专利名称：对细胞周期非依赖的神经胶质瘤表面抗原特异的人单克隆抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及IgM同种型的单克隆抗体(MAb)及其编码cDNA的特征。具体地，本发明涉及两种针对恶性神经胶质瘤细胞系的人单克隆抗体。这些人抗-神经胶质瘤单克隆抗体在治疗这种急性脑肿瘤中具有潜在的临床价值。本发明包括这些与单克隆抗体结合的细胞表面标记物。
恶性神经胶质瘤是所有原发性脑肿瘤中最常见的一种。它们也是临床上最难治疗的。根据它们在颅内的位置，在表现任何症状之前，可以长至相当大。它们的生物行为极具侵袭性，尽管它们很少转移到中枢神经系统之外。
单独用手术和放射治疗很少能起到治疗效果；在最好的护理下，平均存活为一年以下。此外，尽管竭力引进新的辅助疗法，对恶性神经胶质瘤病人的预后在过去三十年中基本上没有改变。
许多辅助疗法包括免疫疗法，或者是目前还不有效，或者造成令人难以接受的严重发病的危险性。然而，随着Kohler和Milstein(1975)开发的鼠杂交瘤技术，用单克隆抗体进行的肿瘤免疫诊断和免疫治疗已经成为大有前途的研究领域。
对鼠单克隆抗体的研究已经使人们大致了解了神经胶质瘤生物学及其异质性。出于种种原因，这些试剂不适合在临床上用于人体。相反，与鼠单克隆抗体相比，人单克隆抗体能提供更大的特异性和生物相容性。
恶性神经胶质瘤是神经上皮肿瘤，一般出现在大脑半球中。在该组肿瘤中，包括退行性(anaplastic)星形细胞瘤、退行性少突神经胶质细胞瘤、退行性室管膜瘤和多形性成胶质细胞瘤。这些肿瘤在显微镜下都具有一些共同的特征，例如细胞密集、有丝分裂个体数目增加、染色过深的核多形性和细胞多形性。在多形性成胶质细胞瘤中，都存在上述特征，而且还有假栅式(pseudopalisade)的坏死、伴随假玫瑰花结(pseudorosette)形成的毛细血管内皮增生和间充质的增生。这些肿瘤呈异质性并表现出肿瘤间和肿瘤内的多样性，这是治疗中遇到的主要决定因素。因为对分化程度低的神经胶质瘤细胞而言存在很少的标记物，因此在原本异质性群体中选择性地靶定这些细胞是非常有利的，因为消除这种低分化细胞肿瘤的失败会不可避免地导致肿瘤的复发。
已经表明，许多恶性神经胶质瘤病人显著地呈现免疫抑制，尤其是在细胞介导的功能方面，尽管少数病人是恶病质的。在无明显的系统缺损下发现的免疫抑制暗示，前者是由于肿瘤内在机制造成的，而不是通常情况下过度的肿瘤负担的反应。恶性神经胶质瘤病人的体液免疫机制似乎也被抑制，尽管它们是完好的。
恶性神经胶质瘤与衍生出它们的正常细胞具有许多共同的抗原。因此，几乎不可能制备常规的针对神经胶质瘤组织的异种抗血清(heteroantisera)，因为它们有某种程度的与正常成人脑的交叉反应。共享的抗原按性质分可以是细胞内的、膜相关的、或细胞外的。
糖脂和碳水化合物结构在细胞相互作用、分化和肿瘤发生中的作用最近已引起重视。已知神经节苷脂这一亚类糖脂在细胞粘附和增殖的调控中发挥重要作用。当细胞进行恶性转化时，在其表面神经节苷脂的化学性质会发生微妙的质和量的改变。
恶性神经胶质瘤是非常血管化的肿瘤。然而，存在血脑屏障的破坏或完全缺失。血脑屏障存在于正常的健康脑中，通过它脑被正常地“保护起来”，也就是与免疫系统的或其他血液携带物质的效应隔开。由于患这些肿瘤的病人中血脑屏障的破坏，免疫系统可以到达肿瘤细胞。
Schnegg等人(1981)和Bourdon等人(1983)报道了针对神经胶质瘤细胞系的鼠单克隆抗体的研究，这两个小组都用培养的人神经胶质瘤细胞系免疫鼠，然后用脾细胞分别与鼠骨髓瘤系P3X63-Ag8或P3X63-Ag8.653融合。Schnegg等人(1981)所描述的单克隆抗体BF7、GE2似乎相对地限于神经胶质瘤，而抗体CG12(de Tribolet，etal.1984)与神经胶质瘤、黑素瘤和神经母细胞瘤等一系列瘤反应。抗体81C6由Bourdon等人(1983)产生和鉴定，发现其与在神经胶质瘤、神经母细胞瘤、黑素瘤、肉瘤和培养的成纤维细胞中表达的神经胶质瘤-间充质胞外基质(glioma-mesenchyalextracellular matrix，GMEM)抗原反应。除了上述之外，GMEM抗原还在正常的肝窦状隙、脾红髓窦状隙、肾髓小管间质组织和肾小球膜中发现。尽管正常的成人和胎儿脑对CG12的吸收会导致其结合活性的丧失，但是BF7、GE2和81C6都不受这种处理的影响。
来自恶性神经胶质瘤病人的人单克隆抗体(HMAb)的报道已出现于文献中。然而，这些抗体中的任何一种都没有被很好地表征。
Sikora等人(1982)报道了对0.25％戊二醛固定的神经胶质瘤细胞有反应的HMAb的产生情况。这些研究者获得了来自12位做恶性神经胶质瘤颅骨切开手术病人的肿瘤内的淋巴细胞，并将它们与EBNA+8-氮鸟嘌呤抗性的人成淋巴细胞样细胞系LICR-LON-HMy2(已知该细胞系分泌γ和λ链)融合。获得了来自5个病人的总计71个杂交瘤。没有报道亚克隆试验，也没有显示或证明杂交瘤的单克隆性。该研究还报道了HMAb与其他肿瘤细胞系的交叉反应性。缺点是显而易见的需要来自人脑的肿瘤内细胞作为原料。
在Sikora等人(1983)随后的研究中，作者总结到，对于挑选出用于研究的某一HMAb，该HMAb呈低亲和性，因为需要高浓度才能显现出与靶目标的反应性。
本发明的发明人和同事报道了产生5个杂交瘤细胞系，它们中的每个都产生IgM同种型的抗-神经胶质瘤HMAb(Dan，et al.，1992)。这5个杂交瘤的产生是通过将来自4位患星形细胞肿瘤的病人的外周血淋巴细胞与人骨髓瘤样细胞系TM-H2-SP2进行体细胞融合。
这5个杂交瘤的产生基于这样的原则患神经肿瘤的病人拥有具备抗-神经胶质瘤特异性的循环B淋巴细胞，并且基于这样的原则来自神经胶质瘤病人的肿瘤反应抗体可识别人神经胶质瘤中共同的、非等位基因的决定簇(这些决定簇与被异种系统所识别的决定簇在特异性和分布方面存在差异)。
因此，通过融合人骨髓瘤样细胞系和从患神经胶质瘤病人处获得的B细胞而产生了这5个杂交瘤。通过适当地培养获得的杂交瘤，可以获得可使用量的有效的针对人神经胶质瘤的HMAb。
