用于评估生物分子特性的系统和方法

用于评估生物分子特性的系统和方法
【专利摘要】本发明提供了用于评估多核苷酸上损伤的存在和程度的方法和系统。所述方法包括将标记物整合在损伤位点处并对所述标记物进行成像以确定所述损伤的存在和程度。所述系统包括能够在单个分子上执行损伤评估的装置。
【专利说明】用于评估生物分子特性的系统和方法
[0001]政府权利
[0002]这项工作得到美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)基金 2R44H004199-03-NIH/NHGR1、美国国家标准与技术研究院(National Institute ofStandards and Technology)基金 70NANB7H7027N NIST-ATP 2007 以及美国国立卫生研究院基金1R43HG004817-01 NIH/DHHS的支持。美国政府在本公开中享有一定的权利。
[0003]相关申请
[0004]本申请要求2010年10月27日提交的美国申请61/407，302 “纳米分析仪系统和方法(Nanoanalyzer Systems and Methods)”、2010年10月20日提交的美国申请61/394，915 “纳米通道阵列中的 DNA 损伤检测(DNA Damage Detection in NanochannelArray)”、2010年10月27·日提交的美国申请61/407，182 “用于基因组研究的单分子DNA纳米通道分析(Single Molecule DNA Nanochannel Analysis for Genomic Studies)”、以及2010年12月I日提交的美国申请61/418，516 “纳米通道阵列中的DNA损伤检测(DNADamage Detection in Nanochannel Array)”的优先权。出于任何和所有目的，将这些申请以其全文整合于此。
【技术领域】
[0005]本公开涉及核酸分析领域、纳米流体学领域和光学仪器领域。
【背景技术】
[0006]生物体的基因组时刻具有内源性和环境诱导的DNA改变的风险。特定基因组位点的DNA损害可以导致核苷酸序列的变化。DNA分子可以通过多种方式被损伤，包括(a)在DNA复制期间产生的错配；(b)由DNA分子的不稳定导致的损伤，例如尿嘧啶的整合、碱基的脱氨、脱嘌呤和脱嘧啶；(c)由于环境因素引起的损伤。例如，电离辐射产生修饰的碱基和链断裂，UV辐射产生环丁烷嘧啶二聚体和其它光化产物。示例性DNA损伤情况被示出在图1中。
[0007]DNA损伤的结果导致DNA片段化(双链DNA断裂)、单链DNA断裂和修饰的碱基。目前，可用于检测这些事件而不需要DNA扩增的高通量和灵敏的方法是有限的，所述扩增可能掩盖那些修饰。因此，本【技术领域】中对于用于检测多核苷酸损伤的方法和系统存在需要。

【发明内容】

[0008]在应对所描述的挑战的过程中，本公开首先提供了方法，所述方法包括:将多核苷酸上的第一位点转变成能够支持聚合酶延伸的第一部分；在所述第一部分处实现延伸，以便将第一标记物整合在所述第一位点处或附近；将包括所述第一标记物的多核苷酸的一部分线性化；以及对所述第一标记物进行成像。
[0009]本公开还提供了分析系统，适当情况下，所述系统包含:样品台，其被配置成接收包含一个或多个纳米通道的流体芯片，所述纳米通道具有在Inm至约250nm范围内的特征性尺寸；光照源，其被配置成照射被布置在所述流体芯片内的样品；以及图像采集器，其被配置成采集照射后的被布置在所述流体芯片内的样品的图像。
[0010]还提供了方法，所述方法包括:将多核苷酸中的第一单链断裂与碱性磷酸酶相接触，以便产生能够支持聚合酶延伸的第一部分；将所述部分与聚合酶和标记的核苷酸相接触，以便将标记物整合到多寡核苷酸中；通过将第一标记物局限在纳米通道内来将所述多核苷酸的至少一部分线性化；以及对所述第一标记物进行成像。
[0011]另外提供了方法，所述方法包括:向多核苷酸中的单链断裂施加具有3’至5’核酸外切酶活性的DNA聚合酶，以便将不可延伸的单链断裂转变成聚合酶可延伸的位点；以及施加DNA聚合酶和标记的脱氧核苷酸，以便将标记物整合到所述多核苷酸中。 [0012]本公开还提供了方法，所述方法包括:将具有脱碱基位点的多核苷酸布置在多孔基质材料内；将所述多核苷酸与碱性材料相接触，以便将所述脱碱基位点转变成所述多核苷酸中的单链断裂，以便将所述多核苷酸中的单链断裂转变成所述多核苷酸中的双链断裂，或两者；将所述多核苷酸中的单链断裂、所述多核苷酸中的双链断裂、或两者转变成能够支持聚合酶延伸的部分；以及将所述部分与聚合酶和标记的核苷酸相接触，以便将一种或多种标记物整合到所述多核苷酸中。
[0013]进一步公开了其它方法，这些方法包括:将多核苷酸布置在多孔基质材料内；将多核苷酸上的第一位点转变成能够支持聚合酶延伸的第一部分；在所述第一部分处实现延伸，以便将第一标记物整合在所述第一位点处或附近；通过将所述第一标记物局限在纳米通道内来将所述多核苷酸的至少一部分线性化；以及对所述第一标记物进行成像。
[0014]进一步公开了试剂盒，所述试剂盒包含:一定量的N-糖基化酶；一定量的脱嘌呤/脱嘧啶裂解酶、3’ -磷酸二酯酶、或两者；一定量的聚合酶；以及一定量的标记的核苷酸。
[0015]试剂盒也可以包含:一定量的碱性材料；一定量的脱嘌呤/脱嘧啶裂解酶、3’ -磷酸二酯酶、或两者；一定量的聚合酶；以及一定量的标记的核苷酸。
[0016]还提供了系统。适当情况下，这些系统包含:试剂盒，其包含(a) —定量的聚合酶，(b) 一定量的标记的核苷酸，以及(C) 一定量的脱嘌呤/脱嘧啶裂解酶、3’-磷酸二酯酶、或核酸内切酶IV中的一种或多种，所述试剂盒适合于与样品成像仪接合，所述样品成像仪包含样品台，所述样品台适合于与含有一个或多个纳米通道的流体芯片接合；光照源，其能够与被布置在所述流体芯片的纳米通道内的样品光学连通；图像采集器，其能够采集照射后的被布置在所述纳米通道内的样品的图像。
[0017]本文中提供的其它方法包括:将多核苷酸包括至少一种标记物的区域线性化，所述标记物已通过聚合酶延伸被整合到所述多核苷酸中，所述聚合酶延伸在从脱碱基位点、单链断裂、或两者转变而来的部分上执行。
[0018]本文中公开的其它方法包括:将标记物整合在多核苷酸上的损伤位点处或附近；将多核苷酸的包括所述标记物的区域线性化；以及对所述标记物进行成像。
[0019]本公开还提供了系统，所述系统包含:基底，其被配置成接收流体芯片；光照器，其被配置成照射被布置在所述流体芯片内的多核苷酸样品；以及图像采集器，其被配置成采集来自于被布置在所述流体芯片内的多核苷酸样品的图像。
【专利附图】

【附图说明】[0020]当结合附图进行阅读时，
【发明内容】
以及下面的详细描述可以得到进一步的理解。出于说明本发明的目的，在附图中示出了本发明的示例性实施方式；然而，本发明并不限定于所公开的具体的方法、组合物和装置。此外，附图不一定是按比例绘制的。在附图中:
[0021]图1示出了示例性的可能由DNA损伤导致的DNA损害，所述损害包括单链断裂(SSB)、双链断裂(DSB)、和修饰的碱基；
[0022]表I示出了由DNA暴露于由铯137 (137Cs)产生的Y射线形式的电离辐射导致的DNA损害的类型和量的实例；
[0023]图2示出了根据本公开使用N-糖基化酶识别紫外线(UV)损伤的碱基以及氧化损伤的碱基，然后对DNA损伤位点进行荧光标记的图解过程；
[0024]图3示出了示例性的根据三种不同的DNA纯化方案纯化的人类基因组DNA的大小分布:S1:Buccal Gentra Pure Gene 试剂盒(Qiagen) ;S2:Cell Gentra Pure Gene 试剂盒(Qiagen) ；S3:Easy DNA试剂盒(Invitrogen)。使用脉冲场凝胶电泳测定相对大小分布(PFGE，图中的左侧图)，同时产生流过纳米通道阵列并在其中成像的相同DNA样品的大小的直方图(图中的中间图)，在右侧图中提供了长度大于IOOKbp的DNA质量的定量，其表示为相对于小于IOOKbp的DNA质量的比率；
[0025]图4 (上部图)示出了经受UV损伤并随后经受DNA修复酶核酸内切酶IV和T4核酸内切酶V以及Vent (exo-)聚合酶和荧光核苷酸的粘粒DNA的大小的直方图，并且底部图示出了示例性的作为UVC暴露量函数的粘粒DNA的单链切口密度，其中UVC暴露量在0-5, 000J/m2 范围内；
[0026]图5示出了示例性的经受UV损伤、然后与DNA修复酶核酸内切酶IV和UVDE以及Vent (exo-)聚合酶和荧光核苷酸相接触的粘粒DNA的大小的直方图；
[0027]图6示出了示例性的经受过氧化氢(H2O2)损伤并随后经受DNA修复酶核酸内切酶IV和核酸内切酶III以及Vent (exo-)聚合酶和荧光标记的核苷酸的粘粒DNA的大小的直方图，粘粒DNA的H2O2处理在0-2.5 μ M范围内；
[0028]图7示出了可选的DNA损伤评估测定法，其包括将细胞布置在多孔基质中；
[0029]图8示出了来自于人类细胞样品三重样的数据，所述样品经受O μ M与500 μ M过氧化氢并使用图7中示出的可选的基于细胞的DNA损伤测定法进行处理。图8Α示出了在过氧化氢(H2O2)处理人类B细胞后人类基因组DNA的大小的直方图。所述细胞被包埋在琼脂糖中并裂解，随后进行碱处理，然后经受DNA修复酶核酸内切酶IV以及Vent (exo-)聚合酶和荧光核苷酸，接着用β -琼脂糖酶消化细胞团块，图8Β示出了平均分子长度和平均标记物密度(标记物/IOOkb)；
[0030]图9示出了纳米通道阵列内荧光标记的DNA的单分子成像(A)和随后的数据分析(B)，其证实了以剂量依赖性方式增加的标记密度以及用UVC辐射处理的人类基因组DNA的降低的分子大小。在纳米通道阵列中分析后的UVC处理的样品还在脉冲场凝胶电泳(PFGE)凝胶上进行电泳(C)以进行分子大小分布的比较，如图中所示；
[0031 ] 图10绘出了用于检测DNA的氧化损伤的处理途径；
[0032]图11示出了来自于根据本公开处理的DNA的数据的示例性映射；
[0033]图12示出了现有的光照系统和本公开中使用的光照系统之间的比较；
[0034]图13绘出了所公开的系统中使用的自动聚焦系统的图示；[0035]图14示出了本公开的系统的外部和内部视图；
[0036]图15示出了本公开的系统的内部视图；
[0037]图16示出了本公开的系统的内部视图；以及
[0038]图17示出了说明性的本公开的成像工作流程。
