苷酶外，厌氧细菌粪堆梭菌(Clostridium stercorarium)还产生内切木聚糖酶和α -阿拉伯呋喃糖苷酶，并因此能够将阿拉伯木聚糖完全分解为木糖和阿拉伯聚糖(Adelsberger 等人,2004, Microbiologyl50 (Pt7): 2257-2266)。
[0022]编码来自嗜热脂肪地芽孢杆菌(G.stearothermophiIus)的β -木糖苷酶XynBl的基因是编码其他参与木聚糖分解的酶的基因簇的一部分。因此，除了β-木糖苷酶XynBl的基因外，该基因簇还包含木聚糖酶和α-葡糖醛酸糖苷酶的基因(Shulami 等人，1999, J.Bacteriol.181(12): 3695-3704)。编码来自布氏热厌氧菌(Thermoanaerobacter brockii )和热厌氧杆菌属物种JW/SL YS485的β -木糖苷酶的基因也位于紧挨着编码葡萄糖苷酶或乙酰木聚糖酯酶的基因(Breves等人，1997，Appl, Environ.Microbiol.63(10):3902-3910 ;Lorenz 和 Wiegel, 1997，J.Bacteriol.179(17):5436-5441)。
[0023]纤维素分解酶和木聚糖分解酶的工业应用
[0024]纤维素分解酶和木聚糖分解酶的使用在工业中是广为流行的。因此，它们可用于食品生产和饲料生产中，但在造纸工业和纸浆工业中以及在纺织工业中也使用纤维素酶和木聚糖酶。在此，它们的应用用于提高产率和改善质量。此外，作为传统处理方法的对环境无害的备选方案来使用这些酶。
[0025]在食品工业中，纤维素分解酶和木聚糖分解酶被用于制备果汁、葡萄酒和啤酒，以及在油(优选地橄榄油、菜籽油和向日葵籽油)的提取中和在焙制食品工业中使用。在制备果汁的情况下，将纤维素酶和半纤维素酶与果胶酶一起用于汁液产率的提高和果汁的澄清。通过用所述酶处理果肉，增加了汁液形成，并同时缩短了加工时间。通过随后的借助于所述酶来进行的汁液的澄清，使粘度下降并因此改善了过滤性。但在制备油(优选地橄榄油、菜籽油和向日葵籽油)的情况下，也将纤维素酶和半纤维素酶与果胶酶一起用于提高提取。同样地，这些酶也可用在葡萄酒的制备中，其中除了澄清外，它们还有助于在水果中存在的色素的提取和酒香的改善。
[0026]此外，在酿酒厂中使用纤维素酶来水解大麦葡聚糖，以便增加啤酒的过滤性。在焙制食品工业中也使用木聚糖酶。在那里它们作为面粉添加剂而有助于生面团的更好的可加工性，并且导致经改善的焙制食品质量(Beg等人，2001，Appl.Microbiol.Biotechnol.56(3-4):326-338 ；Bhat,2000, Biotechnol.Adv.18(5):355-383 ；Galante 等人,1998,Enzymes, biological control and commercial applications, Harman GE 和Kubicek CP 编辑，Verlag Taylor&Francis, London,第 2 卷，第 327-342 页；Bhat 和Bhat, 1997, Biotechnol.Adv.15(3-4):583-620)。
[0027]纤维素酶和木聚糖酶还可用在饲料工业中。在此，这些酶通过分解植物性饲料中的纤维素和半纤维素而有助于营养价值的提高和更好的饲料可消化性(Bhat和Bhat, 1997, Biotechnol.Adv.15(3-4):583-620)。
[0028]在造纸工业和纸浆工业中，使用纤维素酶和木聚糖酶来使木纤维结构改性，以便使得能够达到纸浆的更好的再加工。但是在纸张漂白中木聚糖酶的使用也是广为流行的。在此，用内切木聚糖酶处理纸浆导致木质素的释放，由此木纤维的细胞壁对于漂白剂而言更易接近并因此可以明显地减少漂白剂的使用(Bhat, 2000, Biotechnol.Adv.18(5):355-383 ；Buchert 等人,1998, Trichoderma&Gliocladium-Enzymes, biological control and commercial applications, Harman GE 和 Kubicek CP 编辑，VerlagTaylor&Francis, London,第 2 卷，第 343-363 页)。
[0029]本发明的公开内容
[0030]定义
[0031]术语“糖苷水解酶”是指这样的具有酶促活性的蛋白质，其能够水解在碳水化合物之间或者在碳水化合物和不含碳水化合物的残基之间的糖苷键。
[0032]术语“ β -吡喃糖苷酶”是指这样的具有β -糖苷酶(E.C.3.2.1.-)的活性的糖苷水解酶，其能够催化吡喃糖上的β-糖苷键的水解。
[0033]术语“ β -吡喃葡萄糖苷酶”和“ β -葡萄糖苷酶”是指这样的糖苷水解酶，其能够催化葡萄糖上的β -糖苷键的水解，同时产生低分子的葡萄糖寡聚体或葡萄糖单体。
[0034]术语“ β -吡喃木糖苷酶”和“ β -木糖苷酶”是指这样的糖苷水解酶，其能够催化木糖上的β -糖苷键的水解，同时产生低分子的木糖寡聚体或木糖单体。
[0035]“多肽”是由相互通过肽键连接的氨基酸组件构成的寡聚体或多聚体。