获得的人单克隆抗体的一个明显特征是它们之间的高度相似性，尽管它们用来自4个不同的肿瘤病人的细胞产生，这些病人的肿瘤类型、病史、或肿瘤发展阶段不同。而且与已有技术相比，这些HMAb表现出更高的相容性和对人靶细胞更高的识别灵敏度。这些HMAb不与正常的人星形细胞结合。
这些HMAb可用于神经肿瘤放射性定位的诊断成像，用于免疫治疗如通过直接作用或将这些HMAb与化学治疗剂相连从而使其能直接导向肿瘤细胞。为了具有临床价值，人单克隆抗体应满足下列标准1)标记表面，即结合于活肿瘤细胞，2)识别细胞周期非依赖的肿瘤特异性抗原，和3)在体外能同样好地与肿瘤细胞结合，而不论它们的培养活力、生长特征或培养密度。在获得的5个抗-神经胶质瘤HMAb中，至少有2个满足这些标准并且已经被鉴定。这两个HMAb被命名为BT34/A5和BT32/A6。
本发明提供了编码HMAb BT34/A5和BT32/A6可变区的轻链和重链的cDNA序列。本发明包括相应的氨基酸序列和具有所述特征的可变区链的IgM同种型人单克隆抗体，以及具有这些链的其他蛋白质或蛋白质结合物。具体地，本发明包括具有含超变区(互补决定区，CDR)的轻链和重链的任何蛋白质或蛋白质结合物(即免疫结合物)，该超变区与本发明的轻链和重链的超变区相同或至少90％同源。如本领域技术人员所知，免疫结合物包括与抗原结合分子结构相结合的药物、毒素、细胞因子(cytokine)、放射性核素、酶和其他诊断或治疗分子。本发明还包括与本发明的HMAb结合的细胞表面标记物或抗原。人单克隆抗体的制备进行细胞融合，以制备人骨髓样细胞系TM-H2-SP2和来自8个不同的脑肿瘤病人(编号为BT-24、BT-27、BT-32、BT-34、BT-38、BT-39、BT-54、和BT-55)的外周B淋巴细胞(PBL)的杂交瘤。这些病人，有男性和女性，年龄为5-55岁，所患的肿瘤包括原纤维星形细胞瘤、少突神经胶质细胞瘤、原发性神经外皮肿瘤和成胶质细胞瘤。融合按以前所述方法进行(Dan，et al.，1992)。用补充有L-谷氨酰胺(292mg/l)和L-天冬酰胺(44mg/l)的新鲜组织培养基和胎牛血清(FCS)，在96微孔板上孵育细胞。杂交瘤的产生被定义为含有大于50-100个细胞的大集落(肉眼可见)的微孔数除以总接种数，并以百分比表示，为0-19.5％。
在所有样品中供融合的PBL数目为6.0×106-5.8×107。尽管每个融合体的骨髓瘤细胞与淋巴细胞的比例维持恒定为1∶4，但使用的铺板密度为1.0×105-2.5×105骨髓瘤细胞/每毫升融合混合物。在某些融合体中选择较低的铺板密度，以利于获得更好的起始单克隆性，而较高的铺板密度利于提高杂交瘤产生。在所有融合体中，聚乙二醇的浓度为50％(v/v)。
典型地，在融合后4-6周出现可见的杂交瘤生长，而微孔中新的生长常继续数周以便观察。一般，最早出现的杂交瘤集落常最稳定。并不是所有在96微孔(0.28cm2/孔)培养期结束时可见的大集落都能成功地繁殖至适合在24孔培养皿(2.01cm2/孔)中生长的数量。例如与BT-54的融合体中，最初在96微孔中长出了7个集落，只有一个能够在体外长时间生长。没有观察到在融合后3月发生杂交瘤生长失败的例子。
筛选杂交瘤是否存在人免疫球蛋白以及与自身肿瘤的3M KCl抽提物、或者戊二醛固定的神经胶质瘤细胞系的反应性。
筛选了总计1121个含有来自所述融合体的假定的杂交瘤生长的孔，其中发现162(14.5％)个与肿瘤抽提物或神经胶质瘤细胞系反应。对两个融合体，即BT-27和BT-32，筛选其与数种神经胶质瘤细胞系的反应性，各微孔中发现在多重ELISA(酶联免疫吸附测定)中呈阳性的例子。
在最后两个融合体BT-54和BT-55中，对ELISA进行改良以便仅检测含有反应性IgM类型的微孔。这种改良是通过用来自杂交瘤BT-27/2D2的培养上清液替换TM-H2作为对照，并加入碱性磷酸酯酶偶联的羊抗-人IgM作为第二抗体而实现的。其理由是，对来自BT-24、BT-27、BT-32和BT-34的34个杂交瘤中存在的免疫球蛋白链的分析揭示所有的这34个杂交瘤都含有IgM，而对这些杂交瘤中的少数进行仔细研究揭示仅IgM担负抗肿瘤活性。来自病人BT-27细胞的杂交瘤BT27/2D2，它在各种免疫反应性的ELISA测定中始终呈阴性，因此选择它作为非特异的IgM对照(1-4μg/ml)。
对通过上述融合系列而获得的总计9个免疫球蛋白高产杂交瘤，用FACS-III流式细胞计数仪(Flow Cytometer)筛选与人神经胶质瘤系SK-MG-1的反应性。发现来自杂交瘤BT27/1A2、BT27/2A3、BT32/A6、BT34/A5和BT54/B8的5种上清液可标记这种特定的神经胶质瘤细胞系。所有的5种上清液都含有肿瘤反应性IgM类型。因此，来自8个融合体和在6周时肉眼可见的总计59个杂交瘤中，只有5个(8.4％)与神经胶质瘤细胞系的细胞表面反应从而能够在培养中维持生长。已注意到，BT27/2A3对SK-MG-1的标记可以得到加强，如果在测试前将SK-MG-1维持于高细胞密度。
所有5种杂交瘤上清液都发现含有μ重链。只有BT34/A5含有λ轻链，其他4种HMAb含有κ轻链。通过使用流式细胞计量术(FCM)分析和FITC-偶联的羊抗-人IgM(IgG组份，μ链特异的；Cappel Laboratories，Cochranville，PA)，每个HMAb都显示可标记于人神经胶质瘤系SK-MG-1的细胞表面。这表明IgM分子结合于肿瘤细胞膜表面(数据未示)。
在培养中维持约6个月之后，估计的BT27/1A2的IgM浓度为5.0μg/ml；对于BT27/2A3，IgM浓度为44μg/ml；对于BT32/A6，IgM浓度为3.5μg/ml；对于BT34/A5，IgM浓度为2.4μg/ml；对于BT54/B8，IgM浓度为22.4μg/ml。再连续培养6个月后，发现IgM的产量水平是相当的。