【具体实施方式】
[0039]通过结合附图和实施例，参考下面的详细描述，可以更容易地理解本发明，所述附图和实施例形成本发明的一部分。应当理解，本发明并不限制于本文中描述和/或示出的具体的装置、方法、应用、条件或参数，并且本文中使用的术语仅出于以示例的方式描述【具体实施方式】的目的，并不旨在限制要求保护的发明。此外，在本说明书、包括权利要求书中使用时，不带具体数量的指称包括复数形式，并且对具体数值的指称至少包括该具体值，除非上下文清楚指明不是如此。在本文中使用时，术语“多个”是指大于一个。当表述了一系列值时，另一个实施方式包括从一个具体值和/或至另一个具体值。类似地，当利用先行词“约”将值表述为近似值时，应当理解，该具体值形成另一个实施方式。所有范围都是包含端点并可组合的。
[0040]应当意识到，为清楚起见在分开的实施方式的情形下在本文中进行描述的本发明的某些特征也可以被组合提供在单个实施方式中。相反，为简洁起见在单个实施方式的情形下进行描述的本发明的多种特征也可以被单独提供或以任何子组合的形式提供。此外，对以范围的形式陈述的值的指称包括该范围内的每一个值和所有值。本申请中引用的任何和所有文献通过参考以其全文整合于此。
[0041]第一方面，本公开提供了方法。这些方法可用于例如评估多核苷酸上可能存在的损伤的存在、类型和程度。
[0042]适当情况下，所述 方法包括:将多核苷酸上的第一位点转变成能够支持聚合酶延伸的第一部分；在所述第一部分处实现延伸，以便将第一标记物整合在所述第一位点处或附近；将包括所述第一标记物的多核苷酸的一部分线性化；以及对所述第一标记物进行成像。
[0043]可以通过多种方式来实现线性化。在一个实施方式中，通过将包括所述第一标记物的多核苷酸的一部分局限在纳米通道内来实现所述线性化。目前已授权并通过参考以其全文整合于此的美国专利申请号10/484,293中描述了适合的纳米通道。被用于将多寡核苷酸线性化的纳米通道适当地具有小于约250nm、小于约200nm、小于约150nm、小于约lOOnm、或甚至小于约50nm的沟槽宽度。所述纳米通道可以具有小于约200nm、小于约150nm、小于约lOOnm、或甚至约2nm的沟槽深度。所述纳米通道适当地具有在Inm至约250nm范围内的特征性尺寸(深度、宽度、长度)。美国专利申请10/484，293描述了多种制造这样的纳米通道和纳米通道阵列的方式。
[0044]所述纳米通道本身可以是全部或部分封闭的，并且也可以具有均一或可变的深度，如美国专利申请11/536，178中所描述的，所述美国专利申请通过参考以其全文整合于此。所述纳米通道还可以包括标柱(post)、支柱、或其它障碍物，以便调节所述纳米通道内输送的多核苷酸的通过，如美国专利申请11/536，178中所描述的。所述纳米通道可以具有足够的长度以包含所述多核苷酸的至少一部分，并且所述多核苷酸的标记的部分适当地处于该区域内并被拉长。
[0045]适当情况下，所述多核苷酸的第一位点为损伤位点，并且可以是多核苷酸中的单链断裂，或者甚至是多核苷酸中的双链断裂。适合于所公开的方法的第一位点还包括环丁烷嘧啶二聚体、光化产物(例如6-4光化产物)、胸腺嘧啶二聚体、氧化嘧啶、脱碱基位点(例如脱嘌呤位点、脱嘧啶位点)。前述项的价异构体以及前述项的杜瓦价异构体也是适合的，这些位点的任意组合也是适合的。
[0046]适当情况下，所述第一位点的转变产生脱嘧啶位点、脱嘌呤位点、单链断裂(适当情况下不可延伸)、或它们的某些组合。可以通过将所述第一位点与水解脱嘌呤位点、水解脱嘧啶位点、或水解两者的酶相接触来实现所述转变。可以通过将所述第一位点与N-糖基化酶、碱性材料或甚至与两者相接触来实现接触。
[0047]多种化合物可以被用作N-糖基化酶，包括核酸内切酶II1、T4核酸内切酶V、核酸内切酶VII1、紫外线DNA核酸内切酶、甲酰胺基嘧啶DNA糖基化酶等。化合物的组合可以被用于实现转变。
[0048]在一个实施方式中，所述第一位点可以是脱碱基位点，将所述脱碱基位点与碱性材料向接触。可以使用多种碱性材料(例如碱性溶液)。然后，所述碱性材料适当地将所述脱碱基位点转变成单链断裂。所公开的方法的这方面被示出在图7中，该图示出了通过施加碱处理将脱碱基位点转变成单链断裂(“SSB”)。碱处理也可以被用于将单链断裂转变成双链断裂，实现该转变是通过将所述单链断裂与碱性溶液相接触以便实现向双链断裂的转变。
[0049]使用者还可以将脱碱基(脱嘧啶/脱嘌呤)位点、或单链断裂(适当情况下不可延伸)、或两者与脱嘌呤/脱嘧啶裂解酶、磷酸二酯酶、或其任意组合相接触。核酸内切酶IV被认为是特别适合于该目的的裂解酶，但是也可以使用其它所谓的AP裂解酶，包括(但不限于)AP核酸内切酶类1、脱氧核糖核酸内切酶(脱嘌呤或脱嘧啶)、脱氧核糖核酸酶(脱嘌呤或脱嘧啶)、大肠埃希氏杆菌(Ε. coli)核酸内切酶II1、噬菌体-T4UV核酸内切酶、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)UV核酸内切酶、AP位点-DNA 5’-磷酸单酯-裂解酶、以及X-射线核酸内切酶III。
[0050]如上所述,通过将所述多核苷酸的特征转变成能够整合标记物的位点来标记所述特征。在这样的实施方式中，这可以通过使用N-糖基化酶将碱基转变成能够整合标记物的化学形态来实现。该转变的实现可以通过将N-糖基化酶与多核苷酸进行温育。这继而导致受损的DNA碱基转变成脱碱基(即脱嘌呤/脱嘧啶)位点。通过核苷酸的糖与碱基之间的N-糖基键的断裂可以使该转变发生。然后可以施加脱碱基核酸内切酶，以将所述脱碱基位点转变成聚合酶可延伸的位点。然后，随后施加的DNA聚合酶和荧光脱氧核苷酸导致荧光标记物整合在DNA损伤位点处。
[0051]使用者可以标记氧化嘌呤损伤。这可以通过以下方式来实现:施加FPG(甲酰胺基嘧啶[fapy]-DNA糖基化酶)，以便将氧化嘌呤转变成脱碱基位点。然后，使用者可以施加脱碱基(即脱嘌呤/脱嘧啶)核酸内切酶或其它脱碱基核酸内切酶，以将所述脱碱基位点转变成聚合酶可延伸的位点。然后，使用者可以施加DNA聚合酶和荧光核苷酸(或脱氧核苷酸)，这继而对原始DNA氧化损伤位点进行荧光标记。
[0052]也可以标记氧化嘧啶损伤。适当情况下，这通过以下方式来实现:施加核酸内切酶II1、核酸内切酶VII1、或两者，以便将氧化嘧啶转变成脱碱基位点。然后，使用者可以施加脱碱基(即脱嘌呤/脱嘧啶)核酸内切酶，以便将所述脱碱基位点转变成聚合酶可延伸的位点。然后，可以通过施加DNA聚合酶和荧光脱氧核苷酸对所述位点进行标记。
[0053]也可以标记单链断裂和脱碱基位点。这通过以下方式来实现:使用脱碱基核酸内切酶将不可延伸的单链断裂和脱碱基位点转变成聚合酶可延伸的位点。然后，使用者可以施加DNA聚合酶和荧光(或其它方式标记的)脱氧核苷酸来标记所述聚合酶可延伸的位点。
[0054]适当情况下，多核苷酸的延伸通过将所述多核苷酸与聚合酶和包括第一标记物的核苷酸(包括脱氧核苷酸)相接触来实现。标记物可以是荧光团、放射性粒子等。该标记可以通过将荧光探针与寡核苷酸的区段或特征相结合来实现。所述探针可以包括与所述寡核苷酸的一部分互补的一部分，并且使用者可以采取行动来暴露所述寡核苷酸的互补部分。所述标记物不一定与所述核苷酸直接连接，因为所述核苷酸本身可以包括这样的部分，该部分然后与标记物结合或与某些其它互补部分结合，所述互补部分与荧光团结合。
[0055]适当情况下，所述第一部分为能够支持聚合酶延伸的部分，例如3’_0H结构。以这种方式，使用者可以施加聚合酶和标记的核苷酸，以便将标记物整合在所述第一部分的位点处或附近(并且通 过在第一位点处或附近的延伸，所述位点继而对应于多核苷酸损伤或损害的位置)。所述标记物可以在损伤位点处，或者在距损伤位点1、5、10、15、20、50或甚至100个碱基的范围内。
[0056]然后，如本文中所述，使用者可以将包括所述标记物的多核苷酸的一部分线性化并对所述标记物进行成像或以其它方式可视化。这可以通过将多核苷酸在纳米通道内线性化来实现，如本文中别处所描述的。实现所述线性化也可以通过将所述多核苷酸的一部分(例如末端)固定于基底，然后通过施加梯度力(例如电位梯度)来拉长所述多核苷酸的一部分；或者甚至通过让其中悬浮有所述多核苷酸的流体蒸发，以便通过液滴不断前进的空气/流体界面前沿的作用来拉长所述多核苷酸。
[0057]适当情况下，对线性化形式的例如在纳米通道内的标记的、拉长的多核苷酸进行成像。该成像使得使用者能够对被布置在所述多核苷酸上的任何标记物进行定位。成像还使得使用者能够确定多寡核苷酸上是否存在具体的标记物。例如，使用者可以向所述多寡核苷酸引入在560nm波长下发荧光的探针，其中所述探针与特定的碱基序列互补。如果在成像步骤中未检测到该探针，则使用者会明白，在所述多寡核苷酸上不存在该探针的特定的捕获序列。
[0058]适当情况下，使用者可以表征所述多核苷酸的至少一种结构特征，例如对至少一种标记物在所述多核苷酸上的位置进行定位，确定两种或更多种标记物在所述多核苷酸上的相对位置，计算在所述多核苷酸的一定长度中的标记物数目，或者甚至确定含有所述多核苷酸的样品中存在的标记物的数目。
[0059]使用者还可以将所述第一标记物的存在或位置与所述多核苷酸的结构特性相关联，或者甚至将两种或更多种标记物的存在或位置与所述多核苷酸的结构特性相关联。作为一个实例，使用者可以根据所公开的方法处理多核苷酸。检测到标记物的存在指示使用者:所检查的多核苷酸含有一定的损伤。所述标记物定位在所述多核苷酸的更大的范围内指示使用者:所述损伤发生在所述多核苷酸内的特定位置处。例如，使用者可以确定标记物驻留在对应于特定基因的多核苷酸区域内，这继而提示，对象表达该特定基因的能力可能受损或改变。
[0060]使用者还可以确定，多种标记物的存在提示多个位置处的损伤。使用者可以使用不同的标记物(例如第一和第二荧光团，这些分子又在结构方面或甚至是在他们的激发和/或发射波长方面彼此不同)。以这种方式，使用者可以向不同的位置施加不同的标记物(例如，通过连续数轮施加聚合酶/核苷酸)，然后测定所述多核苷酸中这些标记物的存在。以这种方式，使用者可以确定多核苷酸上多个位点处存在损伤。
[0061]使用者可以基于纳米通道内成像的多寡核苷酸来构建数据集，以便分析每种包含多核苷酸的标记特征，以获得一组观测数据值。该信息可以包括关于所述多寡核苷酸上标记物的存在、标记物之间的间距、标记物的序列等的信息。然后，使用者可以基于这组观测数据值对所述多核苷酸进行表征。作为一个实例，使用者可以确定，在“正常”个体中隔开一定距离的标记物之间的间距提示该个体在这两种标记物的位置之间的基因中具有突变。使用者也可以确定，特定标记物的存在(相对于标记物的不存在)提示突变的存在。
