专利名称：依赖细胞周期蛋白的激酶的n－[5－[[[5－烷基－2－噁唑基]甲基]硫基]－2－噻唑基 ...的制作方法
相关申请本申请是于1999年12月15日递交的美国专利申请顺序号09/464,511的部分继续申请。
本发明概述本发明涉及式I的化合物及其对映异构体、非对映异构体和药学上可接受的盐 其中R是烷基；R1和R2各独立是氢或烷基；R3是氢或烷基，和R4是氢或由一个或两个羟基或一个NR5R6基团取代的烷基，或R3和R4与它们所连接的氮原子一起形成4-到7-元杂环，其中R3R4由-(CH2)n-代表，其中n是3、4、5或6的整数；R5和R6各独立是氢、烷基、取代的烷基、环烷基或取代的环烷基，或R5和R6与它们所连接的氮原子一起形成4-到7-元杂环，其中R5R6由-(CH2)m-代表，其中m是3、4、5或6的整数；和X是CH或N。
式I的化合物特别用作有效的蛋白激酶抑制剂并用于治疗增生性疾病例如癌症、炎症和关节炎。它们也可用于治疗早老性痴呆、化疗引起的脱发和心血管疾病。
本发明详述本发明提供式I的化合物、含有这些化合物的药用组合物以及使用这些化合物的方法。
以下列出了许多用于描述本发明化合物术语的定义。这些定义适用于整个说明书中所使用的、单独或作为大基团一部分的术语(除非它们在特殊情况下有其它限制)。
术语“烷基”或“alk”表示一价烷(烃)衍生的基团，除了另外定义外，该基团含有1-12个、优选1-6个和更优选1-4个碳原子。烷基是任选取代的直链、支链或环状的饱和烃基团。当取代时，烷基可以在任何合适的连接点上由最多可达4个取代基(如所定义的R7)取代。当所述烷基被说成由烷基取代时，这种说法与“支链烷基”互换使用。典型的未取代的这类基团包括甲基、乙基、丙基、异丙基、正-丁基、叔-丁基、异丁基、戊基、己基、异己基、庚基、4，4-二甲基戊基、辛基、2，2，4-三甲基戊基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基等。典型的取代基包括、但不限于一个或更多个以下的基团卤代基(如F、Cl、Br或I)卤代烷基(如CCl3或CF3)、烷氧基、烷基硫基、羟基、羧基、烷基羰基、烷氧基羰基、烷基羰基氧基、氨基、氨基甲酰基、脲基、脒基(amidinyl)或硫羟基。
环烷基是含有3-15个碳原子、在碳原子之间没有更迭或共振双键的烷基。它可以包括1-4个环。典型的未取代的这类基团包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基等。典型的取代基包括一个或更多个以下基团卤素、烷基、烷氧基、烷基羟基、氨基、硝基、氰基、硫羟基和/或烷基硫基。
本文使用的术语“烷氧基”或“烷基硫基”指如上所述的、分别通过氧键(-O-)或硫键(-S-)连接的烷基。
本文使用的术语“烷氧基羰基”指通过羰基连接的烷氧基。烷氧基羰基由下式代表-C(O)OR8，其中R8是直链或支链C1-6烷基。
术语“烷基羰基”指通过羰基连接的烷基。
本文使用的术语“烷基羰基氧基”指通过氧键连接的烷基羰基。
适用于本发明所述方法和组合物中的式I化合物的药学上可接受的盐包括、但不限于与多种有机和无机酸形成的盐，所述酸例如是盐酸、羟基甲磺酸、氢溴酸、甲磺酸、硫酸、乙酸、三氟乙酸、马来酸、苯磺酸、甲苯磺酸，以及许多其它的盐如硝酸盐、磷酸盐、硼酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐、苯甲酸盐、抗坏血酸盐、水杨酸盐等。另外，式I化合物的药学上可接受的盐可以由碱金属如钠、钾和锂；碱土金属如钙和镁；有机碱如二环己基胺、三丁基胺和吡啶等；及氨基酸如精氨酸、赖氨酸等形成。
打算包括所有本发明化合物的立体异构体，无论是混合物还是纯的或基本纯的形式。根据本发明化合物的定义包括所有可能的立体异构体和它们的混合物。尤其包括外消旋形式和具有特殊活性的离析的旋光异构体。这些外消旋形式可以通过物理的方法拆分，例如非对映异构体衍生物的分级结晶、分离或结晶，或通过手性柱层析分离。单一的光学异构体可以通过常规方法如与旋光性的酸形成盐，随后结晶由外消旋物得到。
打算包括本发明化合物的所有构型异构体，无论是混合物还是纯的或基本纯的形式。本发明化合物的定义特别包括环烷基环的顺式和反式异构体。
应该理解，式I化合物的溶剂合物(如水合物)也包括在本发明范围内。溶剂化方法通常为本领域已知的。因此，本发明的化合物可以是游离的或水合物的形式，可以通过以下方案所列举的方法得到。
如在方案1中所示，式I的化合物可通常通过式II的胺与式III的羧酸在偶合剂如1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐或1，3-二环己基碳二亚胺存在下，任选在碱存在下反应制备。方案1 如在方案2中所示，式I的化合物也可以通过式II的胺与式IV的羧酸在偶合剂如1，3-二环己基碳二亚胺或1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐存在下反应，形成式V的中间体化合物，并使所述中间体化合物与式VI的胺反应制备。方案2 如在方案3中所示，式I的化合物，其中R2是氢，可以通过式VII的羧酸与草酰氯反应形成酰氯中间体，使所述酰氯中间体与式II的胺反应形成式VIII的醛中间体，再使所述醛中间体与式VI的胺在还原剂如三乙酰氧基硼氢化钠存在下反应来制备。方案3 如在方案4中所示，式I的化合物，其中R2是烷基，可以通过式VIII的醛与式IX的溴化烷基镁反应形成式X的醇，使所述式X的醇与亚硫酰氯反应形成式XI的氯化物，再使所述氯化物与式VI的胺反应来制备。方案4 另外，在本文所提供的实施例中叙述了用于制备本发明式I化合物的其它方法。