5个HMAb中的3个用ELISA测试其相对反应性。在测试的上清液最初浓度下，反应性的次序是BT27/2A3＞BT27/1A2＞BT32/A6，这与它们各自的IgM浓度的次序是一致的。用ELISA分析得出的最终效价(它给出比对照IgM基线高得多的O.D.读数)是，对BT27/2A3为1∶16，对BT27/1A2为1∶4，对BT32/A6为1∶2。因为该测试涉及在最初步骤中加入等体积即50μl的PBS，所以在ELISA中测试的最初稀释度为1∶2。在任何稀释曲线中没有最初的平台期，这表明在所用的ELISA条件下肿瘤抽提物的数量并不是限制因素。单克隆性的确定根据Maniatis等人(1982)的方法，从TM-H2-SP2、BT27/1A2、BT27/2A3、BT32/A6和BT27/2D2细胞中分离基因组DNA。将10微克DNA用BamHI和HindIII限制性内切酶(＞3单位/μg DNA；Boehinger-Mannheim，West Germany)按制造商给出的条件，在37℃消化过夜。消化后，DNA在0.8％(w/v)琼脂糖凝胶上电泳(Maniatis，et al.，1982)，然后用常规方法转至Genescreen Plus膜(NEN，Boston，MA)上。用鲱鱼精子DNA(Boehinger-Mannheim，West Germany)预杂交后，用比活性为5-6×108/μg的32P-标记的JH探针(Oncor Inc.，Gaithersburg，MD)在65℃Southern印迹杂交过夜(Kaufmann，et al.1985)。探针包括完整的人JH区域，总长为5.6kbp(Ravetch，et al.1981)。洗涤后，于-70℃将印迹暴露于带增感屏的Kodak X光胶片。
Southern印迹分析揭示，杂交瘤BT27/1A2、BT27/2A3、BT32/A6中每个都具有两条与JH基因区域同源的重排条带。杂交瘤BT27/2D2似乎具有3条这样的条带。用于该试验的B细胞融合配体TM-H2-SP2只有一条条带而另一条明显缺失。此外，在任何“杂交瘤”中没有JH区域发生TM-H2-SP2型重排的证据。发现作为对照的正常PBL DNA(它由60-70％T细胞衍生的遗传物质构成)产生与胎盘(种系)DNA相同的印迹图案。在各样品中，还有一条共同的低分子量的、含有不相关序列的条带。
Ig重链基因位于人14号染色体上，它有4个不同元件构成，分别为VH(可变(variable))、DH(多变(diversity))、JH(连接(joining))和CH(恒定(constant))区。在种系DNA中，这些区域被间插序列所隔开，而一旦细胞开始向B细胞分化，这些间插序列便被拼接去除。
最初认为，只有一条染色体发生重排而另一条染色体维持种系构型(等位基因排斥原则)。然而在鼠重链基因中，第二条染色体基本上总是重排的(Nottenburg andWeissman，1981)。因比提出，对于给定细胞，功能性重排的可能性一定非常低(Coleclough，et al.1981)。因而人们会遇到每个细胞中两个非功能、或一个功能和一个非功能、但极少两个功能重链发生重排的情况，这些观察结果对鼠是有效的，而且似乎对更高等的哺乳动物也是对的(Korsmeyer，et al.1983)。
用于这些试验的重链探针包括了整个人种系JH区域。在种系DNA发生重排的情况下，用限制性内切酶BamHI和HindIII消化会产生长度与5.6kbp的JH探针不同的DNA片段。在各杂交瘤中发现两个这样的片段，表明对各杂交瘤都检测到两个重链重排，这与3个中每个杂交瘤的单克隆起源是一致的。流式细胞计量术用生长至汇合并维持该状态的细胞，对培养的人细胞系和株进行流式细胞计量术分析，其中在标记前至少24小时前更换新鲜培养基。维持并使用来自高细胞密度培养物(即接近饱和)的悬浮培养细胞系。按上述方法平行地对2个或多个进行筛选，其中用建立的阳性细胞系来证实HMAb免疫反应性的存在。
用人细胞系进行FCM筛选的结果总结于表1和表2。测试了几类神经外皮的和非神经外皮的肿瘤和组织。对30种研究的细胞系，所有的5种HMAb都表现出类似的反应格局，只有少数显著例外。例如，人上皮宫颈癌细胞系ME180与BT27/1A2和BT27/2A3反应，但不与BT32/A6反应。抗体BT34/A5和BT54/B8都不能与神经胶质瘤细胞系SKI-1反应，但是可以标记黑素瘤细胞系M-4。
只有HMAb BT32/A6有单一的反应格局。抗体BT27/1A2和BT27/2A3都表现出一种反应格局，抗体BT34/A5和BT54/B8具有另一种反应格局，这两种格局间稍有差别。没有HMAb与测试的任何血液细胞系反应。
表13种HMAb的反应性肿瘤类型细胞系BT27/1A2aBT27/2A3BT32/A6神经胶质瘤 SK-MG-1 阳性b阳性阳性SK-MG-13 阳性阳性阳性SKI-1 阳性阳性阳性LN-215阴性阴性阴性LN-340阴性阴性阴性U-178 阳性阳性阳性U-373 阳性阳性阳性黑素瘤 M-4 阴性阴性阴性IGR-37阴性阴性阴性IGR-39阴性阴性阴性神经母细胞瘤IMR-32阴性阴性阴性SK-N-MC 阴性阴性阳性成视网膜细胞瘤 Y-76 阴性阴性阴性血液细胞CEM-Tc阴性阴性阴性K-562d阴性阴性阴性HL-60e阴性阴性阴性其他肿瘤HeLaf阳性阳性阳性ME180f阳性阳性阴性C-33Af阴性阴性阴性SW1166g阴性阴性阴性SW1417g阴性阴性阴性SW948g阴性阴性阴性HT29g阴性阴性阴性J82h阴性阴性阴性胚胎成纤维细胞 HEF 阴性阴性阴性WI-38 阴性阴性阴性注a杂交瘤；b检测到该细胞以高于对照抗体的标记水平的程度与HMAb结合；cT-细胞白血病；d慢性髓细胞白血病；e急性早幼粒细胞白血病；f上皮宫颈癌；g结肠腺癌；h过渡型膀胱细胞癌；N.D.未测试。
表2HMAb BT34/A5和BT54/B8的反应性肿瘤类型细胞系 BT34/A5aBT54/B8 BT27/2A3神经胶质瘤 SK-MG-1阳性b阳性阳性SKI-1 阴性阴性阳性U-373 阳性阳性阳性黑素瘤 M-4阳性阳性阴性血液细胞CCRF-CEMc阴性阴性阴性K-562d阴性阴性阴性HL-60e阴性阴性阴性U-937f阴性阴性N.D.
Rajig阴性阴性N.D.其他肿瘤HeLah阴性阴性阳性ME180h阴性阴性阴性C-33Ah阴性阴性阴性SW1417i阴性阴性阴性SW1463i阴性阴性阴性J82j阴性阴性阴性胚胎成纤维细胞 IMR-90 阳性阳性N.D.