[0062]不同的标记物可以被用于指示不同种类的损伤的存在。例如，如图2中所示，使用者可以测试多核苷酸中UV和氧化造成的损伤的存在。使用者可以在处理UV损伤位点期间整合第一标记物，并在处理氧化损伤位点期间整合第二标记物(在激发和/或发射特性方面与第一标记物不同)。通过测定这两种标记物的存在，使用者可以确定所述多核苷酸上UV和氧化损伤位点的存在和位置。
[0063]在一些实施方式中，在所述多核苷酸驻留在多孔基质例如琼脂糖或聚丙烯酰胺内的同时执行至少一部分的方法(例如，转变第一位点，产生用于支持延伸的部分)。例如，所述多核苷酸可以驻留在细胞内，所述细胞本身被布置在多孔基质内。可以将细胞裂解，并可以根据所公开的方法对所述多核苷酸(仍驻留在所述基质内)进行处理。或者，也可以从细胞回收(例如通过裂解)所述多核苷酸，然后将其布置在多孔基质内。通过处理在多孔基质内的多核苷酸，使用者可以避免与扩增和其它过程相关的流体处理步骤，所述流体处理可能引入会损伤所分析的多核苷酸的剪切力。作为所公开的方法的一部分，使用者可以消化(使用限制性内切酶)多核 苷酸。
[0064]在使用者采用了基质的实施方式中，使用者可以将所述多核苷酸的至少部分固定于所述基质，但这不是必需的。这可以通过生物素-亲和素配对、受体-配体反应、抗体-抗原反应等来实现。
[0065]可以通过照射所述标记物来实现对标记物进行成像。在荧光团标记物的情况下，使用者可以通过用具有荧光团的激发波长的光照照射所述标记物，然后用图像采集器例如CCD或CMOS装置采集从所述标记物反射的光照，来对所述标记物进行成像。
[0066]本公开还提供了系统。适当情况下，这些系统包含:样品台，其被配置成接收包含一个或多个纳米通道的流体芯片，所述纳米通道具有在Inm至约250nm范围内的特征性尺寸；光照源，其被配置成照射被布置在所述流体芯片内的样品；以及图像采集器，其被配置成采集照射后的被布置在所述流体芯片内的样品的图像。
[0067]在一些实施方式中，所述系统包含检测器，所述检测器能够检测从被布置在所述流体芯片内的样品反射的第一束光照。这样的检测器可以是CCD照相机、焦平面阵列、CMOS装置、光电二极管、光电二极管阵列、位置传感装置、EMCXD、(XD、PMT、雪崩光电二极管等。一个示例性布置如图13中所示，该图示出了示例性的自动聚焦系统，其中光照从光照源被递送至样品，从样品被反射回来，并被图像采集器采集。继而可以根据图像采集器上反射的光照的位置对样品的位置进行调整。2010年5月18日提交的专利申请PCT/US2010/035253 “用于动态确定样品空间取向并动态重新定位的装置和方法(Devices AndMethods For Dynamic Determination Of Sample Spatial Orientation And DynamicRepositioning)”中描述了示例性系统,所述专利申请的全部内容通过参考以其全文整合于此。所述系统可以包含检测器，所述检测器能够检测从被布置在所述流体芯片内的样品反射的第一束和第二束光照的位置；在这样的实施方式中，所述系统向样品施加两束或更多束光照。
[0068]可以通过控制器对所述台或流体芯片的位置进行调节，所述控制器被配置成根据从被布置在所述流体芯片内的样品反射的第一束光照的位置来平移所述台。如上所述，可以根据从样品反射到图像采集器的光照的位置来平移所述芯片。所述控制器可以使用从被布置在所述流体芯片内的样品反射的第一束或第二束光照中的至少一个的第一位置与第二位置之间的距离作为输入。
[0069]本公开的系统可以包含一个或多个光学滤波器。这种滤波器可以以存在于滤波器轮中或其它能够改变在位滤波器的装置中。滤波器被适当地布置在光照源与样品之间的光照路径中，以便所述滤波器可以被用于改变提供给被布置在所述流体芯片内的样品的光照的波长，或者过滤从样品反射的光照。
[0070]系统可以包含一个、两个或甚至更多个光照源。所述光照源可以是激光器、LED、白炽灯泡、紫外线源等。系统可以包含两个(或更多个)光照源，所述光照源被配置成提供不同波长的光照。通过使用这样的不同的光照源，或者通过使用光照滤波器，使用者可以向样品施加多种波长的光照，这继而提供了激发具有不同激发波长的标记物的能力。
[0071]系统还可以包含扩束器，所述扩束器被布置在光照源与样品之间的光照路径中。开普勒扩束器、伽利略扩束器等都适合于该目的。适合的光学部件可以购买自例如Thorlabs (www.thorlabs.com)和 Newport (www.newport.com)。扩束器的作用是将激发光散布在整个视场上。光束的扩展提供了均一的光照，使得能够均一地激发视场中的荧光团。
[0072]所述系统可以包含电场源或其它(例如压力)场源，其被配置成促使流体样品进入或位于所述流体芯片的纳米通道内。这样的场可以是静场或变场。所述系统可以被配置成根据使用者的要求施加所述场或者自动施加所述场，使得当流体芯片被放置到所述系统中时，所述系统施加所述场。
[0073]流体芯片可以包含一个或多个被布置在其上的标记。这种标记可以是条形码、图像、字母数字文本等。所述芯片包含的标记也可以本身是所述芯片的某种形状，例如，芯片的标志可以是形成在芯片中或芯片上的弯曲物、小钉(peg)、狭槽、或其它突起。所述系统可以包含适合于按照一个或多个被布置在流体芯片上的标记来配置所述系统的读取器或其它装置。例如，芯片可以包含特定的标志或标记，所述标志或标记指示所述芯片含有待评估UV损伤存在的样品或者已针对UV损伤评估被处理过的样品。所述系统继而可以根据芯片上的标记来进行自我配置，以便例如施加波长对应于在早先的处理期间被整合到多核苷酸样品中的荧光团标记物的激发波长的光照。
[0074]所公开的系统可以包含多种元件。提供了这些元件的示例性实施方式的描述。[0075]多个光照源
[0076]所述系统可以包含不同波长的多个光照(例如激光)源。每个源继而可以荧光激发具有不同光谱特性的荧光染料。激光器可以是相同或不同的类型，包括二极管泵浦固态激光器和二极管激光器。典型的波长跨越UV至红外的范围。非激光源例如灯和LED也可以被用作用于荧光成像的激发源。多种波长可以被用于照射在彼此不同的波长下发荧光或以其它方式可见的标记物或标签。例如，施加300nm和500nm的辐射将使得使用者能够对在这些波长中的一种波长下发荧光的探针(如果有的话)进行定位。以这种方式，使用者可以向样品施加不同的波长，以快速确定特定探针(例如与腺苷碱基连接的探针)是否存在或不存在于所述样品上或甚至特定的位置处。通过将不同的探针连接于不同的碱基，使用者于是可以适当地照射所述样品，以确定使用者试图整合到样品中的特定碱基的位置(或不存在)。
[0077]图9示出了纳米通道阵列内荧光标记的DNA的单分子成像(A)和随后的数据分析(B)。其证实了以剂量依赖性方式增加的标记密度以及用UVC辐射辐照的人类基因组DNA的降低的分子大小。在纳米通道阵列中分析后的UVC处理的样品还在脉冲场凝胶电泳(PFGE)凝胶上进行电泳(图C)以进行分子大小分布的比较，如该图中所示，该图示出了剂量依赖性大小分布数据。
[0078]光束的成形和高放大率
[0079]为了实现对纳米通道阵列的广泛区域的照射，所述系统还可以包含扩束光学器件，以扩展激光束的直径并更均一地照射视场。可以采用开普勒扩束器和伽利略扩束器两者。典型的扩展因子在IX至30X的范围内。根据需要，对于需要高激光强度的应用，可以施用束扫描光学器件。可以通过扫描镜、微反射镜、或本领域普通技术人员已知的其它光束偏转系统来进行束扫描。
[0080]宽场落射光 照
[0081]所公开的系统的一些实施方式的另一个特征是使用宽场落射光照以恒定地对发荧光的单分子进行成像。在许多单分子成像应用中，使用全内反射(TIRF)方案进行成像。在这样的方案中，入射的激发光以一定的角度照在成像平面上，所述角度仅允许一小部分的光穿透到样品区域中。
[0082]TIRF方法的结果是，成像平面远端(距离大于IOOnm)的材料(通常为液体，但不是在所有的情况下)不被激发，因此将不会促成任何背景信号。
[0083]TIRF系统是复杂的，并且难以正确对准。相反，落射光照系统不依赖于激发光的入射角度，因此更容易对准并且更稳定。由于纳米通道阵列的独特性质，所公开的系统利用这种方法。纳米通道阵列将分子和试剂局限在IOOnm以下的深度，这消除了对TIRF光照的需要。结合自动聚焦系统，所述系统具有稳定的能够可靠地提供高速单分子检测而不需要复杂或庞大的振动衰减的光学系统。这是在执行单分子检测时使用落射光照的一个重要优点，并且是由纳米通道阵列技术提供的。落射光照系统使得使用者能够从样品的同一侧进行照射和检测，其作用是降低进入检测器的激发光的量。
[0084]图12中示出了示例性的光照方案。如在该图的上部图中所示，在TIRF系统中，只有在消逝场内的物体被激发。这继而降低了来自于其它物体的背景信号，所述其它物体离消逝场太远而不能被激发。[0085]然而，所公开的系统可以利用标准的宽场光照。因为荧光物体(例如与多核苷酸连接的荧光标记物)被局限后接近于芯片或台的表面，因此，在所分析的特定分子的附近，来自于其它样品材料的背景信号非常少。如该图的底部图(所述图是含有多核苷酸样品的纳米通道阵列的正视图)中所示，纳米通道的作用是局限样品多寡核苷酸使其接近于芯片或台的表面。所述通道可以具有一定的尺寸，使得它们仅容纳单个多核苷酸。
[0086]自动聚焦系统
[0087]自动聚焦系统可以采用与多位置传感器偶联的独立的红外激光器来监测成像透镜与样品平面之间的距离。所述系统独立于系统的所有其它部件自主运行，并且可以执行初级聚焦(即找到正确的聚焦位置)，并在找到后追踪该聚焦位置。所述系统在IOOHz的频率下可以以IOnm的精确度进行调整，但这样的精确度不是必需的，因为IOOnm或者甚至1000或5000nm的精确度也是适合的。小于IOOHz (例如50Hz、20Hz、10Hz、或者甚至5或IHz)的频率是适合的。使用精确控制主成像透镜的移动的压电驱动器来实现这种精确的调整。自动聚焦系统可以适合于与纳米通道阵列一起工作；所述阵列的特定的几何形状产生必须被自动聚焦单元所接受的光学响应。低于IOOnm的特征并不少见。通过在物镜上方动态移动所述阵列，可以维持每个视场的锐聚焦，同时以1、10、20、50或100帧/秒的捕获速率进行成像。自动聚焦系统使得能够可靠稳健地进行样品的成像和图像分析。2010年5月18日提交的专利申请PCT/US2010/035253 “用于动态确定样品空间取向并动态重新定位的装置和方法”中示出了示例性系统，所述专利申请以其全文整合于此。