[0036]术语“单体或寡聚体组件”包括所有可以通过酶促活性而从多聚体上解下的单体或寡聚体组件。术语“寡聚体”包括所有由至少两个组件构成的化合物。[0037]“家族3糖苷水解酶”或“家族3的糖苷水解酶”是指根据Henrissat等人(1998，FEBS Lett.425 (2): 352-354)被归入家族3的具有糖苷水解酶活性的多肽。
[0038]糖苷水解酶3的“结构域I”是指这样的结构域，其与包含SEQ ID N0.4 (大麦β -D-葡聚糖外切水解酶同工酶Exo I, Genbank参考号AF102868.1,发表于=Varghese等人，1999，Structure,第7卷，第2期，第179-190页)的氨基酸残基I至357的序列区段具有至少50%，优选地至少70%，和更优选地至少90%的氨基酸序列同一性。
[0039]糖苷水解酶3的“结构域2”是指这样的结构域，其与包含SEQ ID N0.4 (大麦β-D-葡聚糖外切水解酶同工酶Exo I, Varghese等人，1999，Structure,第7卷，第2期，第179-190页)的氨基酸残基374至559的序列区段具有至少50%，优选地至少70%，和更优选地至少90%的氨基酸序列同一性。
[0040]关于氨基酸序列或核苷酸序列的术语“％同一性”是指这样的百分数，其当应用下述方法时而得到确定:用AlignX来进行两个氨基酸序列的相互比对或两个核酸序列的相互比对。AlignX是独立的应用程序，其由Invitrogen与Vector NTIAdvancel0.3.0 一起进行销售。用于进行比对的算法为ClustalW算法(Nucleic AcidResearch, 22(22):4673-4680, 1994)。在此，作为参数，对于缺口开放罚分(gap openingpenalty),使用值15/10,和对于缺口延伸罚分(gap extension penalty),使用值
6.66/0.1。
[0041]“相似的序列”通过一定的最小的相互间同一性百分比来表征，该同一性百分比由数值来表示，例如至少30%，至少50%，至少70%或至少90% ;并且是指这样的序列或序列区段，其共同进化起源可以通过其他标 准(例如结构比较)来进行检测。
[0042]术语“突变”包括各类型的核苷酸序列修饰或氨基酸序列修饰，包括缺失、插入、点突变、倒位或其组合。
[0043]“ ρΝΡ ”表示对硝基苯基。
[0044]“热稳定性”或“温度稳定性”是指这样的酶的特性，其可以通过下述方式来确定:将酶制备物分成两个级分，使其中一个级分经历确定的温度，并随后在该确定的温度下的温育期之后将该级分的活性与未在该确定的温度下进行温育的那一级分的活性进行比较。相应的值通常以％来给出。
[0045]“pH稳定性”是指这样的酶的特性，其可以通过下述方式来确定:将酶制备物分成两个级分，使其中一个级分经历确定的PH值，并随后在该确定的pH值下的温育期之后将该级分的活性与未在该确定的PH值下进行温育的那一级分的活性进行比较。相应的值通常以％来给出。
[0046]发明简述
[0047]本发明涉及具有β-吡喃糖苷酶活性的多肽，其包含与SEQ ID N0.2具有至少71%,尽可能地至少75%，尽可能地至少80%，和优选地至少85%的序列同一性的氨基酸序列。SEQ ID N0.2包含在SEQ ID N0.1中。SEQ ID N0.1包含在下文中被称为FgXyl3a的多肽。作为基础的DNA由SEQ ID N0.3来表示。它分离自基因库克隆Bgll3，其包含来自冈瓦纳闪烁杆菌(Fervidobacterium gondwanense)的基因组 DNA 区段。
[0048]本发明还涉及这样的多肽，其包含与SEQ ID N0.1具有至少70%，尽可能地至少75%，尽可能地至少80%，和优选地至少85%的序列同一性的氨基酸序列。此外，本发明还包括这样的多肽，其包含家族3的糖苷水解酶(GHF3)的结构域I和家族3的糖苷水解酶(GHF3)的结构域2，其中这两个结构域中的至少一个与FgXyl3a的相应的结构域具有至少70%，尽可能地至少75%，尽可能地至少80%，和优选地至少85%的序列同一性。FgXy13a的结构域I由包含SEQ ID N0.1的氨基酸残基13至381以及586至383的区域组成；FgXyl3a的结构域2由包含SEQ ID N0.1的氨基酸残基382至585的区域组成。
[0049]在本发明范围内的多肽的β -吡喃糖苷酶活性选自β -吡喃木糖苷酶活性、β -批喃葡萄糖苷酶活性和这两种活性的组合，其中β-吡喃木糖苷酶活性是优选的。
[0050]在一个优选的实施方案中，本发明涉及具有β -吡喃糖苷酶活性的多肽,其氨基酸序列符合至少一个上面提及的标准，并且其可以裂解至少一个在下列底物中所包含的β -糖苷键:木二糖、木三糖、木四糖、木聚糖。
[0051]在一个优选的实施方案中，本发明涉及具有吡喃糖苷酶活性的多肽，其符合至少一个上面提及的标准，并且其针对ρΝΡ-β -纤维二糖苷的活性比针对ρΝΡ-β-木二糖苷的活性显著更低，即相比于针对ρΝΡ-β-木二糖苷的活性而言5%或更低的针对ρΝΡ-β -纤维二糖苷的活性(ρΝΡ在本申请文本中表示对硝基苯基)。
[0052]在一个更优选的实施方案中，本发明涉及具有吡喃糖苷酶活性的多肽，其符合至少一个上面提及的标准，并且其针对ρΝΡ-β -吡喃木糖苷的活性在酸性、中性或弱碱性范围内，即在ΡΗ4.0至ρΗ8.0的范围内，对此尽可能地在弱酸性至中性范围内，即在ρΗ5.5至7.0的范围内，和优选地在ρΗ6.2至6.8的范围内是最大的。