WI-38 阴性阴性阴性注a杂交瘤；b见表1；cT-细胞白血病；d慢性髓细胞白血病；e急性早幼粒细胞白血病；f组织细胞淋巴瘤，单核细胞样；gB细胞淋巴瘤；h上皮宫颈癌；i结肠腺癌；j过渡型膀胱细胞癌；N.D.未测试。
尽管对一系列的人肿瘤细胞系的反应格局上存在某些小差别，所有5种HMAb都可识别类似的分子物质，无论是生物化学组成还是生物分布方面，尽管它们来自4个患不同肿瘤的不同病人。免疫过氧化物酶染色对于一系列肿瘤细胞的免疫过氧化物酶染色分析，选择了抗体BT32/A6。肿瘤细胞在盖玻片上于完全培养基中生长2-3天，用PBS洗涤，用2％甲醛于室温下固定20分钟。在用PBS洗涤后，细胞与1％正常羊血清一起孵育60分钟。再次用PBS洗涤，细胞在室温下或者与10-20μg/ml MAb或者与对照人骨髓瘤IgM一起孵育120分钟。再次用PBS洗涤后，在室温下将细胞用生物素化的羊抗-人IgM染色60分钟，然后与HRP标记过的链球菌抗生物素蛋白再孵育60分钟，随后用PBS洗涤。使用于50mMTris-HCl缓冲液(pH7.0)中的0.06％二氨基联苯胺和0.01％过氧化氢，引发过氧化物酶反应10分钟。细胞用苏木精短暂地对染色。如表3所示，染色结果大体证实了流式细胞计量术结果，不同点在于在该测试中HMAb与黑素瘤和神经母细胞瘤细胞系的结合为阳性。
表3HMAb BT32/A6的反应性-过氧化物酶染色肿瘤类型细胞系 BT32/A6神经胶质瘤 SK-MG-1阳性U-373 阳性U-178 阳性U-87MG 阳性神经母细胞瘤SK-N-SH阳性SK-N-MC阳性黑素瘤 SK-MEL5阳性SK-MEL3阳性SK-MEL28 阳性A-375 阳性乳房癌 BT-20 阳性MDA MB-468 阳性MCF-7 阳性结肠癌 HT-29 阴性SK-CO1 阴性人成纤维细胞WI-38 阴性MCR-5 阴性与正常的人星形细胞的反应性评估了培养的人星形细胞与HMAb的标记情况。所有的(抗体)试剂都检查其与已有的阳性人神经胶质瘤细胞系(U-373)的免疫反应性。HMAb BT27/1A2、BT27/2A3和BT32/A6中没有一个与培养的来自两个人的星形细胞发生标记。抗体BT34/A5和BT54/B8也不能与得自一个个体的正常人星形细胞发生标记。相对亲和性为了确定5种HMAb的相对抗体亲和性，使用改进的De Bernado和Davies(1987)方法。在长时间(18小时)或短时间(4小时)于4℃孵育后，5种HMAb与病人BT-37(多形性成胶质细胞瘤)的肿瘤抽提物的ELISA结果用O.D.测量值表示。对两个时间点各HMAb的O.D.读数的比较揭示，对BT32/A6和BT54/B8而言，孵育时间更长会得到统计学上显著性(p＜0.05)的增加。其他3种HMAb(BT27/A6BT27/2A3和BT34/A5)中没有一种表现出在4℃长时间孵育后反应性的显著增加。这些观察结果暗示，BT32/A6和BT54/B8在低温下是低亲和性抗体。
在长时间孵育(4℃18小时)后，所有的5种HMAb都由ELISA证实与对照相比呈阳性(p＜0.05)，然而在短时间孵育(4℃4小时)后，只有BT27/A6、BT27/2A3和BT34/A5呈明显阳性；而BT32/A6和BT54/B8并不起阳性反应，这可能是因为它们的低亲和性本质。初步的抗原鉴定检查了培养的神经外皮细胞系的总脂类抽提物的斑点印迹。LN-340和M-4神经胶质瘤和黑素瘤细胞系是以前显示不与5种HMAb中任何一种反应的神经胶质瘤和黑素瘤细胞系。与对照HMAb BT27/2D2相比，当用来自神经胶质瘤细胞系U-373的糖脂测试时，表现出某种程度的对5种HMAb的潜在反应性。至于神经胶质瘤系SK-MG-1，除BT54/B8之外的所有HMAb都表现出与脂类抽提物有某种程度反应性，尽管这些斑点印迹的质量并不完全令人满意。
对从SK-MG-1神经胶质瘤细胞制备而得的总脂类抽提物进行免疫色谱，其中使用BT34/A5和亲代系TM-H2作为对照。观察到单一的Rf＝0.60特异性条带。此外，在BT34/A5和TM-H2泳道中都有Rf＝0.80的非特异性条带。在另外试验中，与BT/2D2相比，BT27/1A2和BT27/2A3都获得了类似结果，即Rf＝0.60的特异性条带。用HMAbBT54/B8进行的免疫色谱不能揭示存在任何特异性的条带格局，但该结果与斑点印迹试验是一致的。
这些结果暗示，HMAb识别糖脂或神经节苷脂的决定簇，该决定簇在糖蛋白的相关检查中没有检测出。附图的简述
图1A-1D是刮下的SK-MG-1细胞的流式细胞计量术分析图。
图2A和2B是可通透用BT32/A6(图2B)标记的PI的神经胶质瘤细胞相对对照(图2A)的流式细胞计量术图。
图3显示了在不同分流比下传代汇合的SK-MG-1细胞培养物时活细胞对非活细胞的比例。
图4显示在各自分流比下细胞生长速率。
图5显示了在不同分流比下细胞周期各阶段中细胞的相对数目。所示的趋势与图4所示的生长速率的增加是一致的。
图6显示了MAb BT32/A6标记SK-MG-1细胞相对培养物分流比。人单克隆抗体BT32/A6选择MAb BT32/A6用于进一步鉴定。
制备BT32/A6的细胞培养上清液用补充有10％胎牛血清(FBS)、1％L-谷氨酰胺和1％HT(Gibco，Grand Island，NY)的RPMI-1640培养基，在T175平方厘米烧瓶(Costar，Cambridge，MA)或3升搅拌瓶(Kontes，Vineland，NJ)中使细胞生长。在生长4或5天后，当细胞密度为1-2×106/升时，通过在500g离心10分钟而收获上清液。该上清液或者直接使用，或者浓缩和纯化然后再使用。对于细胞培养上清液的浓缩，在minitan浓缩器(millipore，Bradford，MA)中使用下限为10,000分子量的切向流量膜(tangential flow menbrane)。IgM抗体的纯化在含有固定式离子交换ABx(J.T.Baker Inc.，Phillipsburg，NJ)、Q-Sepharose Fast Flow和Superose-6(Pharmacia，Uppsala，Sweden)柱色谱上进行。MAb的最终浓度用多克隆人IgM(Cappel Labs.