[0088]图13中示出了适合的自动聚焦系统的示意图。如该图中所示,用平行光(例如激光)照射样品，然后所述平行光从样品反射回来并被辐射检测器(例如CCD或CMOS装置)采集。然后，所述系统可以对检测器上反射束的位置与对应于最佳聚焦的光束位置进行比较，然后可以相应地移动样本台，使得反射束位于检测器上对应于最佳聚焦的位置上。
[0089]多色荧光检测
[0090]所述系统被设计成检测不同波长的荧光信号。多位置的高速滤波器轮使得能够区分多种(例如10种)荧光颜色 ，这使得能够进行多路传输。可以使用许多不同的荧光部分，包括有机荧光团、量子点、树枝状聚合物、荧光珠和金属点。所述系统可以提供单个荧光团水平的灵敏度；最佳配置将取决于荧光部分的性质和测定法的要求。这使得使用者在一些实施方式中能够检测样品中单个标记物(例如与碱基相连的荧光团)的存在。
[0091]高灵敏度照相机
[0092]所述系统还可以包含照相机来记录单独的荧光分子的图像。具有高量子效率的电子倍增CXD照相机覆盖荧光染色剂和染料的整个发射光谱，并被认为是特别合适的。虽然也可以容纳其它类型的照相机和检测装置，但性能和效率受损。照相机也可以被冷却至低于室温，以使热影响最小化并使电子噪音最小化。也可以使用约_20°C至约-100°C的温度来冷却照相机。对于在荧光灵敏度方面要求不高的应用来说，没有电子倍增能力的检测器是适合的。它们包括常规的CCD、CM0S检测器、光电倍增管和光电二极管。所述系统可以包含光子计数能力，该能力对于某些单分子分析应用来说是有用的。这种适合的装置的供应商包括 Princeton Instruments Cascade、Hamamatsu ImagM、Andor iXon 和 Neo SCMOS0
[0093]合
[0094]适当情况下，所述系统包含XY台，所述XY台在从一个视场移动到下一个视场时能够具有低于IOOnm的精确度，但是，在数十纳米、数百纳米或者甚至数千纳米范围内的精确度是适合的。所述台可以容纳纳米通道阵列芯片。在数据采集期间，所述台(在一些实施方式中)执行光栅扫描例程，在光栅扫描例程期间对部分或全部纳米通道阵列进行成像。可以采集多个图像，以便寻址整个纳米通道阵列。然后将这些图像拼接在一起，以生成整个阵列的复合视图。所述台的精确度使得能够将图像拼接在一起。拼接的图像使得能够检测比单个视场大的生物分子，即IMB的DNA片段。图11中示出了示例性图像，该图示出了多核苷酸的多个区域上存在各种不同的标记物的直观表示。各种多核苷酸片段例如可以是多核苷酸的消化产物。然后，通过检查处理后的片段中与不同类型的损伤对应的标记物的存在或不存在，可以评估每个片段中各种类型的损伤的存在或不存在。然后，使用者可以将各种片段组装成整个多核苷酸的内聚图，该图包含所述多核苷酸可能受到的各种类型的损伤的位置。
[0095]图11是示出了所公开的系统和方法的应用的示例性屏幕截图。在该视图中，左上角的两个文件夹图标1101允许使用者选择和上传各种文件(例如参考文件或样品数据文件)。中间的与“映射(map)”按钮1104相邻的三个堆叠窗口 1103表示与特定序列基序结合的酶例如切口酶、限制性核酸内切酶、归巢酶、甲基转移酶，或者甚至是特定序列基序本身例如CTCCAGC或其它序列。
[0096]紧邻在这些按钮下面的具有垂直灰条纹的水平条1105是具有理论灰度条形码的靶基因组区域(在左上角中上传的文件)的示意图，所述条形码反映了该区域的GC含量，GC含量较高则较暗，AT更丰富则较浅，等等。切换区域1106 (由两个较粗的竖条限定)可以沿着该区域滑动，被包围在该切换区内的区域被显示在下面的窗口中。使用者也可以使用控制按钮1113来沿着所分析的多核苷酸向前或向后移动。使用者也可以输入特定的目标碱基位置来设定待显示的区域并在更大的窗口 1116中放大。
[0097]三条水平线(1107、1108和1109)可以包含点(包括色点)或其它图标，所述点或图标显示，预测的标记/切割位点会分布在整个区域中，如果一个人在上面的窗口中选择了这些单独的酶/序列基序。在这些线1107、1108和1109下面的是三个按钮1110、1111和1112，每一个按钮都可以 被用于显示样品上的标记物数目，以便允许使用者评估所述样品上的标记密度。例如，如果使用者点击按钮1110，则窗口会显示高亮的基因组区域，显示出对应于该按钮的标记物的位置。这样的标记物可以表示来自于切口酶Nb.NbvcI的标记结果。通过点击另一个按钮(例如按钮1111)，使用者可以将源自于酶BspQI的标记可视化。
[0098]堆叠的片段1114表示从标记样品的图像产生的实际的数字化数据。所述系统可以以彼此全部或部分重叠对准的方式将样品的不同片段的签名图案(signature pattern)对准。然后，参比条1115可以显示出这种组合的映射出的信息。或者，这些可视化的“纳米叠连群”可以形成反映基因组区域的真实结构信息的一致的连续位置的签名图案。这也可以在从头测序的情况下为测序提供参考图，因为最初没有任何上传或可比较的参考序列文件。
[0099]具有用户友好型控制软件的触摸屏界面
[0100]所述系统可以包含图形用户界面。取决于使用者的需要，这样的界面可能遵从ISO13485和FDA 12 CFR 11指导方针。所述界面可以支持独立用户级别的登录。图形用户界面可以用于使用户交互最小化并简化运行方法设置。电阻式触摸屏可以用于将使用者的输入翻译成运行方法设置参数。运行方法和操作是使用者可定义的，并可以进行调整以适应具体的实验或应用，以允许简单比较类似运行的结果。可以在机分析运行结果，或者可以将数据导出以进行存档或在独立的计算机工作站上进行详细分析。
[0101]用于运行期间高通暈图像获取的定制的微控制器
[0102]起到从动机件作用的独立的微控制器可用于管理高速图像捕获所必需的事件并使其同步化。该控制器可以起到使激光器与照相机曝光同步的作用，并确保滤波器轮和XY台在图像被捕获后立即响应。该微控制器可以将由使用者输入的运行方法参数解译成一系列可执行命令。这些命令提供了采样电压加载条件、激光序列顺序、以及激光脉冲持续时间、扫描重复次数等。
[0103]具有定制的控制软件的机载计算机
[0104]软件应用程序可以在机载计算机上运行，其中所述应用程序起到微控制器从动器件的主控机件的作用。定制的软件应用程序翻译使用者的运行方法输入和数据分析参数，并为子组件部件的直接交互提供管道。取决于使用者的需求，该软件应用程序在适当情况下可以遵从ISO 13485和21 CFR 11。
[0105]电极束和蒸发控制
[0106]在某些情况下，纳米通道样品储库的蒸发可以影响运行结果。电极束可以用于减轻和控制样品储库的蒸发。
[0107]样品与运行缓冲液一起被荷载到储库中以实现纳米通道的分子荷载。使用电场来荷载样品，因为它们携带正或负的电势。作为运行方法的一部分，电场样品荷载是由使用者输入的，并受到微控制器的控制。E场荷载参数可以为带正电或带负电，由所荷载的样品的净电荷决定。在某些情况下，以0.1VDC的增量对它们进行优化，但也可以使用更高的分辨率。优化考虑的变量包括样品净电荷、样品长度和分子组成，并且使用者可以根据需要为每种分子物质设定特定的E场 荷载参数。所述系统可以被配置成在需要时添加附加的缓冲液或其它溶液，以便在所述系统内维持或获得特定的流体含量。在一个实施方式中，电极得到嵌套于流体芯片或以其它方式与流体芯片接合的特氟隆(Teflon)区块的支持。该嵌套行为提供了电极和芯片储库之间的密封，起到最大限度地减少与周围环境的相互作用的作用。以这种方式，使蒸发到环境中的损失最小化。可以通过浸没在样品输入和输出孔中的电极来施加电场。在固定的时间内适当地施加在0.1-100V范围内的电压，所述时间可以在0.1s至数分钟的范围内。标准的运算放大器(op-amp)被用于施加电压，并受到微控制器的控制。
[0108]用于非束缚型分子的单分子成像的宽场光照
[0109]现有的单分子成像方法依赖于全内反射(TIRF)来获得单分子灵敏度。在这种配置中，激发光以一定的角度(TIRF角度)入射，在成像平面的表面附近产生电磁消逝场。该消逝场通常延伸至成像平面上方lOOnm。任何暴露于该消逝场的荧光部分都被荧光激发，从而产生可以使用适合的荧光检测器检测到的发射光。在该消逝场范围之外的荧光物体不被激发，因此不促成背景荧光信号。
[0110]然而，TIRF具有数种缺点。首先，该光学器件对对准敏感。入射光必须以正确的角度撞击在样品上，否则不会产生消逝场。其次，在有限体积内的物体可以被检测到，这往往需要将物体束缚到所述表面上，以阻止它们通过热扩散从成像平面向外迁移。这需要附加的化学或物理束缚机制。
[0111]所公开的系统使用纳米通道阵列来操作，以允许使用标准的宽场成像进行单分子检测。纳米通道阵列被用于将荧光部分(或其它标记的部分)局限在成像平面附近。正因为如此，几乎不可能有来自于其它部分的背景荧光。这消除了对TIRF成像的需要，继而使得光学系统更简单和更稳定。此外，由于分子受到限制而不能从成像平面向外扩散，因此，荧光部分不需要被束缚到表面上。
[0112]因为在所公开的系统上对样品进行成像，所以所述系统的另一个特征是整合了能够与纳米通道装置和阵列一起工作的自动聚焦系统。自动聚焦系统使用与主激发激光器共线的附加的激光器。这允许将该子系统与主成像部件集成。此外，自动聚焦系统可以被特别对准，以与在所公开的系统上成像的纳米通道阵列一起工作。其它自动聚焦系统通常被设计成与无特征的玻璃基底一起工作，既不会与系统中的其它部件直接集成，也不能适应纳米结构化的表面例如纳米通道阵列的表面。
[0113]高速自动操作
[0114]所公开的系统能够适应具有单分子灵敏度的高速成像。滤波器轮、照相机、XY台和激光器被适当地选择并配置成允许以10、20、30帧/秒或甚至更高的频率进行成像。适合的台可得自例如 Aerotech、Physik Instrumente 和 Applied Scientific Imaging。适合的滤波器轮可得自例如 Sutter Instrument Company> Finger Lakes Instrumentation和 Applied Scientific Imaging。适合的激光器可购买自例如 Cobolt AB、Crystal Laser和其它光学设备厂商。每个单独的装置的速度可以由微控制器进行协调，所述微控制器对成像例程期间的各种操作进行排序。在一个实施方式中，为了获取图像，XY台移动至目标视场，此时，触发激发激光器，并且照相机被设置用于图像获取。重复该光栅型顺序，直至已对整个纳米通道阵列进行成像。