[0053]在一个更优选的实施方案中，本发明涉及具有β -吡喃糖苷酶活性的pH稳定型多肽，其符合至少一个上面提及的标准，并且其最大的针对ρΝΡ-β -吡喃木糖苷的活性在ρΗ9.0下温育48小时后为至少50%，尽可能地至少60%，尽可能地至少70%，和优选地至少80%。
[0054]在一个更优选 的实施方案中，本发明涉及具有β -吡喃糖苷酶活性的在高温下具活性的多肽，其符合至少一个上面提及的标准，并且其针对ρΝΡ- β -吡喃木糖苷的活性在60°C至100°C，尽可能地70°C至95°C，和优选地80°C至90°C的范围内是最大的。
[0055]在一个更优选的实施方案中，本发明涉及具有β -吡喃糖苷酶活性的温度稳定型多肽，其符合至少一个上面提及的标准，并且其最大的针对ρΝΡ- β -吡喃木糖苷的活性在60°C下温育3小时后为至少40%，优选地至少50%。
[0056]在一个更优选的实施方案中，符合至少一个上面所描述的标准的多肽可以作为融合蛋白存在，其中它优选地与下列之一相融合:其他蛋白质的碳水化合物结合结构域、信号肽、亲和标签或蛋白酶切割位点。
[0057]本发明还涉及混合物，其包含符合至少一个上面提及的标准的具有β -吡喃糖苷酶活性的多肽，以及一种或多种果胶酶和/或一种或多种内切木聚糖酶和/或一种或多种β -葡萄糖苷酶和/或一种或多种β -葡聚糖酶和/或一种或多种纤维二糖水解酶和/或一种或多种β-木糖苷酶和/或一种或多种α-阿拉伯呋喃糖苷酶和/或一种或多种α-葡糖醛酸糖苷酶和/或一种或多种乙酰木聚糖酯酶。
[0058]本发明还涉及编码上面所描述的多肽的核酸，以及包含所述核酸的载体。
[0059]本发明还涉及用上面所描述的载体转化的宿主细胞。在本发明范围内的宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞。真核宿主细胞优选地选自由下列组成的组:酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、乳酸裂殖酵母(Schizosaccharomyces lactis)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、解甲醇毕赤酵母(Pichia methanolytica)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、狭小毕赤酵母(Pichia angusta)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、黑曲霉(Aspergillusniger)、卢地金抱子菌(Chrysosporium lucknowense)、里氏木霉(Trichoderma reesei )、青霉属物种(Penicillum sp.)。
[0060]在一个特别优选的实施方案中，所述真核宿主细胞为甲基营养型酵母，其优选地选自包括下列的组:解甲醇毕赤酵母、巴斯德毕赤酵母、狭小毕赤酵母、多形汉逊酵母。
[0061]在本发明范围内的原核宿主细胞优选地选自包括下列的组:芽孢杆菌属物种(Bacillus sp.)、枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽抱杆菌(Bacilluslicheniformis)、巨大芽抱杆菌(Bacillus megaterium)、嗜热栖热菌(Thermusthermophilus)、突光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、闪烁杆菌属物种(Fervidobacterium sp.)、大肠杆菌(Escherichia coli)。
[0062]本发明还涉及用于纯化上面所描述的具有β -吡喃糖苷酶活性的多肽的方法，其包括下列步骤:
[0063]a)获得用上面所描述的载体转化的宿主细胞，
[0064]b)在表达出所述具有β -吡喃糖苷酶活性的多肽所处的条件下培养所述宿主细胞，
[0065]c)纯化所述具有β -吡喃糖苷酶活性的多肽。
[0066]在一个优选的实施方案中，所述用于纯化上面所描述的具有β -吡喃糖苷酶活性的多肽的方法的步骤c)包括热沉淀。
[0067]本发明还涉及上面所描述 的具有β -吡喃糖苷酶活性的多肽或上面所描述的包含上面所描述的具有β -吡喃糖苷酶活性的多肽的混合物的用途，所述用途为用于分解一种或多种下列底物:β-吡喃木糖苷或β-吡喃葡萄糖苷。
[0068]在一个优选的实施方案中，本发明涉及上面所描述的用途，所述用途为用于含木质素纤维素的生物质的酶促分解，和/或用于纺织品加工，和/或用作洗涤剂的添加物，和/或用在食品和/或饲料工业中。
[0069]在一个优选的实施方案中，本发明涉及上面所描述的用途，所述用途为用于制备果汁，和/或用于制备葡萄酒或含葡萄酒的饮料，和/或用于制备啤酒或含啤酒的饮料，和/或用于制备油，优选地用于制备橄榄油、菜籽油或向日葵籽油，和/或用于制备焙制食品。
[0070]发明详述
[0071]具有β -吡喃糖苷酶活性的多肽
[0072]本发明涉及具有β-吡喃糖苷酶活性的多肽，其包含与SEQ ID N0.2具有至少71%,尽可能地至少75%，尽可能地至少80%，和优选地至少85%的序列同一性的氨基酸序列。在此，如在“定义”部分中所描述的那样来确定序列同一性。