，Malvern，PA)产生的标准曲线，通过抗原俘获ELISA确定。与报道(Dan，et al.1992)一致，SK-MG-1神经胶质瘤细胞(最初命名为AJ；Pfreundschuh，et al.，1978)的FCM分析揭示，存在两个不同的细胞群，为“小”和“大”细胞(根据前向散射图)。通过用机械方式将细胞从烧瓶上刮下，而从组织培养物上切下SK-MG-1神经胶质瘤细胞，观察结果是基于该神经胶质瘤细胞而获得的。当SK-MG-1细胞用胰蛋白酶或EDTA(它们对细胞的苛刻程度较低)取下时，FCM分析显示只有一种细胞群(结果未示)。对刮下的SK-MG-1细胞的荧光激活分拣揭示，“小”细胞有2.0％的集落形成效率(colony-forming efficiency，CFE)，而“大”细胞的CFE为38.0％，高几乎20倍。当刮下的SK-MG-1神经胶质瘤细胞用PI(碘化丙锭，propidium iodide)单独标记时，仅在“小”细胞而没有在“大”细胞中观察到PI荧光的增加。因为死细胞会被PI标记，因此可以得出结论刮下的SK-MG-1中“大”细胞是活的，而“小”细胞是无活力的。活细胞的表面标记当非活“小”细胞反向进入(backgated)前向散射对90度散射图时，它们在纵坐标上是位置低于活的“大”细胞的单独群。在“大”细胞周围划定一个区域(图1A中区域‘A’)，在所有的FCM样品中都加入PI以进一步协助只允许进入活的和可存活的SK-MG-1神经胶质瘤细胞。在图1B中，标为‘B’的区域为没有被PI标记的SK-MG-1细胞。在‘B’右侧的双峰代表摄人PI的SK-MG-1神经胶质瘤细胞(区域‘C’)，它们是无活力的。双峰分别代表细胞周期中G0/G1和G2/M峰。图1C为同时进入的来自区域‘A’和区域‘B’的SK-MG-1细胞，因此它们是活的并且能够在体外形成集落。这些细胞已被对照MAb所标记。发现这些细胞的平均FITC荧光在加入HMAb BT32/A6后的增加程度＞360％(图1D)。因此人IgM MAbBT32/A6可标记那些有活力并且在体外可形成集落的活SK-MG-1神经胶质瘤细胞的表面。细胞周期非依赖的抗原的表达通过放入可通透PI(图1B，区域‘C’)的并用MAb BT32/A6标记的SK-MG-1神经胶质瘤细胞，研究整个细胞周期中BT32/A6抗原的表达。结果示于图2B，表明在G0/G1和G2/M期中都可标记肿瘤细胞。在细胞周期的S期中SK-MG-1细胞的标记最低，这在图上没有反映。
对细胞周期各阶段标记情况的观察得到下列发现的支持发现在近100％活的SK-MG-1细胞中有荧光增加。在任何时刻，都有一定比例的SK-MG-1细胞处于细胞周期的各阶段。因此近100％细胞被标记必然意味着，处于各细胞周期中的所有SK-MG-1细胞都被MAb BT32/A6所标记。因此，BT32/A6抗原在活细胞表面的表达是不受研究时细胞传代比例和在SK-MG-1培养密度下细胞周期状态的影响。抗原表达和培养物分流比将SK-MG-1神经胶质瘤细胞的汇合培养物以分流比0、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32和1∶64进行传代，然后在标准条件下生长3天，在下列参数方面有明显趋势1)活细胞对非活细胞的比例(图3)，2)细胞生长速度(图4)，和3)在细胞周期G0/G1、S和G2/M期中细胞的相对数目(图5)。在培养物活力(用活细胞对非活细胞的比例确定)和细胞生长速度(用第3天细胞数目(以第0天细胞数目的百分比形式表示)确定)之间存在非常显著的相关性，其r＝0.991，p＜0.01。
相对培养物活力、生长速度和细胞周期阶段而言，在作为培养物分流比函数的MAbBT32/A6对SK-MG-1神经胶质瘤细胞的标记中，没有观察到明显趋势(r＝-0.303，p＞0.05，图6)。所述数据不能反驳虚假设，即使用Student’s t-测试时的回归线斜率为零。因此，MAb BT32/A6对SK-MG-1的标记与下列因素无关1)培养物活力，2)生长速度，和3)研究中传代分流比范围内细胞周期阶段。补体介导的细胞毒性用含有5％FBS和5mM HEPES，pH7.2的RPMI-1640培养基洗涤人神经胶质瘤(SK-MG-1)细胞。将50微升含5×105细胞/毫升的SK-MG-1悬浮液在96孔板(Costar，Cambridge，MA)的园底微滴定孔中，与50微升培养基(对照)或不同稀释度的MAb(测试样品)在室温下孵育2小时。所有样品都重复一次。然后微滴定板在400g离心5分钟。除去上清液，向各孔中加入50微升培养基或1∶10兔补体(Cederlane Laboratories，Hornby，ON，加拿大)稀释液。再在37℃孵育90分钟。孵育后，板在400g离心5分钟并除去25微升上清液，然后置于冰上。在分析结束时，用等体积的0.2％锥虫蓝对细胞悬浮液样品进行染色，在血细胞计数仪上计算活细胞的百分比。计算两个样品的平均活力。因MAb造成的特异细胞毒性的百分比用下列公式确定 结果总结于表4。
表4人MAb BT32/A6的补体依赖的细胞毒性 注a兔补体，b未测试。HMAb BT32/A6和BT34/A5的鉴定用标准程序(Le Boeuf et al.(1989)，Schroeder et al.(1990))，获得HMAb BT32/A6和BT34/A5轻链和重链可变区的DNA序列。从杂交瘤细胞系BT32/A6和BT34/A5中抽提mRNA，并用对V-区序列特异的引物通过PCR扩增V-区cDNA。制备合适的克隆表达载体，在含有氨苄青霉素的LB培养基中使细菌培养物生长。用ALKALI法(Molecular cloning，Maniatis)微量制备双链DNA，用United States Biochemical试剂盒和方案对DNA测序。
因为人IgM的轻链和重链恒定区的DNA序列是已知的，所以对人IgM可变区的测序将导致对其的完全鉴定。
在序列表中给出了各种序列。HMAb BT34/A5具有编码VH(μ)链的363个核苷酸的cDNA序列(SEQ ID NO1)。还阐述了30个核苷酸长的、VH(μ)BT34/A5的部分信号序列(SEQ ID NO2)。这些cDNA编码序列显示，BT34/A5 VH(μ)由121个氨基酸残基(SEQ ID NO3)构成，而部分信号序列由10个氨基酸残基构成(SEQ IDNO4)。