[0115]然后，将成像速度与由电极束提供的自动荷载顺序偶联。使用用于目标样品的合适的电压(例如在-30V至+ 30V的范围内)，样品被荷载到准备用于成像的阵列中。然后可以在每个成像扫描后重复荷载顺序，继而允许快速的数据采集。作为实例，当使用双链DNA时，可以获得高达IGbp/分钟的成像DNA的数据获取速率。事件的自动化和自主排序提供了易于使用且只需要最少的用户干预和最少的维护的平台。所述系统还适应纳米通道阵列的自动荷载以及样品的自动分配。这允许与机器人系统集成，进一步提高分析的通量和整体速度。
[0116]容纳的样品种类
[0117]在可以容纳广泛的样品类型的意义上，所述系统还被设计成开放的平台。适合的样品包括生物样品，例如DNA、RNA、蛋白质、生物聚合物和包含这样的物质的其它复合物。也可以分析其它大分子例如聚合物、树枝状聚合物、寡聚物等。当样品或样品分析可能需要特定的环境条件例如加热或冷却时，根据样品类型和具体要求也可以适应这样的要求，因为加热器、冷却器和流体/气体源也可以被整合到所公开的系统中。
[0118]图14中示出了示例性系统。该图(上部图)示出了系统的外部视图，所述外部视图包括机箱(其围住各种系统模块和单元)和触摸屏控制器，所述触摸屏控制器可用于将用户输入提供到系统中，并且还用于展示由系统收集的数据。
[0119]图14的底部图示出了示例性系统的内部视图。如该视图中所示，所述系统可以包含样品台，所述台与具有纳米通道的芯片或其它基底接合。所述台可以根据从样品反射的光照进行移动。所述系统可以包含条形码读取器，所述读取器可以读取来自于流体芯片上存在的条形码或其它标记的信息，所述信息可被用于配置所述系统的一个或多个方面，例如光照波长。所述系统还可以包含e场探测器臂，所述探测器臂可以用于传感或者甚至向被布置在所述流体芯片内的样品施加电场(或者将样品吸取到芯片中)。可以使用一个或多个激光器向所述样品施加光照，并可以使用滤波器轮来过滤施加或反射的光照。照相机的作用是采集从样品反射或发射的光照。插件箱含有各种处理和控制单元。
[0120]可以通过粘合标记物的方式将条形码施加到芯片，或者在某些情况下，将条形码直接印刻在流体芯片上。当所述系统读取条形码时，例如可以确定(a)芯片是否已被使用过；以及(b)芯片是否被设计成支持特定的测定法。
[0121]图15示出了示例性系统的部件的详细视图。在该图的右上角示出了两个激光器(523nm和473nm)。这些波长不是强制性的，并且使用者可以根据需要使用激光器或其它光照器。来自于激光器的光照在反射镜和分色镜之间传送，并可以被传送通过扩束器。示出了说明性的14x扩束器，但是当然也可以使用其它扩束器。潜望镜被用于引导到达或来自于样品的光照束，所述样品被置于物镜的上方。管式透镜可用于朝着示出在该图右下方的EMCXD照相机传送光照。
[0122]滤波器轮和潜望镜可用于只向照相机提供某些波长，从而使得照相机能够对不同的标记物进行成像、可视化或在不同的标记物之间进行区分。可以将滤波器轮机动化，以便能够将一个或多个滤波器快速置于所述系统的光学路径中。作为一个非限制性实例，滤波器轮可以包括由具有光学编码器的步进电机驱动的多位置旋转轮。典型的滤波器会包括电介质涂覆的玻璃，所述玻璃提供了低通或高通的带通来过滤荧光光照。典型的中心波长在可见光谱(400-700nm)内，但不限于该范围。在带通滤波器的情况下，典型带宽为30_60nm，但也可以是其它范围。
[0123]图16提供了图15中示出的系统的可选视图。在该图的右侧示出了 532nm激光器头部。激光器头部位于EMCCD照相机后面(在该视图中)。所述照相机与滤波器轮光学连通。
[0124]在该视图中，在该图的左侧示出了物镜，所述物镜被置于所述台的上方。适当情况下，所述台可在z方向上移动，以便将样品放置到用于成像的焦距中。如本文中别处所描述的，所述台的移动适当地由控制器调节，所述控制器基于自动聚焦系统来致动所述台。
[0125]如图16的左侧所示，可以有自动聚焦分色镜，所述自动聚焦分色镜被放置成将从样品反射的光照引导至自动聚焦传感器。自动聚焦部件中使用的光照可以在红外区中，如由自动聚焦模块中存在的IR激光器单元所示的。IR光照不是必需的，因为也可以使用利用其它波长的光照。自动聚焦棱镜可以弓I导到达或来自于传感器或检测器的光照。
[0126]基于反射的光照在自动聚焦传感器或检测器上的位置，所述系统可以向上或向下移动所述台(和样品)，以将样品放置到最佳焦距中。如例如2010年5月18日提交的专利申请PCT/US2010/035253 “用于动态确定样品空间取向并动态重新定位的装置和方法”(通过参考以其全文整合于此)中所描述的，自动聚焦系统可以记录检测器上对应于从处于最佳焦距处的样品反射的光照的参考点，然后调整所述台的位置，以便将反射的光照维持在该参考点处。
[0127]例如，使用者和系统可以确定，当样品在最佳焦距中时，从IR激光器产生的和从样品反射的IR辐射束在xl，yl位置处照在自动聚焦检测器上。如果在处理期间，光束在x2，y2位置处照在检测器上，则系统可以向上或向下平移所述台(或者甚至可以倾斜所述台)，以便将检测器上的光束照射位置返回到xl，yl。
[0128]图16中示出的视图还示出了反射镜和示例性管式透镜(被示出在该图的底部)，其用于将来自于照射后样品的光照引导至滤波器轮和EMCCD装置。可以将潜望镜布置用于将来自于管式透镜的光照引导至滤波器轮区域以及EMCCD照相机。
[0129]图17示出了本公开的操作的示例性顺序。如该图中所示，使用者可以通过将纳米通道阵列(例如以筒(cartridge)或芯片的形式)荷载到分析仪系统中来开始进行。然后可以将样品荷载到纳米通道(适当情况下为流体形式)中。然后可以将电极束用于将样品荷载到所述阵列中。由于多核苷酸可以带电或者可以包含一个或多个带电基团，因此，施加电场可以起到将样品荷载到通道中的作用。使用本文中所述的自动聚焦方法、专利申请PCT/US2010/035253中描述的方法、或通过本领域普通技术人员已知的其它适合的自动聚焦方法，将所述系统的成像部件适当地聚焦到所述样品上。
[0130]然后使用光照源(例如激光器)从一种或多种标记物来产生荧光，接着所述荧光被图像采集器采集到。然后，所述台、光照源、或两者可以移动，以便照射所述台的不同部分以及不同的样品，并且所述系统收集来自于该下一个样品的信息。所述系统可以对给定样品的任意或全部视场进行成像。
[0131]本公开提供了其它方法，所述方法包括将多核苷酸中的第一单链断裂与碱性磷酸酶相接触，以便产生能够支持聚合酶延伸的第一部分；将所述部分与聚合酶和标记的核苷酸相接触，以便将标记物整合到多寡核苷酸中；通过将第一标记物局限在纳米通道内来将所述多核苷酸的至少一部分线性化；以及对所述第一标记物进行成像。
[0132]可以使用多种碱性磷酸酶；虾碱性磷酸酶被认为特别适合于所公开的方法。在本文中别处描述了适合的线性化和成像方法。如本公开中所述，使用者也可以将标记的核苷酸(或多种标记的核苷酸)的存在或位置与所述多核苷酸的结构特性相关联。
[0133]本文中公开的其它方法包括向多核苷酸中的单链断裂施加具有3’至5’核酸外切酶活性的DNA聚合酶，以便将不可延伸的单链断裂转变成聚合酶可延伸的位点；以及施加DNA聚合酶和标记的脱氧核苷酸，以便将标记物整合到所述多核苷酸中。适合的标记物被描述在本文中别处，并包括荧光团(例如荧光素、Υ0Υ0、德克萨斯红等)。这种技术可以用于标记非0H-3’修饰。各种荧光团可得自Fisher和Sigma化学品供应商以及分子探针公司(Molecular Probes) (www.mo I ecu larprobe s.com)。基本上在不存在游离核苷酸或甚至游离脱氧核苷酸的条件下适当地施加所公开的方法的聚合酶。
[0134]本公开还提供了其它方法，所述方法还包括:将具有脱碱基位点的多核苷酸布置在多孔基质材料内；将所述多核苷酸与碱性材料相接触，以便将所述脱碱基位点转变成所述多核苷酸中的单链断裂，以便将所述多核苷酸中的单链断裂转变成所述多核苷酸中的双链断裂，或两者；将所述多核苷酸中的单链断裂、所述多核苷酸中的双链断裂、或两者转变成能够支持聚合酶延伸的部分；将所述部分与聚合酶和标记的核苷酸相接触，以便将一种或多种标记物整合到所述多核苷酸中。然后，如本文中别处所述，使用者可以对所述一种或多种标记物进行成像或者以其它方式进行定位或检测。
[0135]有了这些信息，使用者可以进一步将一种或多种标记物的存在或位置与所述多核苷酸的结构特性相关联，如本文中别处所描述的。在所公开的方法或系统的任一种中，使用者可以进一步将所述多核苷酸的结构信息与损伤状态或甚至疾病状态相关联。
[0136]在一些实施方式中，可以将所述多核苷酸布置在细胞内。继而可以将所述细胞裂解，以便释放出所述多核苷酸。使用者可以扩增所述多核苷酸，消化所述多核苷酸，或前述的任一种。可以将细胞、多核苷酸或两者布置在多孔基质材料内。可以通过将所述单链断裂与具有3’磷酸二酯酶活性的核酸内切酶相接触来实现转变所述多核苷酸中的单链断裂。
[0137]使用者可以至少部分分解所述基质材料，以便释放出所述多核苷酸。可以在所述多核苷酸驻留在多孔基质内的同时对它进行处理，或者可以在所述基质外对它进行处理。如本文中别处所描述的，多孔基质的使用可以减少或甚至消除流体处理步骤，所述流体处理步骤产生可能继而损伤所述多核苷酸的剪切力。此外，如本文中别处所描述的，使用者可以对一种或多种标记物进行成像并将成像的标记物与所述多核苷酸的结构特性相关联。应当理解的是，“成像”不要求将所分析的多核苷酸的图像或其它描绘显示在监视器或其它装置上供使用者观察。相反，术语“成像”应理解为是指采集从标记物反射或发射的光照。对所采集的光照的进一步处理可以包括构建视频或其它图像，其使得使用者能够观察标记物在所述多核苷酸上的位置。
[0138]本文中提供的其它方法包括将多核苷酸布置在多孔基质材料内；将多核苷酸上的第一位点转变成能够支持聚合酶延伸的第一部分；在所述第一部分处实现延伸，以便将第一标记物整合在所述第一位点处或附近；通过将所述第一标记物局限在纳米通道内来将所述多核苷酸的至少一部分线性化；以及对所述第一标记物进行成像。如本文中别处所描述的，使用者可以将成像的标记物与所述多核苷酸的结构特性或甚至所述多核苷酸的供体的损伤或疾病状态相关联。可以将所述多核苷酸布置在细胞内，所述细胞可以被裂解，也可以将所述细胞布置在多孔基质内。使用者可以进一步(a)将所述细胞裂解以便释放出所述多核苷酸，(b)扩增一部分或全部所述多核苷酸，(C)消化所述多核苷酸，或者甚至是上述操作的某些组合。使用者也可以至少部分分解所述基质，以便释放出所述多核苷酸。这可以通过热暴露、光暴露、化学暴露、微波或通过可用于分解基质材料的其它方法来实现。