[0073]SEQ ID N0.2 包含在 SEQ ID N0.1 中。SEQ ID N0.1 包含多肽 FgXyl3a 的氨基酸序列。由SEQ ID N0.3所表示的作为SEQ ID N0.1的基础的DNA源自基因库克隆Bgll3，其包含来自冈瓦纳闪烁杆菌的基因组DNA区段。SEQ ID N0.3的发现以及结构域结构的确定详细描述在实施例3中。[0074]简而言之，SEQ ID N0.2包含SEQ ID N0.1的这样的区域，所述区域包括该糖苷水解酶的两个结构域，其是通过与SEQ ID N0.4 (来自那不勒斯栖热袍菌的酶BglB，Pozzo等人，2010，J.Mol.Biol.,2:397 (3)，724-739)的序列比较而确定的。因此，SEQ ID N0.2 包含SEQ ID N0.1的氨基酸残基13至638。
[0075]本发明还涉及这样的多肽，其包含与SEQ ID N0.1具有至少70%，尽可能地至少75%，尽可能地至少80%，和优选地至少85%的序列同一性的氨基酸序列。
[0076]此外，本发明还涉及这样的多肽，其包含家族3的糖苷水解酶(GHF3)的结构域I和家族3的糖苷水解酶(GHF3)的结构域2，其中这两个结构域中的至少一个与FgXyl3a的相应的结构域具有至少70%，尽可能地至少75%，尽可能地至少80%，和优选地至少85%的序列同一性。FgXyl3a的结构域I由包含SEQ ID N0.1的氨基酸残基13至381以及586至383的区域组成；FgXyl3a的结构域2由包含SEQ ID N0.1的氨基酸残基382至585的区域组成。用于确定结构域 的方法描述在实施例1中。一般地，它可以应用于其序列同一性至少符合本文中所描述的标准的多肽。
[0077]在本发明范围内的具有β_吡喃糖苷酶活性的多肽的克隆(实施例2)、表达(实施例3)、从细胞提取物中的纯化(实施例4和5)以及分子量的确定(实施例6)描述在实施例中。
[0078]在本发明范围内的多肽的β -吡喃糖苷酶活性选自β -吡喃木糖苷酶活性、β -批喃葡萄糖苷酶活性和这两种活性的组合，其中β -吡喃木糖苷酶活性是优选的。在本发明范围内的多肽的活性检测以及底物特异性的确定详细描述在实施例7和8中。
[0079]在一个优选的实施方案中，本发明涉及具有吡喃糖苷酶活性的多肽，其符合至少一个上面提及的标准，并且其可以水解至少一个在下列底物中所包含的糖苷键:木二糖、木三糖、木四糖、木聚糖。具有吡喃糖苷酶活性的多肽的水解产物的确定详细描述在实施例13中。
[0080]在一个优选的实施方案中，本发明涉及具有吡喃糖苷酶活性的多肽，其符合至少一个上面提及的标准，并且其针对ρΝΡ-β -纤维二糖苷的活性比针对ρΝΡ-β-木二糖苷的活性显著更低，即相比于针对ρΝΡ-β-木二糖苷的活性而言5%或更低的针对ρΝΡ-β -纤维二糖苷的活性。用于确定底物特异性的方法描述在实施例8中。
[0081]在一个更优选的实施方案中，本发明涉及具有吡喃糖苷酶活性的多肽，其符合至少一个上面提及的标准，并且其针对ρΝΡ-β -吡喃木糖苷的活性在酸性、中性或弱碱性范围内，即在ΡΗ4.0至ρΗ8.0的范围内，对此尽可能地在弱酸性至中性范围内，即在ρΗ5.5至7.0的范围内，和优选地在ρΗ6.2至6.8的范围内是最大的。用于确定pH值对于具有β_吡喃糖苷酶活性的多肽的活性的影响的方法更精确地描述在实施例11中。
[0082]在一个更优选的实施方案中，本发明涉及具有β -吡喃糖苷酶活性的pH稳定型多肽，其符合至少一个上面提及的标准，并且其最大的针对ρΝΡ- β -吡喃木糖苷的活性在ρΗ9.0下温育48小时后为至少50%，尽可能地至少60%，尽可能地至少70%，和优选地至少80%。用于确定pH值对于具有β_吡喃糖苷酶活性的多肽的活性的影响的方法更精确地描述在实施例11中。
[0083]在一个更优选的实施方案中，本发明涉及具有β -吡喃糖苷酶活性的在高温下具活性的多肽，其符合至少一个上面提及的标准，并且其针对ρΝΡ- β -吡喃木糖苷的活性在60 °C至100°C，尽可能地70 V至95 °C，和优选地80 °C至90°C的范围内是最大的。用于确定温度对于具有β-吡喃糖苷酶活性的多肽的活性的影响的方法更精确地描述在实施例9中。
[0084]在一个更优选的实施方案中，本发明涉及具有β -吡喃糖苷酶活性的温度稳定型多肽，其符合至少一个上面提及的标准，并且其最大的针对ρΝΡ- β -吡喃木糖苷的活性在60°C下温育3小时后为至少40%，优选地至少50%。用于确定关于具有吡喃糖苷酶活性的多肽的活性的温度稳定性的方法更精确地描述在实施例10中。
[0085]融合蛋白
[0086]在本发明范围内的多肽可以要么以分离的形式出现，要么与一种或多种其他寡肽或多肽相融合。即在另一个优选的实施方案中，满足至少一个上面所描述的标准的多肽可以作为融合蛋白存在，其中它优选地与下列之一相融合:其他蛋白质的碳水化合物结合结构域、信号肽、亲和标签或蛋白酶切割位点。