HMAb BT34/A5的VL(λ)链具有333个核苷酸的cDNA编码序列(SEQ ID NO5)，编码111个氨基酸残基的蛋白质链(SEQ ID NO6)。还阐述了30个核苷酸的部分信号序列(SEQ ID NO7)，它编码10个氨基酸残基(SEQ ID NO8)。
HMAb BT32/A6的VL(κ)链具有339个核苷酸的cDNA编码序列(SEQ ID NO9)，编码113个氨基酸残基的蛋白质链(SEQ ID NO10)。还阐述了60个核苷酸的信号序列(SEQ ID NO11)，它编码20个氨基酸残基(SEQ ID NO12)。
HMAb BT32/A6的VH(μ)链的序列没有被完全阐明，只有FR1和FR4区的部分序列。因此，该VH(μ)链的部分cDNA编码序列为360个核苷酸(SEQ ID NO13)，它编码120个氨基酸残基的蛋白质链(SEQ ID NO14)。
对这些序列结果的最初分析表明，至少对于BT32/A6的VH(μ)而言，抗原结合位点可能位于CDR3区即SEQ ID NO14中氨基酸92-114。
此处鉴定的V链的超变区或互补决定区(complementarity determining region，CDR)特别令人感兴趣，因为它们中至少部分涉及结合抗原。因此，本发明包括那些具有带CDR的免疫球蛋白轻链和重链可变链的分子，只要其CDR与此处鉴定的CDR具有90％以上的同源性。
因此，HMAb BT34/A5的VH(μ)链具有下列互补决定区(CDR)CDR1SEQ ID NO15CDR2SEQ ID NO16CDR3SEQ ID NO17HMAb BT34/A5的VL(λ)链具有下列CDRCDR1SEQ ID NO18CDR2SEQ ID NO19CDR3SEQ ID NO20HMAb BT32/A6的VH(μ)链具有下列CDRCDR1SEQ ID NO21CDR2SEQ ID NO22CDR3SEQ ID NO23HMAb BT32/A6的VL(K)链具有下列CDRCDR1SEQ ID NO24CDR2SEQ ID NO25CDR3SEQ ID NO26讨论此处所示的数据显示，被MAb BT32/A6识别的抗原的表达是独特的，因为不论培养密度、培养活力或细胞周期阶段，几乎100％SK-MG-1细胞都表达这种抗原(用FCM确定)。由于HMAb BT34/A5与BT32/A6的相似性，对于BT34/A5的结合预计有类似的结果。该抗原识别是非常不寻常的，其理由是恶性神经胶质瘤一般被认为是异质性肿瘤，所以找到给定肿瘤的所有细胞中共有的生物特性是不同寻常的。事实上，异质性是大多数(如果不是全部的话)瘤形成组织的共同特征；它可能是通过“正常的”机制而发生，也可能是由于该癌细胞特有的增强的遗传不稳定性所造成的。这暗示，按最严格意义，术语“肿瘤异质性”应保留给在细胞谱系中存在差异的情况。细胞周期效应和其他渐成现象在肿瘤细胞多样性上又增加了复杂程度。
存在少数肿瘤特异性MAb，它们可识别100％所有的瘤形成细胞，即使在如SK-MG-1这样的高传代系中。在一次采用计算机辅助的细胞荧光计量术研究中，Stavrou等人(1989)报道了两种这样的MAb，MUC8-22和MUC2-63，可识别100％某种培养的星形细胞瘤和成胶质细胞瘤系(如86HG-63，86HG-39)，尽管这种观察结果是罕见的。与作者同组的研究者发现，显示与抗体结合的细胞百分比在不同细胞系之间，甚至在各细胞系不同传代之间有所变化。
Kokunai等人(1990)报道，一种人MAb(CLN-IgG)识别神经胶质瘤相关的抗原，该抗原的表面表达受细胞周期状态的影响。已表明，在神经胶质瘤细胞表面上，被CLN-IgG识别的抗原的表达在细胞周期G2/M期时明显增加，而在G0/G1期显著减少。这些发现具有重要的治疗含义，因为最常规的辅助治疗(如放疗、化疗)针对处于细胞周期中的肿瘤细胞，而认为肿瘤干细胞所存在的地方是有丝分裂相对静止的、非细胞周期中的细胞群。如果基于MAb的肿瘤免疫治疗要成功的话，它必须针对那些处于有丝分裂静止的肿瘤细胞以及活跃分裂的肿瘤细胞。该需求意味着，MAb必须针对谱系依赖的而不是细胞周期依赖的肿瘤相关抗原。
迄今为止，其他只有一个报道涉及针对星形细胞瘤相关抗原的MAb，其中该抗原以细胞周期非依赖方式表达(Sarawar et al.，1991)，如FCM分析所示。这种特定的MAb被命名为M2，它是一种识别在大量不同的中枢神经系统肿瘤中表达的抗原决定簇的鼠MAb，这些肿瘤包括青少年星形细胞瘤、室管膜瘤、成神经管细胞瘤、脑膜瘤和少突神经胶质细胞瘤。还发现M2可与正常成人脑中所有区域中的星形细胞和少量神经元以及胎儿脑反应。
因此，人MAb BT32/A6识别与细胞周期非依赖的、在100％活SK-MG-1细胞上而不是在培养的正常人星形细胞上表达的神经胶质瘤相关抗原。BT32/A6抗原的表达不受细胞密度、生长速度或培养物活力的影响。该特征使MAb BT332/A6(以及可类似地获得的其他MAb)可以非常好地适用于治疗人恶性神经胶质瘤的辅助治疗中。通过构建基于MAb BT332/A6可变区序列的免疫毒素，可以在体内导向增殖中(S、G2/M)以及非增殖中(G0/G1)的神经胶质瘤细胞。
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序列表(1)一般信息(i)申请人Michael D.Dan(ii)发明名称对细胞周期非依赖的神经胶质瘤表面抗原特异的人单克隆抗体(iii)序列数目26(iv)通信地址(A)收信人Ridout & Maybee(B)街道2300 Richmond-Adelaide Centre101 Richmon Street West(C)城市Toronto(D)州Ontario(E)国家加拿大(F)邮编M5C3B1(v)计算机可读介质(A)记录介质类型磁盘-3.5英寸，1.4Mb(B)计算机IBM PC兼容型(C)操作系统MS-DOS 6.00(D)软件Workperfect 5.1(vi)本申请数据(A)申请号(B)申请日(C)分类(vii)在先申请不适用(viii)律师/代理人信息(A)姓名Lake，James R.