[0139]可以通过将第一 位点与N-糖基化酶相接触来实现转变所述第一位点。适合的N-糖基化酶被描述在本文中别处。可以通过将所述多核苷酸与聚合酶和包含所述第一标记物的核苷酸相接触来实现延伸，如本文中别处所描述的。如上所解释的，使用者也可以将一种或多种标记物的存在或位置与所述多核苷酸的结构特性相关联。
[0140]本公开的适合的试剂盒包含一定量的N-糖基化酶；一定量的脱嘌呤/脱嘧啶裂解酶、3’ -磷酸二酯酶、或两者；一定量的聚合酶；以及一定量的标记的核苷酸。
[0141]适合的试剂被描述在本文中别处。所述试剂盒的试剂可以被布置在包装内，所述包装适合于与能够实现分配所述试剂盒的试剂中的一种或多种的装置接合。作为一个实例，所述试剂盒可以包含上述试剂的小袋，然后所述试剂盒可以被插入到所述系统的接收器中，其中所述接收器被配置成向适合的小袋施加压力以便将适合的试剂施加到样品。所述试剂盒可以包含入口和出口端口，所述端口可以用于将试剂传送进入或传送出所述试剂盒。
[0142]本公开的其它试剂盒包含一定量的碱性材料；一定量的脱嘌呤/脱嘧啶裂解酶、3’ -磷酸二酯酶、或两者；一定量的聚合酶；以及一定量的标记的核苷酸。这些试剂盒可以用于执行本文中别处所描述的方法，所述方法包括在损伤的多核苷酸上形成聚合酶可延伸的位点。
[0143]本文中还提供了可选的系统。适当情况下，这些系统包含:试剂盒，其包含(a) —定量的聚合酶，(b) —定量的标记的核苷酸，以及(C) 一定量的脱嘌呤/脱嘧啶裂解酶、3’_磷酸二酯酶、或核酸内切酶IV中的一种或多种，所述试剂盒适合于与样品成像仪接合，所述样品成像仪包含样品台，所述样品台适合于与含有一个或多个纳米通道的流体芯片接合；光照源，其能够与被布置在所述流体芯片的纳米通道内的样品光学连通；图像采集器，其能够采集照射后的被布置在所述纳米通道内的样品的图像。
[0144]本文中公开的其它方法还包括:将多核苷酸包括至少一种标记物的区域线性化，所述标记物已通过聚合酶延伸被整合到所述多核苷酸中，所述聚合酶延伸在从脱碱基位点、单链断裂、或两者转变而来的部分上执行。
[0145]整合和转变方法被描述在本文中别处。所述方法还可以包括对所述至少一种标记物进行成像。可以通过本公开中提出的其它方法来实现线性化，所述方法包括将多核苷酸含有至少一种标记物的区域局限在纳米通道内。然后，使用者可以将一种或多种标记物的存在或位置与所述多核苷酸的结构特性相关联。使用者还可以将所述标记物的存在或位置或者甚至所述多核苷酸的结构特性与疾病或所述多核苷酸的损伤状态相关联。
[0146]本公开还提供了方法，所述方法包括:将标记物整合在多核苷酸上的损伤位点处或附近；将多核苷酸包括所述标记物的区域线性化；以及对所述标记物进行成像。使用者可以确定所述多核苷酸上两种或更多种标记物的存在、间距、或两者。然后，使用者可以将一种或多种标记物的存在或位置与所述多核苷酸的结构特性相关联。使用者还可以将所述标记物的存在或位置或者甚至所述多核苷酸的结构特性与疾病或所述多核苷酸的损伤状态相关联。
[0147]通过将损伤位点转变成能够支持聚合酶延伸的部分来适当地实现标记物整合。所述转变可以包括将所述损伤位点转变成中间体。所述中间体继而通过一个或多个步骤被转变成能够支持聚合酶延 伸的部分。
[0148]本公开还提供了可选的系统。适当情况下，这些系统包含:基底，其被配置成接收流体芯片；光照器，其被配置成照射被布置在所述流体芯片内的多核苷酸样品；以及图像采集器，其被配置成采集来自于被布置在所述流体芯片内的多核苷酸样品的图像。
[0149]这些系统(以及本文中公开的其它系统)可以包含使得所述光照器与被布置在所述流体芯片内的样品光学连通的光学介质。所述光学介质可以是光纤、透镜、反射镜等。所述系统还可以包含一个或多个滤波器，所述滤波器能够改变由所述光照器供应给所述多核苷酸样品的光照的波长。
[0150]系统还可以包含能够与被布置在所述流体芯片内的多核苷酸样品连通的梯度源。所述梯度源可以包含压力源、电势源、电流源、磁场源、或其任意组合。所述光照器可以是激光器、LED或本领域普通技术人员已知的其它光照源。所述系统可以被配置成向所述多核苷酸样品施加两种或更多种波长的光照，如本文中别处所描述的。
[0151]因此，本公开提供了评估DNA损伤的方法。基于下游测序测定法中的成功或失败，这些方法还包括将检测到的DNA损伤与基因组DNA质量相关联。该评估可以通过将所分析的损伤的DNA的标记物分布情况(即标记物的位置和标记物的类型)与对照DNA的标记物分布情况进行比较来实现。例如，使用者可以将DNA样品(即可能损伤)的标记物分布情况与对照(未损伤)DNA样品的情况进行比较，以确定样品DNA是否含有任何损伤位置。
[0152]使用者还可以评估用于测序或其它测定法的基因组文库和cDNA文库的质量(包括DNA损伤程度)。这包括测定文库插入片段的大小、片段大小分布、片段大小均匀性以及文库DNA的损伤，例如双链断裂、单链切口、脱碱基位点、碱基损害、DNA加合物、片段末端质量评估(用于衔接子连接、载体连接等)。使用者可以通过将测定文库DNA片段的骨架标记和/或这些片段中DNA损伤特异性位点标记所衍生出的数据相关联来评估文库或单个克隆的质量。
[0153]所公开的系统使得使用者能够在单个分子上以及在一个分子接着一个分子的基础上以并行的形式鉴定和分析小生物样品(例如DNA)。所述系统提供了大分子的高分辨率分析，这继而使得能够在生命科学研究、临床研究、诊断学和个体化用药领域中执行多种(且新的)应用。
[0154]典型的复杂基因组由多倍体的染色体DNA组成。每个个体的染色体可以在数十万至数亿个碱基对长度的范围内。这些分子可以被概念化为半柔性生物聚合物，当从细胞中提取出来时，所述分子在溶液中形成球样无规则卷曲。
[0155]所公开的方法使用纳米通道可以将天然状态的基因组DNA片段(和其它聚合物分子)解开、分选、拉长和/或局限成有序的线性形式。该技术不需要前端扩增或将样品DNA剪切成小片段，因此保存了有临床价值的基因组结构信息例如拷贝数变异(CNV)、均衡损害(balanced lesion)或其它这样的基因组重排和特征。由于该技术的单分子分析能力，因此，只需要微量的样品，这代表了与其它基因组分析平台的改变。
[0156]示例性实施方式
[0157]下面是所公开的方法和系统的示例性实施方式。这些实施方式仅仅是说明性的，不应被解读为限制本公开的 范围。
[0158]在纳米通道阵列中检测DNA大小分布
[0159]在 IvI旲型系统中，使用各种DNA样品制备试剂盒来制备DNA样品，包括使用Gentra PureGene?试剂盒的口腔拭子DNA,使用Gentra PureGene?试剂盒的培养细胞DNA,以及使用Easy DNA?试剂盒的培养细胞DNA。
[0160]图3中示出的三种样品在脉冲场凝胶上表现出不同的大小分布。不受限于任何单一理论，这种大小分布差异是由于纯化诱导的双链断裂(DSB)形式的损伤。纯化诱导的DSB可以通过分析在纳米通道阵列内成像的DNA的大小分布来进行评估，如本文中别处所描述的。可以基于质量中心朝着更低的DNA长度的位移、超过一定长度的DNA分子百分数的降低、或甚至在一定长度范围之间的DNA分子百分数的降低来对DSB进行定量(图3)。
[0161]在纳米通道阵列中检测由UV损伤造成的DNA双链断裂。
[0162]DNA的UV辐射不仅引起最丰富的诱变性和细胞毒性DNA损害中的两种，例如环丁烷嘧啶二聚体(CPD)和6-4光化产物(6-4PP)以及它们的杜瓦价异构体，这样的暴露也可以产生双链和单链DNA断裂。因为由UV辐射造成的双链DNA断裂，损伤DNA分子的长度分布会位移至更短的长度，继而可以从DNA长度测定结果推断出双链断裂的量。
[0163]在纳米通道阵列中检测由UV损伤造成的单链断裂:
[0164]如上所述，可以在纳米通道阵列中测定由UV辐射造成的单链DNA断裂。在一个实施方式中，人们可以通过DNA聚合酶的作用将荧光染料核苷酸整合在这些断裂位点处，所述聚合酶的作用是将标记的核苷酸整合在断裂位点处。然后，标记的DNA分子在纳米通道阵列中被拉长(例如成为线性形式)，并可以使用荧光显微镜对其进行单独成像。通过确定这些荧光标记物沿着DNA骨架的位置，可以准确建立单链断裂的分布和密度。
[0165]在纳米通道阵列中用T4核酸内切酶V和vent聚合酶检测UV诱导的环丁烷嘧啶二聚体。
[0166]UV辐射引起最丰富的诱变性和细胞毒性DNA损害中的两种:环丁烷嘧啶二聚体(CPD)和6-4光化产物(6-4PP)以及它们的杜瓦价异构体。然而，T4核酸内切酶V作为碱基切除修复途径的一部分而起作用，识别并去除嘧啶二聚体。然后，该酶切割所述二聚体的5’嘧啶的糖基键和3’磷酸二酯键，这继而在DNA中产生SSB。所得切口位点在DNA分子的3’末端处含有游离OH基团，然后可以使用Vent (或其它)聚合酶将荧光核苷酸整合在断裂位点处。然后，标记的DNA分子在纳米通道内被拉长，接着使用多色荧光显微镜对其进行成像。
[0167]通过确定一种或多种荧光标记物沿着DNA骨架的位置，可以准确建立UV诱导的环丁烷嘧啶二聚体的分布和密度(图4)。此外，被转变成SSB的空白(frank)DSB和由群集UV损伤造成的DSB可以通过产生分子长度大小分布来测定(图4)。对受到UVC损伤的DNA进行类似的大小分布评估，但是是与UVDE (UV损伤核酸内切酶)进行温育(图5)。该分布证实分子大小方面对损伤的剂量响应。
[0168]应当理解的是，荧光成像不是可以检测核苷酸的唯一方式。也可以用放射性材料例如同位素标记核苷酸，所述放射性材料继而可以在核苷酸被整合到多核苷酸样品后进行检测和定位。荧光成像被认为是特别适合的。
[0169]被核酸内切酶IV和vent聚合酶识别和标记并在纳米通道阵列中被检测到的损伤
喊基: [0170]核酸内切酶IV可以作用于DNA中的多种氧化损伤。该酶被表征为脱嘌呤/脱嘧啶(AP)核酸内切酶，其会水解DNA中完整的AP位点。在损害位点5’侧的第一个磷酸二酯键处切割AP位点，留下3’端的羟基基团和5’端的脱氧核糖5’磷酸酯。该酶还具有3’ 二酯酶活性，并可以从DNA的3’末端释放磷酸糖醒(phosphoglycoaldehyde)、完整的脱氧核糖5-磷酸酯和磷酸酯。