[0087]在本发明范围内的融合蛋白并不局限于用其来获得该融合蛋白的那种方法，而是包括所有类型的融合蛋白，只要在其中包含满足至少一个上面提及的标准的成分。一种可能性是，借助于分子生物学方法来获得在本发明范围内的融合蛋白。如本领域技术人员所知晓的，用于制造编码融合蛋白的核酸的方法是分子生物学的标准方法，其例如更精确地描述在 Sambrook 等人(Molecular cloning, a laboratory manual,第 2 版，1989，ColdSpring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York)中。在此，在一个优选的实施方案中，除了在本发明范围内的具有β_木糖苷酶活性的多肽外，所述融合蛋白可以与其他蛋白质的碳水化合物结合结构域相融合。在一个优选的实施方案中，在本发明范围内的具有β-木糖苷酶活性的多肽可以与从下组中的一种或多种之中选择出的多肽相融合:信号肽、亲和标签、蛋白酶切割位点。在此，可以利用翻译偶联，以便将表达出的在本发明范围内的多肽导向细胞区室、细胞器或从宿主细胞中输出。信号肽，也称为信号序列，是本领域技术人员熟知的，并且包括周质蛋白OmpA、OmpT, PelB, PhoA的前导序列。用于蛋白质的输出的信号序列存`在于例如天然出现的分泌蛋白质中，例如具有碳水化合物修饰特性的蛋白质，如纤维二糖水解酶I或II，内切葡聚糖酶，AmyE,以及在酿酒酵母中，Mfa，或者鸡蛋溶菌酶。适合于作为重组表达的蛋白质的附加物的蛋白酶切割位点是本领域技术人员熟知的。在此，蛋白酶切割位点表示这样的多肽或寡肽，其包含可以被特定的蛋白酶特异地裂解的肽键，以及通常存在于裂解位点附近并且被相应的蛋白酶识别的识别序列。在本发明范围内可以使用的蛋白酶切割位点无进一步限制。它们明确地包括烟草蚀斑病毒(TEV)蛋白酶的切割位点、哺乳动物凝血因子例如因子Xa或凝血酶的切割位点。在本发明范围内可以使用的亲和标签无进一步限制。如本领域技术人员所知晓的，已被证明对于许多多肽的纯化来说有利的亲和标签例如更精确地描述在Sambrook等人(Molecular cloning, a laboratory manual,第 2 版,1989,Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, New York)中。在本发明范围内明确地包括寡组氨酸标签，如在实施例1和5中所描述的。
[0088]酶混合物
[0089]在本发明范围内，也可以使用酶的混合物。该混合物包含满足至少一种上面所描述的标准的具有吡喃糖苷酶活性的多肽，以及一种、两种或更多种或若干种其他酶。这些其他酶可以选自包括下列的组:果胶酶、内切木聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、β_葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、β-木糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、α -葡糖醛酸糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶。因此，在本发明范围内的酶混合物包含满足至少一个上面所描述的标准的具有β -吡喃糖苷酶活性的多肽，以及一种或多种果胶酶和/或一种或多种内切木聚糖酶和/或一种或多种β-葡萄糖苷酶和/或一种或多种β-葡聚糖酶和/或一种或多种纤维二糖水解酶和/或一种或多种β-木糖苷酶和/或一种或多种α-阿拉伯呋喃糖苷酶和/或一种或多种α-葡糖醛酸糖苷酶和/或一种或多种乙酰木聚糖酯酶。
[0090]在一个优选的实施方案中，在本发明范围内的酶混合物包含满足至少一个上面所描述的标准的具有β_吡喃糖苷酶活性的多肽，以及一种或多种α-阿拉伯呋喃糖苷酶和/或一种或多种α-葡糖醛酸糖苷酶和/或一种或多种乙酰木聚糖酯酶。
[0091]如果没有明确地另外指出，在本申请中使用术语“包含/包括”是为了表明，除了在“包含/包括”之下所列示的组分之外，其他组分也可能可选地存在。然而，被认为是特别的实施方案的是，术语“包含/包括”包括没有其他组分存在的可能性，即在该特别的实施方案的范围内， 术语“包含/包括”被理解为术语“由......组成”。
[0092]核酸和载体
[0093]本发明涉及编码上面所描述的多肽的核酸。关于这样的核酸的实例由SEQ IDN0.3来描述。在本发明范围内的核酸可以是表达盒的组成部分。表达盒的典型组成部分是本领域技术人员熟知的；它例如更精确地描述在Sambrook等人(Molecular cloning, alaboratory manual,第2版，1989，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold SpringHarbor, New York)中。除了编码序列外,在表达盒中通常还至少包含:启动子和终止子。在此，编码在本发明范围内的多肽的基因的表达水平可以通过引入到宿主细胞中的基因的拷贝数来进行调节，在此优选地存在多于一个的拷贝。为了经优化的表达，可以调节启动子，从而其例如对于化学药品的添加或者一个或多个物理参数的改变作出响应，从而可以引起或关闭基因的诱导。诱导型启动子的实例包括:四环素阻遏物系统、Lac-阻遏物系统(Beneyx, 1999, Curr.0pin.Biotechnol.10:411:422)、铜离子诱导型系统(Hottinger 等人，2004, Yeast, 10:283-296)、甲醇诱导型系统(Cereghino 等人，2000, FEMS Microbiol.ReViews24:45-66)或温度诱导型λ PL启动子。备选地，通过达到培养物的有利的生理学状态来抑制启动子也可以是一个有用的策略(启动子PhoA、Trp、Adh2、Fmdh, CBHl (Price等人，1990，Methods Enzymo1., 185-308-318 ；Hollenberg, 1995，US3589585))。用于进一步提高产率的方法包括一种或多种参与翻译的蛋白质、参与目标操纵的蛋白质、参与折叠的蛋白质(例如，Hsp70家族的蛋白伴侣、蛋白质二硫键异构酶)或有助于正确加工的蛋白酶的共表达。