(B)登记号(C)参考/案卷号NOVBI/1H(ix)通讯信息(A)电话(416)868-1482(B)传真(416)362-0823(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)长度363碱基对(B)类型核酸(C)股性单链(D)拓扑结构 线性(xi)序列描述SEQ ID NO1CAG GTT CAG CTG GTG CAG TCT GGA GCT GAG GTG AAG AAG CCT GGG GCC 48TCA GTG AAA GTC TCC TGC AAG GCT TCT GGT TAC ACC TTC ACC ACC TAT 96GGT CTC AGC TGG GTG CGA CAG GCC CCT GGA CAA GGG CTT GAG TGG ATG 144GGA TGG ATC AGC GCT CAC AAT GGT AAC ACA AAC TCT GCA CAG AAG TTC 192CAG GGC AGA GTC TCC ATG ACC ACA GAC ACA TCC ACG AGC ACA GCC TAC 240ATG GAG GTG AGG AGC CTC AGA TCT GAC GAC ACG GCC GTG TAT TAC TGT 288GCG CGA GTC GGG GTA TGG GAC CTA TTG AAC TAC TTT GAC TAC TGG GGC 336CAG GGA ACC CTG GTC ACC GTC TCC TCA 363(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)长度30碱基对(B)类型核酸(C)股性单链(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQ ID NO2TTG GTG GCA GCA GCA ACA GGT GCC CAC TCC30(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)长度121氨基酸(B)类型氨基酸(C)股性不适用(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQ ID NO3Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala5 10 15Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr20 25 30Gly Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met35 40 45Gly Trp Ile Ser Ala His Asn Gly Asn Thr Asn Ser Ala Gln Lys Phe50 55 60Gln Gly Arg Val Ser Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Glu Val Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Val Gly Val Trp Asp Leu Leu Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly100 105 110Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)长度10氨基酸(B)类型氨基酸(C)股性不适用(D)拓扑结构线性
(xi)序列描述SEQ ID NO4Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly Ala His Ser5 10(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)长度333碱基对(B)类型核酸(C)股性单链(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQ ID NO5CAG TCT GTG CTG ACT CAG CCA CCC TCA GCG TCT GGG ACC CCC GGG CAG 48AGG GTC ACC ATC TCT TGT TCT GGA AGC AGC TCC AAC ATC GGA ACT AAT 96ACT GTA AAC TGG TAC CTG CAG CTC CCA GGA ACG GCC CCC AAA GTC CTC 144ATC TAT AGT AAT AAT CAG CGG CCC TCA GGG GTC CCT GAC CGA TTC TCT 192GGC TCC AAG TCT GGC ACC TCA GCC TCC CTG GCC ATC AGT GGA CTC CAG 240TCT GAG GAT GAG GCT GAT TAT TTC TGT GCA GCA TGG GAT GAC AGC CTG 288AAA GGT GTG GTA TTC GGC GGA GGG ACC AAG CTG ACC GTC CTA GGT 333(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)长度111氨基酸(B)类型氨基酸(C)股性不适用(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQ ID NO6Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln5 10 15Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Thr Asn20 25 30Thr Val Asn Trp Tyr Leu Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Val Leu35 40 45Ile Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser50 55 60Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln65 70 75 80Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu85 90 95Lys Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly100 105 110(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)长度30碱基对(B)类型核酸(C)股性单链(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQ ID NO7CTC CTC ACT CAC TGT GCA GGG TCC TGG GCC 30(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)长度10氨基酸(B)类型氨基酸(C)股性不适用(D)拓扑结构线性
(xi)序列描述SEQ ID NO8Leu Leu Thr His Cys Ala Gly Ser Trp Ala5 10(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)长度339碱基对(B)类型核酸(C)股性单链(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQ ID NO9GAT ATT GTG ATG ACC CAG ACT CCA CTC TCC CTG CCC GTC ACC CCT GGA 48GAG CCG GCC TCC ATC TCC TGC AGG TCT AGT CAG AGC CTC TTG GAT AGT 96GAT GAT GGA AAC ACC TAT TTG GAC TGG TAC CTG CAG AAG CCA GGG CAG 144TCT CCA CAG CTC CTG ATC TAT ACG CTT TCC TAT CGG GCC TCT GGA GTC 192CCA GAC AGG TTC AGT GGC AGT GGG TCA GGC ACT GAT TTC ACA CTG AAA 240ATC AGC AGG GTG GAG GCT GAG GAT GTT GGA GTT TAT TAC TGC ATG CAA 288CGT ATA GAG TTT CCT TTC ACT TTC GGC GGA GGG ACC AAG GTG GAG ATC 336AAA 339(2)SEQ ID NO10的信息(i)序列特征(A)长度113氨基酸(B)类型氨基酸(C)股性不适用(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQ ID NO10Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly5 10 15Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser20 25 30Asp Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln35 40 45Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Leu Ser Tyr Arg Ala Ser Gly Val50 55 60Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys65 70 75 80Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln85 90 95Arg Ile Glu Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile100 105 110Lys(2)SEQ ID NO11的信息(i)序列特征(A)长度60碱基对(B)类型核酸(C)股性单链(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQ ID NO11ATG AGG CTC CCT GCT CAG CTC CTG GGG CTG CTA ATG CTC TGG GTC CCT 48GGA TCC AGT GAG 60(2)SEQ ID NO12的信息(i)序列特征(A)长度20氨基酸(B)类型氨基酸(C)股性不适用(D)拓扑结构线性