[0171]被甲酰胺基嘧啶DNA糖基化酶(FPG)和vent聚合酶识别和标记并在纳米通道阵列中被检测到的损伤碱基。
[0172]甲酰胺基嘧啶DNA糖基化酶是DNA碱基切除修复(BER)途径修复酶的成员。FPG起到N-糖基化酶和AP-裂解酶两种作用。FPG识别并切除来自于双链DNA的损伤碱基，并水解N-糖基键，产生脱嘌呤/脱嘧啶(AP)位点。该酶切割AP位点的3’和5’磷酸二酯键，在DNA中产生间隙，留下3’和5’ -磷酸酯末端。FPG鉴别并去除许多具有诱变可能的修饰后的碱基，包括:8_氧鸟嘌呤、8-氧腺嘌呤、甲酰胺基嘧啶(FapyA、FapyG、甲基-fapy-鸟嘌呤、黄曲霉毒素Bl-fapy-鸟嘌呤)、5_羟基胞嘧啶、5_羟基尿嘧啶和开环的N_7鸟嘌呤加合物(7-甲基鸟嘌呤)。
[0173]被核酸内切酶III和vent聚合酶识别和标记并在纳米通道阵列中被检测到的损伤喊基。[0174]核酸内切酶III是能够去除以下嘧啶损害而产生AP位点的N-糖基化酶:尿素、5，6- 二羟基胸腺嘧啶、胸腺嘧啶二醇、5-羟基-5-甲基乙内酰脲、尿嘧啶二醇、6-羟基_5，6- 二氢胸腺嘧啶和甲基羟丙二酰脲。核酸内切酶III与核酸内切酶IV、Vent(eX0-)聚合酶和荧光核苷酸的组合可以沿着DNA骨架标记氧化嘧啶损伤位点以及由单链断裂(SSB)和脱嘌呤/脱嘧啶(AP)位点组成的位点。通过沿着DNA骨架确定荧光标记物，可以准确建立氧化嘧啶的分布和密度(图6b)。此外，被转变成SSB的空白DSB和由群集氧化嘧啶损伤造成的DSB可以通过分子长度的大小分布来测定(图6a)。
[0175]使用碱来处理包埋有DNA的凝胶团块，提高对脱碱基位点形式的损伤碱基的灵敏度，所述损伤碱基然后可以被核酸内切酶IV和vent聚合酶识别和标记并在纳米通道阵列中被检测到。
[0176]在可选的基于细胞的DNA损伤测定法(图7)中，碱性溶液可以用于将损伤诱导的脱碱基位点转变成单链断裂(SSB)而无需酶活性的协作。然而，用碱转变脱碱基位点所产生的SSB (以及大多数空白SSB)可能不一定能被聚合酶延伸。如本文中别处所述，核酸内切酶IV具有3’磷酸二酯酶活性，该活性继而允许将显著比例的具有3’阻断基团的不可延伸SSB转变成聚合酶可延伸的切口位点，可以在聚合酶延伸期间使用荧光核苷酸对所述切口位点进行荧光标记。
[0177]碱处理还具有通过DNA骨架的局部碱诱导的变性将间隔紧密的SSB转变成DSB的效应——产生用于检测损伤诱导的双链断裂(DSB)的更灵敏的测定法。将细胞包埋在琼脂糖中以得到纯化的DNA，消除了与DNA的直接处理例如移液管吸取相关的可导致片段化的剪切力，这允许改善对真正损伤诱导的片段化的检测。此外，多孔凝胶基质允许缓冲液交换，以便促成碱处理后的后续酶反应所必需的合适的缓冲条件。在图8中，使用过氧化氢作为氧化损伤剂来演示基于细胞的氧化测定法。处理与未处理细胞的原始DNA大小的直方图(图8)证实，与未处理的对照相比，从过氧化氢处理的细胞纯化的DNA明显位移至更小的片段大小。过氧化氢处理后的DNA平均大小和标记物整合密度(图8B)分别证实DSB和SSB形式的明显的氧化损伤检 测。
[0178]图10示出了用于评估氧化损伤的示例性分析途径。在氧化损伤中，氧化应激的最显著的结果被认为是DNA修饰，DNA修饰可以导致突变和基因组不稳定性。在DNA中形成的氧化产物包括链断裂、少碱基的糖或AP (脱嘌呤脱嘧啶)位点、以及氧化的碱基。如该图中所示，标记物(例如荧光标记物)可以被整合在氧化损伤位点处，随后可以对所述标记物进行成像。
[0179]如图所示，在一种氧化损伤标记化学中，核酸内切酶III是能够将氧化的嘧啶转变成脱嘧啶(AP)位点和不可延伸的单链断裂(SSB)的N-糖基化酶。核酸内切酶IV继而用于将AP位点和不可延伸的SSB转变成含有能够聚合酶延伸的3’ -OH的单链断裂。然后，通过DNA聚合酶将荧光标记的核苷酸整合在碱基损伤位点处，并在纳米通道阵列内进行成像，以通过标记物密度和分子长度分布测定DNA损伤。
[0180]附加材料
[0181]其它公开内容参见下列专利申请文件，其中每个专利申请文件出于所有目的通过参考以其全文整合于此。2007年7月19日提交的专利申请PCT/US2007/016408 “纳米喷嘴装置阵列:它们的制备和用于大分子分析的应用(Nanonozzle Device ArraysiTheirPreparation And Use For Macromolecular Analysis)，，、2008 年 3 月 28 日提交的专利申请PCT/US2008/058671 “使用纳米通道阵列分析大分子的方法(Methods OfMacromolecular Analysis Using Nanochannel Arrays)，，、2009 年 6 月 5 日提交的专利申请PCT/US2009/046427 “集成纳米流体分析装置和相关方法(Integrated NanofluidicAnalysis Devices And Related Methods)”、2009 年 6 月 30 日提交的专利申请 PCT/US2009/049244 “用于单分子全基因组分析的方法和装置(Methods And Devices ForSingle-Molecule Whole Genome Analysis)”、2009 年 11 月 19 日提交的专利申请 PCT/US2009/064996“多核苷酸作图和测序(Polynucleotide Mapping And Sequencing) 2010年5月18提交的专利申请PCT/US2010/035253 “用于动态确定样品空间取向并动态重新定位的装置和方法”、2010年9月27日提交的专利申请PCT/US2010/050362 “用于聚合酶分析的纳米通道阵列和近场光照装置及相关方法(Nanochannel Arrays And Near-FieldIllumination Devices For Polymer Analysis And Related Methods)，，、以及 2010 年 10月21日提交的专利申请PCT/US2010/053513“用于单分子全基因组分析的方法和相关装置(Methods And Related Devices For Single Molecule Whole Genome Analysis)，，。
[0182]所公开的测定法可以在纳米通道阵列中对分子群体的大小分布以及DNA分子的核苷酸修饰进行直接成像。该测定法可以起始于用荧光团或其它标记物在长基因组DNA分子上酶促标记特定的核苷酸修饰(单链断裂或化学修饰)。然后将标记的DNA分子线性化(例如在纳米通道阵列内部)，并用高分辨率的荧光显微镜进行成像。通过将荧光标记物局部化在DNA骨架上，可以以高准确性推断出基因组的结构信息以及单个DNA分子上修饰核苷酸的分布。小型化的纳米阵列装置以及灵活有效的标记化学使得能够在单分子水平上直接对全基因组进行成像分析。
[0183]某些DNA损伤可以阻断DNA聚合酶的进展，继而影响PCR效率。特定的DNA损害还影响聚合酶整合的保真性，其中错误整合导致突变。例如，在8-氧代-7，8- 二氢-20-脱氧鸟苷(8-氧代dG)存在下，Taq DNA聚合酶插入dCMP以及较小程度上插入dAMP。在另一种情况下，存在单一的8-氧代-7，8- 二氢-2-脱氧腺苷、脱碱基位点、或cis-syn型胸腺嘧啶二聚体显著降低了扩增效率。
[0184]许多测序技术需要从基因组DNA构建测序文库，其质量和基因组呈现决定了最终的测序结果。测序文库的质量由基因组DNA的质量以及文库构建过程所决定。所公开的方法不一定需要PCR，并且如上所述，允许使用者评估文库的质量。
【权利要求】
1.方法，其包括: 将多核苷酸上的第一位点转变成能够支持聚合酶延伸的第一部分； 在所述第一部分处实现延伸，以便将第一标记物整合在所述第一位点处或所述第一位点附近； 将包括所述第一标记物的多核苷酸的一部分线性化；以及 对所述第一标记物进行成像。
2.权利要求1的方法，其中通过将包括所述第一标记物的多核苷酸的一部分局限在纳米通道内来实现所述线性化。
3.权利要求1的方法，其中所述第一位点包含多核苷酸中的单链断裂、多核苷酸中的双链断裂、环丁烷嘧啶二聚体、6-4光化产物、胸腺嘧啶二聚体、氧化嘧啶、脱碱基位点、前述任一项的价异构体、前述任一项的杜瓦价异构体、或其任意组合。
4.权利要求1的方法，其中所述转变产生脱嘧啶位点、脱嘌呤位点、不可延伸的单链断裂、或其任意组合。
5.权利要求1的方法，其中所述转变包括将所述第一位点与水解脱嘌呤位点、水解脱嘧啶位点、或水解两者的酶相接触。
6.权利要求5的方法，其中所述转变包括将所述第一位点与N-糖基化酶、碱处理、或两者相接触。
7.权利要求6的方法，其中所述N-糖基化酶包含核酸内切酶II1、T4核酸内切酶V、核酸内切酶VII1、紫外线DNA核酸内切酶、甲酰胺基嘧啶DNA糖基化酶、或其任意组合。
8.权利要求3的方法，其中所述第一位点包含脱碱基位点，并且其中将所述脱碱基位点与碱性溶液相接触，以便将所述脱碱基位点转变成单链断裂。
9.权利要求3的方法，其中所述第一位点包含单链断裂，并且其中将所述单链断裂与碱性溶液相接触，以便将所述单链断裂转变成双链断裂。
10.权利要求4的方法，其还包括将所述脱嘧啶位点、脱嘌呤位点、不可延伸的单链断裂、或两者，与脱嘌呤/脱嘧啶裂解酶、磷酸二酯酶、或其任意组合相接触。
11.权利要求10的方法，其中所述裂解酶包含核酸内切酶IV。
12.权利要求1的方法，其中通过将所述多核苷酸与聚合酶和包含所述第一标记物的核苷酸相接触来实现所述延伸。
13.权利要求1的方法，其中所述第一部分包含能够支持聚合酶延伸的3’-OH结构。
14.权利要求1的方法，其还包括表征所述多核苷酸的至少一种结构特征。
15.权利要求14的方法,其中所述表征包括对至少一种标记物在所述多核苷酸上的位置进行定位。
16.权利要求15的方法，其还包括确定两种或更多种标记物在所述多核苷酸上的相对位置。
17.权利要求14的方法，其还包括计算所述多核苷酸的一定长度中的标记物数目。
18.权利要求1的方法，其还包括确定含有所述多核苷酸的样品中存在的标记物的数目。
19.权利要求1的方法，其中所述第一标记物包含荧光团。
20.权利要求1的方法，其还包括将第二标记物整合在所述第一位点处或所述第一位点附近。
21.权利要求20的方法，其中所述第一标记物和第二标记物的结构彼此不同。
22.权利要求21的方法，其中所述第一标记物和第二标记物在不同的光照波长下发荧光。