[0094]在此，可以将表达盒整合到载体中，所述载体要么以游离方式在宿主细胞中增殖，要么整合到其基因组中。关于典型的载体的实例为细菌质粒，酵母质粒，包含着丝粒的线性DNA，病毒起源的构建体，例如SV40、噬菌体DNA、杆状病毒、痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒、假狂犬病病毒，以及细菌、真核生物和病毒起源的载体的组合。整合可以通过分子生物学领域的技术人员熟知的方法来进行，例如同源重组、转座或通过使用病毒转染系统。此外，还包括用于表达的游离型系统，其的一个或多个拷贝有计划地或无计划地整合到宿主细胞的基因组中。此外，还包括允许在本发明范围内的多肽在宿主细胞中的异源表达的所有载体系统。[0095]宿主细胞
[0096]本发明还涉及用上面所描述的载体转化的宿主细胞。
[0097]用于将载体构建体引入到宿主细胞中的优选的方法包括转化、转染、接合和杂交。转化可以通过电穿孔，原生质体融合，脂质转染，弹道轰击，基于氯化钙、聚乙二醇(PEG)或氯化锰的化学转化来进行。其他策略包括使用病毒颗粒。另一种可能性为使用天然感受态生物作为宿主细胞。
[0098]在本发明范围内的宿主细胞可以为原核细胞或真核细胞。真核宿主细胞优选地选自由下列组成的组:酿酒酵母、解脂耶氏酵母、乳酸裂殖酵母、乳酸克鲁维酵母、解甲醇毕赤酵母、巴斯德毕赤酵母、狭小毕赤酵母、多形汉逊酵母、黑曲霉、卢地金孢子菌、里氏木霉、青霉属物种。
[0099]在一个特别优选的实施方案中，所述真核宿主细胞为甲基营养型酵母，其优选地选自包括下列的组:解甲醇毕赤酵母、巴斯德毕赤酵母、狭小毕赤酵母、多形汉逊酵母。
[0100]在本发明范围内的原核宿主细胞优选地选自包括下列的组:芽孢杆菌属物种、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、嗜热栖热菌、荧光假单胞菌、闪烁杆菌属物种、大肠杆菌。
[0101]在转化宿主细胞并生长至所希望的细胞密度后，可以通过化学激活剂或通过改变一个或多个物理参数来诱导所选择的诱导型启动子，如此所培养的宿主细胞产生所希望的多肽。
[0102]纯化方法
[0103]本发明还涉及用于纯化上面所描述的具有β -吡喃糖苷酶活性的多肽的方法。在一个特别的实施方案中，所述多肽在此不从宿主细胞中分泌。在培养之后，随后可以分离宿主细胞，并分离包含于其中的在本发 明范围内的多肽。相应的方法描述在实施例3至5中。在一个特别的实施方案中，作为具有至少一个信号肽的融合蛋白产生在本发明范围内的多肽，所述信号肽指导该重组蛋白从宿主细胞中分泌。
[0104]详细地，所述方法包括下列步骤:
[0105]a)获得用上面所描述的载体转化的宿主细胞，
[0106]b)在表达出所述具有β -吡喃糖苷酶活性的多肽所处的条件下培养所述宿主细胞，
[0107]c)纯化所述具有β -吡喃糖苷酶活性的多肽。
[0108]根据a)的宿主细胞可以根据本领域技术人员熟知的方法(例如在“宿主细胞”章节中所描述的)来获得。
[0109]步骤b)的施行方式受到许多因素的影响，这些因素基本上是本领域技术人员已知的。因此，根据所使用的宿主细胞的类型来选择生长培养基、生长温度和其他生长条件。表达出所述多肽所处的条件此外还特别地依赖于所使用的启动子的选择，如上面所描述的。用于从表达蛋白质的细胞培养物中收获宿主细胞的各种不同的方法是本领域技术人员熟知的，并且包括例如包含宿主细胞的培养基的离心，以及包含宿主细胞的培养基的过滤。通常，随后将所述细胞进行裂解，要么通过化学或机械的方法，要么通过其组合。
[0110]依赖于所表达的多肽的性质来选择步骤c)的施行方式。在其中表达具有在本发明范围内的多肽和其他结构域(例如亲和标签)的融合蛋白的特别的实施方案中，也可以利用亲和标签的特性以纯化该融合蛋白。关于这样的亲和标签的实例为包含数个(通常至少六个)组氨酸残基的附加物，如在实施例3至5中所描述的。
[0111]在一个优选的实施方案中，所述用于纯化上面所描述的多肽的方法的步骤c)包括热沉淀。为此，将各种不同多肽的混合物(其包含所希望的多肽)带至确定的温度，其一般高于宿主细胞在表达期间生长时所处的温度。该混合物可以包含两种或更多种不同的多肽。相应的混合物还可以为在裂解(例如用机械或化学的方法或者其组合)表达所希望的多肽的细胞时产生的裂解液，或者从该裂解液获得或富集的提取物。
[0112]根据其特性，不同的蛋白质在不同的升高的温度下沉淀出来。因此，可以达到在细胞裂解液中或在从其获得的提取物中的富集。通过进一步升高温度，可以可选地使所希望的蛋白质沉淀出来。
[0113]用途
[0114]本发明还涉及上面所描述的具有β_吡喃糖苷酶活性的多肽或者包含具有β_吡喃糖苷酶活性的多肽的混合物的用途，用于对于其来说这样的酶活性是需要的或希望的任何目的。