(xi)序列描述SEQ ID NO12Met Arg Leu Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Met Leu Trp Val Pro5 10 15Gly Ser Ser Glu20(2)SEQ ID NO13的信息(i)序列特征(A)长度360碱基对(B)类型核酸(C)股性单链(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQ ID NO13GGG GGA GGC TTG GTC CAG CCT GGG GGG TCC CTG AGA CTC TCC TGT TCA 48GCC TCT GGA TTC ACC TTC AGT AGC TAT GCT ATG CAC TGG GTC CGC CAG 96GCT CCA GGG AAG GGA CTG GAA TAT GTT TCG GCT ATT AGT AGT AAT GGG 144GGT AGC ACA TAC TAC GCA GAC TCC GTG AAG GGC AGA TTC ACC ATC TCC 192AGA GAC AAT TCC AAG AAC ACT CTG TAT CTT CAA ATG AGC AGT CTG AGA 240GCT GAG GAC ACG GCT GTG TAT TAC TGT GTG AAA GAC AGG TTA AAA GTG 288GAG TAC TAT GAT AGT AGT GGT TAT TAC GTT TCT CGG TTC GGT GCT TTT 336GAT ATC TGG GGC CAA GGG ACA ACG 360(2)SEQ ID NO14的信息(i)序列特征(A)长度120氨基酸(B)类型氨基酸(C)股性不适用(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQ ID NO14Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser5 10 15Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln20 25 30Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Val Ser Ala Ile Ser Ser Asn Gly35 40 45Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser50 55 60Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg65 70 75 80Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Lys Asp Arg Leu Lys Val85 90 95Glu Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr Val Ser Arg Phe Gly Ala Phe100 105 110Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Thr115 120(2)SEQ ID NO15的信息(i)序列特征(A)长度5氨基酸(B)类型氨基酸(C)股性不适用(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQ ID NO15Thr Tyr Gly Leu Ser5(2)SEQ ID NO16的信息(i)序列特征(A)长度17氨基酸(B)类型氨基酸
(C)股性不适用(D)拓扑结构线性(xi)SEQUENCE DECRIPTIONSEQ ID NO16Trp Ile Ser Ala His Asn Gly Asn Thr Asn Ser Ala Gln Lys Phe Gln5 10 15Gly(2)SEQ ID NO17的信息(i)序列特征(A)长度12氨基酸(B)类型氨基酸(C)股性不适用(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQ ID NO17Val Gly Val Trp Asp Leu Leu Asn Tyr Phe Asp Tyr5 10(2)SEQ ID NO18的信息(i)序列特征(A)长度13氨基酸(B)类型氨基酸(C)股性不适用(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQ ID NO18Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Thr Asn Thr Val Asn5 10(2)SEQ ID NO19的信息(i)序列特征(A)长度7氨基酸(B)类型氨基酸(C)股性不适用(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQ ID NO19Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser5(2)SEQ ID NO20的信息(i)序列特征(A)长度11氨基酸(B)类型氨基酸(C)股性不适用(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQ ID NO20Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Lys Gly Val Val5 10(2)SEQ ID NO21的信息(i)序列特征(A)长度5氨基酸(B)类型氨基酸(C)股性不适用(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQ ID NO21Ser Tyr Ala Met His5(2)SEQ ID NO22的信息(i)序列特征(A)长度17氨基酸(B)类型氨基酸(C)股性不适用(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQ ID NO22Ala Ile Ser Ser Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys5 10 15Gly(2)SEQ ID NO23的信息(i)序列特征(A)长度23氨基酸(B)类型氨基酸(C)股性不适用(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQ ID NO23Asp Arg Leu Lys Val Glu Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr Val Ser5 10 15Arg Phe Gly Ala Phe Asp Ile20(2)SEQ ID NO24的信息(i)序列特征(A)长度17氨基酸
(B)类型氨基酸(C)股性不适用(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQ ID NO24Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Asp Gly Asn Thr Tyr Leu5 10 15Asp(2)SEQ ID NO25的信息(i)序列特征(A)长度7氨基酸(B)类型氨基酸(C)股性不适用(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQ ID NO25Thr Leu Ser Tyr Arg Ala Ser5(2)SEQ ID NO26的信息(i)序列特征(A)长度9氨基酸(B)类型氨基酸(C)股性不适用(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQ ID NO26Met Gln Arg Ile Glu Phe Pro Phe Thr权利要求
1.一种分离的、编码人单克隆抗体BT34/A5的重链μ亚组(VH(μ))的可变区的DNA，其特征在于，它具有SEQ ID NO1的核苷酸序列。
2.如权利要求1所述的分离的DNA，其特征在于，它还含有从该DNA的5’端延伸出的核苷酸信号序列，该信号序列在其3’端含有SEQ ID NO2的核苷酸序列。
3.一种分离的、编码人单克隆抗体BT34/A5的轻链λ亚组(VL(λ))的可变区的DNA，其特征在于，它具有SEQ ID NO5的核苷酸序列。
4.如权利要求3所述的分离的DNA，其特征在于，它还含有从该DNA的5’端延伸出的核苷酸信号序列，该信号序列在其3’端含有SEQ ID NO7的核苷酸序列。
5.一种分离的、编码人单克隆抗体BT32/A6的重链μ亚组(VH(μ))的可变区的DNA，其特征在于，它具有SEQ ID NO13的核苷酸序列。
6.一种分离的、编码人单克隆抗体BT32/A6的轻链κ亚组(VL(κ))的可变区的DNA，其特征在于，它具有SEQ ID NO9的核苷酸序列。
7.如权利要求6所述的分离的DNA，其特征在于，它还含有从该DNA的5’端延伸出的核苷酸信号序列，该信号序列在其3’端含有SEQ ID NO11的核苷酸序列。
8.具有SEQ ID NO3的氨基酸序列的免疫球蛋白VH(μ)链。
9.如权利要求8所述的VH(μ)链，其特征在于，它还含有位于其C末端处、具有SEQ ID NO4的氨基酸序列的信号序列。
10.一种免疫球蛋白VH(μ)链，其特征在于，它的互补决定区(CDR)具有SEQ IDNO15(CDR1)、SEQ ID NO16(CDR2)和SEQ ID NO17(CDR3)的氨基酸序列、或者与其具有至少90％同源性的序列。
11.具有SEQ ID NO6的氨基酸序列的免疫球蛋白VL(λ)链。
12.如权利要求11所述的VL(λ)链，其特征在于，它还含有位于其C末端处、具有SEQ ID NO8的氨基酸序列的信号序列。
13.一种免疫球蛋白VL(λ)链，其特征在于，它的CDR具有SEQ ID NO18(CDR1)、SEQ ID NO19(CDR2)和SEQ ID NO20(CDR3)的氨基酸序列、或者与其具有至少90％同源性的序列。
14.一种免疫球蛋白，其特征在于，其VH(μ)链和VL(λ)链分别具有SEQ ID NO3和SEQ ID NO4所示的氨基酸序列。
15.如权利要求14所述的免疫球蛋白，其特征在于，它是单克隆抗体。
16.如权利要求14所述的免疫球蛋白，其特征在于，它是同种型M。
17.人单克隆抗体BT34/A5。
18.一种免疫结合物，其特征在于，它具有VH(μ)链，该VH(μ)链的CDR具有SEQID NO15(CDR1)、SEQ ID NO16(CDR2)和SEQ ID NO17(CDR3)的氨基酸序列、或者与其具有至少90％同源性的序列，以及它具有VL(λ)链，该VL(λ)链的CDR具有SEQ ID NO18(CDR1)、SEQ ID NO19(CDR2)和SEQ ID NO20(CDR3)的氨基酸序列、或者与其具有至少90％同源性的序列。
19.如权利要求18所述的免疫球蛋白结合物，其特征在于，它是免疫毒素。
20.具有SEQ ID NO14的氨基酸序列的免疫球蛋白VH(μ)链。
21.一种免疫球蛋白VH(μ)链，其特征在于，它的CDR具有SEQ ID NO21(CDR1)、SEQ ID NO22(CDR2)和SEQ ID NO23(CDR3)的氨基酸序列、或者与其具有至少90％同源性的序列。
22.具有SEQ ID NO10的氨基酸序列的免疫球蛋白VL(κ)链。
23.如权利要求22所述的VL(κ)链，其特征在于，它还含有位于其C末端处、具有SEQ ID NO12的氨基酸序列的信号序列。
24.一种免疫球蛋白VL(κ)链，其特征在于，它的CDR具有SEQ ID NO24(CDR1)、SEQ ID NO25(CDR2)和SEQ ID NO26(CDR3)的氨基酸序列、或者与其具有至少90％同源性的序列。
25.一种免疫球蛋白，其特征在于，其VH(μ)链分别具有SEQ ID NO14和SEQ IDNO10所示的氨基酸序列。
26.如权利要求25所述的免疫球蛋白，其特征在于，它是单克隆抗体。
27.如权利要求26所述的免疫球蛋白，其特征在于，它是同种型M。
28.人单克隆抗体BT32/A6。
29.一种免疫结合物，其特征在于，它具有VH(μ)链，该VH(μ)链的CDR具有SEQID NO21(CDR1)、SEQ ID NO22(CDR2)和SEQ ID NO23(CDR3)的氨基酸序列、或者与其具有至少90％同源性的序列，以及它具有VL(κ)链，该VL(κ)链的CDR具有SEQ ID NO24(CDR1)、SEQ ID NO25(CDR2)和SEQ ID NO26(CDR3)的氨基酸序列、或者与其具有至少90％同源性的序列。
30.如权利要求29所述的免疫球蛋白结合物，其特征在于，它是免疫毒素。
31.一种细胞周期非依赖的、神经胶质瘤相关的细胞表面抗原，其特征在于，它被HMAb BT32/A6特异性结合，而且该抗原不存在于正常人星形细胞的表面。
32.一种细胞周期非依赖的、神经胶质瘤相关的细胞表面抗原，其特征在于，它被HMAb BT34/A5特异性结合，而且该抗原不存在于正常人星形细胞的表面。
全文摘要
本发明通过阐述编码cDNA而表征了两种IgM同种型的人单克隆抗体(HMAb)的可变链。HMAb可特异性地针对细胞周期非依赖的、神经胶质瘤相关的抗原，而且该抗体不识别培养的正常人星形细胞，基于鉴别出的序列的免疫结合物可以在体内导向增殖中以及非增殖中的神经胶质瘤细胞，从而提供治疗这些肿瘤有用的辅助疗法。
文档编号C07K14/47GK1151184SQ95193668
公开日1997年6月4日 申请日期1995年6月16日 优先权日1994年6月21日
发明者迈克尔·D·丹 申请人:迈克尔·D·丹