23.权利要求1的方法，其中在所述多核苷酸驻留在多孔基质内时，进行转变或实现步骤中的至少一个。
24.权利要求23的方法，其中所述基质包含琼脂糖凝胶。
25.权利要求23的方法，其还包括至少部分分解所述基质，以便释放出所述多核苷酸。
26.权利要求23的方法，其还包括将所述多核苷酸的至少一部分固定于所述基质。
27.权利要求26的方法，其中通过生物素-亲和素反应、受体-配体反应、抗体-抗原反应、或其任意组合来实现所述固定。
28.权利要求1的方法，其中所述成像包括用一种或多种波长的光照照射所述多核苷酸。
29.权利要求1的方法，其还包括将所述第一标记物的存在或位置与所述多核苷酸的结构特性相关联。
30.权利要求29的方法·，其还包括将两种或更多种标记物的存在或位置与所述多核苷酸的结构特性相关联。
31.分析系统，其包含: 样品台，其被配置成接收包含一个或多个纳米通道的流体芯片，所述纳米通道具有在Inm至约250nm范围内的特征性尺寸； 光照源，其被配置成照射被布置在所述流体芯片内的样品；以及 图像采集器，其被配置成采集照射后的被布置在所述流体芯片内的样品的图像。
32.权利要求31的系统，其还包含检测器，所述检测器能够检测从被布置在所述流体芯片内的样品反射的第一束光照。
33.权利要求31的系统，其还包含检测器，所述检测器能够检测从被布置在所述流体芯片内的样品反射的第一束和第二束光照的位置。
34.权利要求32的系统，其还包含控制器，所述控制器被配置成根据从被布置在所述流体芯片内的样品反射的第一束光照的位置来平移所述台。
35.权利要求33的系统，其还包含控制器，所述控制器被配置成根据从被布置在所述流体芯片内的样品反射的第一束光照的位置来平移所述台。
36.权利要求35的系统，其中所述控制器接收从被布置在所述流体芯片内的样品反射的第一束或第二束光照中的至少一个的第一位置与第二位置之间的距离作为输入。
37.权利要求31的系统，其还包含至少一个滤波器，所述滤波器能够被布置在光照路径中，以便改变提供给被布置在所述流体芯片内的样品的光照的波长。
38.权利要求31的系统，其中所述系统包含两个或更多个光照源。
39.权利要求38的系统，其中至少两个光照源被配置成提供不同波长的光照。
40.权利要求31的系统，其还包含扩束器，所述扩束器被布置在光照源与样品之间的光照路径中。
41.权利要求40的系统，其中所述扩束器包含开普勒扩束器、伽利略扩束器、或两者。
42.权利要求31的系统，其还包含滤波器轮，所述滤波器轮被配置成过滤施加到所述样品或从所述样品反射的光照。
43.权利要求31的系统，其中所述系统包含电场源，所述电场源被配置成促使流体样品进入所述流体芯片的纳米通道中。
44.权利要求31的系统，其还包含读取器，所述读取器被配置成按照一个或多个被布置在流体芯片上的标记来配置所述系统。
45.方法，其包括: 将多核苷酸中的第一单链断裂与碱性磷酸酶相接触，以便产生能够支持聚合酶延伸的第一部分； 将所述部分与聚合酶和标记的核苷酸相接触，以便将标记物整合到多寡核苷酸中； 通过将第一标记物局限在纳米通道内来将所述多核苷酸的至少一部分线性化；以及 对所述第一标记物进行成像。
46.权利要求45的方法，其中所述碱性磷酸酶包含虾碱性磷酸酶。
47.权利要求45的方法，其还包括将所述标记的核苷酸的存在或位置与所述多核苷酸的结构特性相关联。
48.权利要求47的方法，其还包括将两种或更多种标记物的存在或位置与所述多核苷酸的结构特性相关联。
49.方法，其包括` 向多核苷酸中的单链断裂施加具有3’至5’核酸外切酶活性的DNA聚合酶，以便将不可延伸的单链断裂转变成聚合酶可延伸的位点；以及 施加DNA聚合酶和标记的脱氧核苷酸，以便将标记物整合到所述多核苷酸中。
50.权利要求49的方法，其中所述标记物包含荧光团、放射性部分、或其任意组合。
51.权利要求49的方法，其中基本上在不存在游离脱氧核苷酸的条件下施加聚合酶。
52.方法，其包括: 将具有脱碱基位点的多核苷酸布置在多孔基质材料内； 将所述多核苷酸与碱性材料相接触，以便将所述脱碱基位点转变成所述多核苷酸中的单链断裂，以便将所述多核苷酸中的单链断裂转变成所述多核苷酸中的双链断裂，或两者； 将所述多核苷酸中的单链断裂、所述多核苷酸中的双链断裂、或两者转变成能够支持聚合酶延伸的部分； 将所述部分与聚合酶和标记的核苷酸相接触，以便将一种或多种标记物整合到所述多核苷酸中。
53.权利要求52的方法，其中将所述多核苷酸布置在细胞内。
54.权利要求52的方法，其还包括:将所述细胞裂解以便释放出所述多核苷酸，扩增所述多核苷酸，消化所述多核苷酸，或其任意组合。
55.权利要求52的方法，其中转变所述多核苷酸中的单链断裂包括将所述单链断裂与具有3’磷酸二酯酶活性的核酸内切酶相接触。
56.权利要求52的方法，其还包括至少部分分解所述基质，以便释放出所述多核苷酸。
57.权利要求52的方法，其还包括对一种或多种所述标记物进行成像并将成像的标记物与所述多核苷酸的结构特性相关联。
58.方法，其包括: 将多核苷酸布置在多孔基质材料内； 将多核苷酸上的第一位点转变成能够支持聚合酶延伸的第一部分； 在所述第一部分处实现延伸，以便将第一标记物整合在所述第一位点处或所述第一位点附近； 通过将所述第一标记物局限在纳米通道内来将所述多核苷酸的至少一部分线性化；以及 对所述第一标记物进行成像。
59.权利要求58的方法，其中将所述多核苷酸布置在细胞内。
60.权利要求59的方法，其中将所述细胞布置在所述多孔基质材料内。
61.权利要求60的方法，其中将所述细胞裂解以便释放出所述多核苷酸。
62.权利要求58的方法，其还包括:(a)将所述细胞裂解以便释放出所述多核苷酸，(b)扩增所述多核苷酸，(c)消化所述多核苷酸，或其任意组合。
63.权利要求58的方法，其还包括至少部分分解所述基质，以便释放出所述多核苷酸。
64.权利要求58的方法，其中通过将所述第一位点与N-糖基化酶相接触来实现所述转 变。
65.权利要求64的方法，其中通过将所述多核苷酸与聚合酶和包含所述第一标记物的核苷酸相接触来实现所述延伸。
66.权利要求58的方法，其还包括将所述第一标记物的存在或位置与所述多核苷酸的结构特性相关联。
67.权利要求66的方法，其还包括将两种或更多种标记物的存在或位置与所述多核苷酸的结构特性相关联。
68.试剂盒，其包含: 一定量的N-糖基化酶； 一定量的脱嘌呤/脱嘧啶裂解酶、3’ -磷酸二酯酶、或两者； 一定量的聚合酶；以及 一定量的标记的核苷酸。
69.权利要求68的试剂盒，其中所述试剂盒被布置在包装内，所述包装被配置成与能够实现分配所述试剂盒的试剂中的一种或多种的装置接合。
70.权利要求68的试剂盒，其中所述脱嘌呤/脱嘧啶裂解酶包含核酸内切酶IV。
71.试剂盒，其包含: 一定量的碱性材料； 一定量的脱嘌呤/脱嘧啶裂解酶、3’ -磷酸二酯酶、或两者； 一定量的聚合酶；以及 一定量的标记的核苷酸。
72.系统，其包含: 试剂盒，其包含(a) —定量的聚合酶，(b) —定量的标记的核苷酸，以及(C) 一定量的脱嘌呤/脱嘧啶裂解酶、3’ -磷酸二酯酶、或核酸内切酶IV中的一种或多种，所述试剂盒适合于与样品成像仪接合， 所述样品成像仪包含样品台，所述样品台适合于与含有一个或多个纳米通道的流体芯片接合； 光照源，其能够与被布置在所述流体芯片的纳米通道内的样品光学连通； 图像采集器，其能够采集照射后的被布置在所述纳米通道内的样品的图像。
73.方法，其包括: 将多核苷酸包括至少一种标记物的区域线性化， 所述标记物已通过聚合酶延伸被整合到所述多核苷酸中， 所述聚合酶延伸在从脱碱基位点、单链断裂、或两者转变而来的部分上执行。
74.权利要求73的方法，其还包括对所述至少一种标记物进行成像。
75.权利要求73的方法，其中所述脱碱基位点包含脱嘌呤位点、脱嘧啶位点、或两者。
76.权利要求73的方法，其中通过将多核苷酸含有至少一种标记物的区域局限在纳米通道内来实现所述线性化。
77.权利要求73的方法，其还包括将所述标记物的存在或位置与所述多核苷酸的结构特性相关联。
78.权利要求77的方法，其还包括将两种或更多种标记物的存在或位置与所述多核苷酸的结构特性相关联。
79.方法，其包括: 将标记物整合在多核苷酸上的损伤位点处或损伤位点附近； 将多核苷酸包括所述标记物的区域线性化；以及 对所述标记物进行成像。
80.权利要求79的方法，其还包括确定所述多核苷酸上两种或更多种标记物的存在、间距、或两者。
81.权利要求79的方法，其中所述整合包括将所述损伤位点转变成能够支持聚合酶延伸的部分。
82.权利要求81的方法，其中所述转变还包括将所述损伤位点转变成中间体，所述中间体通过一个或多个步骤而被转变成能够支持聚合酶延伸的部分。
83.权利要求81的方法，其还包括将所述标记物的存在或位置与所述多核苷酸的结构特性相关联。
84.权利要求83的方法，其还包括将两种或更多种标记物的存在或位置与所述多核苷酸的结构特性相关联。
85.系统，其包含: 基底，其被配置成接收流体芯片； 光照器，其被配置成照射被布置在所述流体芯片内的多核苷酸样品；以及 图像采集器，其被配置成采集来自于被布置在所述流体芯片内的多核苷酸样品的图像。
86.权利要求85的系统，其还包含使所述光照器与被布置在所述流体芯片内的样品光学连通的光学介质。
87.权利要求86的系统，其中所述光学介质包含光纤、透镜、反射镜、或其任意组合。
88.权利要求85的系统，其还包含一个或多个滤波器，所述滤波器能够改变由所述光照器供应给所述多核苷酸样品的光照的波长。
89.权利要求85的系统，其还包含能够与被布置在所述流体芯片内的多核苷酸样品连通的梯度源。
90.权利要求89的系统，其中所述梯度源包含压力源、电势源、电流源、磁场源、或其任意组合。
91.权利要求85的系统，其中所述光照器包含激光器。
92.权利要求85的系统，其中所述系统被配置成向所述多核苷酸样品施加两种或更多种波长的光照。.
【文档编号】C12Q1/68GK103443290SQ201180060380
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2011年10月20日 优先权日:2010年10月20日
【发明者】帕里克希特·A·德什潘德, 亚瑟·G·马尔林, 迈克尔·科切尔斯皮尔格, 阿莱克谢·沙罗诺夫, 威廉·斯特德曼, 肖明, 亨利·B·萨多夫斯基, 索梅斯库玛尔·达斯, 马修·阿卡纳, 丹尼尔·波兹诺夫, 迈克尔·雷夸, 曹涵 申请人:生物纳米基因公司