[0115]本发明特别地描述了上面所描述的具有β_吡喃糖苷酶活性的多肽或者包含具有β_吡喃糖苷酶活性的多肽的混合物的用途，所述用途为用于分解一种或多种包含一个或多个β-吡喃木糖苷键和/或一个或多个β-吡喃葡萄糖苷键的底物，在下文中称为β-吡喃木糖苷或β-吡喃葡萄糖苷。
[0116]在一个优选的实施方案中，本发明涉及上面所描述的用途，所述用途为用于含木质素纤维素的生物质的酶促分解。
[0117]在一个更优选的实施方案中，本发明涉及上面所描述的用途，所述用途为用在纺织品加工中。在一个特别优选的实施方案中，本发明涉及上面所描述的用途，所述用途为用作洗涤剂的添加物。在另一 个特别优选的实施方案中，本发明涉及上面所描述的用途，所述用途为用在食品和/或饲料工业中。最后，在另一个特别优选的实施方案中，本发明涉及两种或更多种这些用途的组合。
[0118]在一个特别优选的实施方案中，本发明涉及上面所描述的用途，所述用途为用于制备果汁。在一个更加优选的实施方案中，本发明涉及上面所描述的用途，所述用途为用于制备葡萄酒或含葡萄酒的饮料；和在另一个更加优选的实施方案中，本发明涉及上面所描述的用途，所述用途为用于制备啤酒或含啤酒的饮料。在另一个更加优选的实施方案中，本发明涉及上面所描述的用途，所述用途为用于制备油，优选地橄榄油、菜籽油或向日葵籽油。最后，在另一个更加优选的实施方案中，本发明涉及上面所描述的用途，所述用途为用于制备倍制食品。
实施例
[0119]实施例1:来自冈瓦纳闪烁杆菌的β -卩比喃糖苷酶FgXyl3A的鉴定和表征
[0120]为了鉴定纤维素水解和木聚糖水解活性，筛选了 R瓦纳闪烁杆菌的基因库。根据下述方法来制备该基因库:通过使用Qiagen基因组DNA分离试剂盒(QiagenGmbH, Hilden)从冈瓦纳闪烁杆菌细胞中纯化出基因组DNA。通过用Sau3Al进行部分消化来将所获得的DNA分解成长度为数千个碱基的可克隆的片段，并且将这与Iambda-ZAP-Express-Predigested (Stratagene?)载体臂相连接,然后根据制造商的指导，将连接产物包装入噬菌体颗粒中。将初始噬菌体文库在大肠杆菌XLl-Blue MRF’细胞中进行扩增，并且最后该噬菌粒文库借助于辅助噬菌体ExAssist来切出并在转染到大肠杆菌XLOLR中之后稳定地建立。
[0121]为了进行详细检查，将在载体pBK-CMV (卡那霉素抗性，具有Lac启动子的噬菌粒载体，Agilent Technologies, Waldbronn)中包含冈瓦纳闪烁杆菌的部分基因组的大肠杆菌菌株XLOLR的细菌铺板在LB选择基底上并在37°C下温育过夜。将生长出的菌落转移到新鲜培养基上并重新在37°C下温育过夜。
[0122]为了鉴定具有β -葡萄糖苷酶活性的菌落，使用七叶苷(Sigma-Aldrich, Miinchen)作为底物。为此，通过在上面覆盖七叶苷-琼脂(0.l%(w/v)七叶苷，0.01%(w/v)柠檬酸铁
(III)铵，50通乙酸钠，l%(w/v)琼脂糖，pH6.0)的方式来检测菌落。在此，通过围绕菌落的棕色晕圈的形成来进行活性检测，所述棕色晕圈由于七叶苷裂解为葡萄糖和七叶亭而产生。七叶亭与铁离子形成络合物，其由于棕色色彩而是可见的。分离出具有酶促活性的克隆并进行培养。
[0123]借助于比色检测方法用底物七叶苷来进行的筛选导致鉴定出基因库克隆Bgll3。
[0124]为了确定编码该活性蛋白质的开放阅读框(0RF)，借助于“引物步移(PrimerWalking)”，通过使用标准引物T3和T7，对来自克隆Bgll3的质粒进行测序。
【权利要求】
1.具有β-吡喃糖苷酶活性的多肽，其中所述多肽包含与SEQID N0.2具有至少71%，尽可能地至少75%，尽可能地至少80%，和优选地至少85%的序列同一性的氨基酸序列。
2.具有吡喃糖苷酶活性的多肽，其中所述多肽包含与SEQID N0.1具有至少70%，尽可能地至少75%，尽可能地至少80%，和优选地至少85%的序列同一性的氨基酸序列。
3.具有吡喃糖苷酶活性的多肽，其中所述多肽包含下述氨基酸序列: (1)氨基酸序列，其与FgXyl3a的结构域I具有至少70%，尽可能地至少75%，尽可能地至少80%，和优选地至少85%的序列同一性，所述FgXyl3a的结构域I由包含SEQ ID N0.1的氨基酸残基13至381以及586至383的区域组成，以及 (2)氨基酸序列，其是家族3的糖苷水解酶(GHF3)的结构域2。
4.具有吡喃糖苷酶活性的多肽，其中所述多肽包含下述氨基酸序列: (1)氨基酸序列，其是家族3的糖苷水解酶(GHF3)的结构域1，以及 (2)氨基酸序列，其与FgXyl3a的结构域2具有至少70%，尽可能地至少75%，尽可能地至少80%，和优选地至少85%的序列同一性，所述FgXyl3a的结构域2由包含SEQ ID N0.1的氨基酸残基382至585的区域组成。
5.根据前述权利要求中一项或多项的多肽，其中所述β_吡喃糖苷酶活性选自β_吡喃木糖苷酶活性、β-吡喃葡萄糖苷酶活性和这两种活性的组合。
6.根据前述权利要求中一项或多项的多肽，其具有β_吡喃木糖苷酶活性。
7.根据前述权利要求中一项或多项的多肽，其可以水解至少一个在下列底物中所包含的糖苷键:木二糖、木三糖、木 四糖、木聚糖。
8.根据前述权利要求中一项或多项的多肽，其针对ρΝΡ-β-纤维二糖苷的活性相比于针对ρΝΡ- β -木二糖苷的活性而言为5%或更低。
9.根据权利要求2至8中一项或多项的多肽，其针对ρΝΡ-β-吡喃木糖苷的酶促活性在ρΗ4.0至ρΗ8.0的范围内，对此尽可能地在ρΗ5.5至7.0的范围内，和优选地在ρΗ6.2至6.8的范围内是最大的。
10.根据权利要求2至9中一项或多项的多肽，其最大的针对ρΝΡ-β -吡喃木糖苷的酶促活性在ΡΗ9.0下温育48小时后为未在ρΗ9.0下进行温育的所述多肽的第二个级分的活性的至少50%，尽可能地至少60%，尽可能地至少70%，和优选地至少80%。
11.根据权利要求2至10中一项或多项的多肽，其针对ρΝΡ-β-吡喃木糖苷的酶促活性在60°C至100°C，尽可能地70°C至95°C，和优选地80°C至90°C的范围内是最大的。
12.根据权利要求2至11中一项或多项的多肽，其最大的针对ρΝΡ-β-吡喃木糖苷的活性在60°C下温育3小时后为未在相应温度下进行温育的所述多肽的第二个级分的活性的至少40%，优选地至少50%。
13.融合蛋白，其由根据前述权利要求中任一项的多肽和其他蛋白质的碳水化合物结合结构域形成。
14.融合蛋白，其由根据前述权利要求中任一项的多肽和第二多肽形成，所述第二多肽选自由下列组成的组中的一种或多种:信号肽、亲和标签、蛋白酶切割位点。
15.混合物，其包含根据前述权利要求之一的多肽，以及一种或多种果胶酶和/或一种或多种内切木聚糖酶和/或一种或多种β-葡萄糖苷酶和/或一种或多种β-葡聚糖酶和/或一种或多种纤维二糖水解酶和/或一种或多种β-木糖苷酶和/或一种或多种α-阿拉伯呋喃糖苷酶和/或一种或多种α-葡糖醛酸糖苷酶和/或一种或多种乙酰木聚糖酯酶。
16.编码根据权利要求1至14之一的多肽的核酸。
17.包含根据权利要求16的核酸的载体。
18.用根据权利要求17的载体转化的宿主细胞。
19.根据权利要求14的宿主细胞，其中所述宿主细胞为真核细胞，其优选地选自由下列组成的组:酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、乳酸裂殖酵母(Schizosaccharomyces lactis)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、解甲醇毕赤酵母(Pichia methanolytica)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、狭小毕赤酵母(Pichia angusta)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、黑曲霉(Aspergillus niger)、卢地金抱子菌(Chrysosporiumlucknowense)、里氏木霉(Trichoderma reesei )、青霉属物种(Penicillum sp.)。
20.根据权利要求18或19的宿主细胞，其中所述宿主细胞为甲基营养型酵母，其优选地选自包括下列的组:解甲醇毕赤酵母、巴斯德毕赤酵母、狭小毕赤酵母、多形汉逊酵母。
21.根据权利要求18的宿主细胞，其中所述宿主细胞为原核细胞，其优选地选自包括下列的组:芽孢杆菌属物种(Bacillus sp.)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽抱杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽抱杆菌(Bacillus megaterium)、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)、突光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、闪烁杆菌属物种(Fervidobacterium sp.)、大肠杆菌(Escherichia coli)。
22.用于纯化根据权利要求1至14之一的具有β-吡喃糖苷酶活性的多肽的方法，其包括:` a)获得用根据权利要求13的载体转化的宿主细胞， b)在表达出所述具有β-吡喃糖苷酶活性的多肽所处的条件下培养所述宿主细胞， c)纯化所述具有β-吡喃糖苷酶活性的多肽。
23.根据权利要求22的方法，其中c)包括热沉淀。
24.根据权利要求1至14中一项或多项的多肽或者根据权利要求15的混合物的用途，所述用途为用于分解一种或多种下列底物:β -吡喃木糖苷或β -吡喃葡萄糖苷。
25.根据权利要求24的用途，所述用途为用于含木质素纤维素的生物质的酶促分解，和/或用于纺织品加工，和/或用作洗涤剂的添加物，和/或用在食品和/或饲料工业中。
26.根据权利要求25的用途，所述用途为用于制备果汁，和/或用于制备葡萄酒或含葡萄酒的饮料，和/或用于制备啤酒或含啤酒的饮料，和/或用于制备油，优选地橄榄油、菜籽油或向日葵籽油，和/或用于制备焙制食品。
【文档编号】C12N15/62GK103429735SQ201180061698
【公开日】2013年12月4日 申请日期:2011年10月26日 优先权日:2010年10月26日
【发明者】C·雷辛格, F·寇拉, B·克里皮尔, G·安特拉尼吉恩 申请人:科莱恩产品（德国）有限公司