可以如在方案5中所示制备式II的原料胺。式XII的α-溴酮可以与叠氮化钠在溶剂如二甲基甲酰胺中反应，得到叠氮酮衍生物XIII，将其用还原剂如氢在披钯碳催化剂或三苯膦存在下还原，得到氨基酮XIV。或者，化合物XIV可以通过式XII的α-溴酮与六亚甲基四胺在溶剂如丙酮中反应，得到式XV的化合物，将该化合物用酸性介质如盐酸的乙醇溶液水解来制备。式XIV的化合物可以用试剂如2-氯代乙酰氯酰化，得到式XVI的酰胺。用脱水剂如三氯氧化磷在甲苯中或Burgess’试剂在四氢呋喃中将式XVI的酰胺环化为式XVII的2-氯代甲基噁唑。式XVII的氯代甲基噁唑与硫脲在溶剂如乙醇中反应，得到硫脲衍生物XVIII，它可以与5-溴代-2-氨基噻唑在碱如氢氧化钾的醇溶液存在下反应，得到式II的胺。或者，式XVII的氯代甲基噁唑衍生物与5-氰硫基-2-氨基噻唑在还原剂如硼氢化钠存在下反应，得到式II的化合物。方案5 方案5(续) 优选的式I化合物是这样一些化合物，其中R是叔-丁基；R1和R2各独立是氢或甲基；R3是氢和R4是氢、-CH2C(CH3)2CH2OH、-CH2CH2OH、-C(CH3)2CH2OH、-CH(CH2OH)2、-CH2CH(OH)CH2OH、-CH(CH3)CH2OH或 或R3和R4与它们所连接的氮原子一起形成5-元杂环，其中R3R4由-(CH2)4-代表；和X是CH或N。
第一组更优选的本发明的化合物是这样一些式Ia的化合物及其对映异构体、非对映异构体和药学上可接受的盐 其中R1和R2各独立是氢或甲基；和R3是氢，和R4是氢、-CH2C(CH3)2CH2OH、-CH2CH2OH、-C(CH3)2CH2OH、-CH(CH2OH)2、-CH2CH(OH)CH2OH、-CH(CH3)CH2OH或 或R3和R4与它们所连接的氮原子一起形成5-元杂环，其中R3R4由-(CH2)4-代表。
第二组更优选的本发明的化合物是这样一些式Ib的化合物及其对映异构体、非对映异构体和药学上可接受的盐 其中R1和R2各独立是氢或甲基；和R3是氢，和R4是氢、-CH2C(CH3)2CH2OH、-CH2CH2OH、-C(CH3)2CH2OH、-CH(CH2OH)2、-CH2CH(OH)CH2OH、-CH(CH3)CH2OH或 或R3和R4与它们所连接的氮原子一起形成5-元杂环，其中R3R4由-(CH2)4-代表。
第三组更优选的本发明的化合物是这样一些式Ic的化合物及其对映异构体、非对映异构体和药学上可接受的盐 其中R1和R2各独立是氢或甲基；和R3是氢，和R4是氢、-CH2C(CH3)2CH2OH、-CH2CH2OH、-C(CH3)2CH2OH、-CH(CH2OH)2、-CH2CH(OH)CH2OH、-CH(CH3)CH2OH或 或R3和R4与它们所连接的氮原子一起形成5-元杂环，其中R3R4由-(CH2)4-代表。
一组最优选的本发明化合物是这样一些式Ia、Ib和Ic的化合物，其中R4不是氢。
特别用于本发明方法中的式I化合物包括N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-[[[2-羟基-1-(羟基甲基)乙基]氨基]甲基]苯乙酰胺；4-[[(2，3-二羟基丙基)氨基]甲基]-N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]苯乙酰胺；(R)-4-[[(2，3-二羟基丙基)氨基]甲基]-N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]苯乙酰胺；(S)-4-[[(2，3-二羟基丙基)氨基]甲基]-N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]苯乙酰胺；4-(氨基甲基)-N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]苯乙酰胺；N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-[[(3-羟基-2，2-二甲基丙基)氨基]甲基]苯乙酰胺；N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-(1-吡咯烷基甲基)苯乙酰胺；N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-[[(2-羟基乙基)氨基]甲基]苯乙酰胺；N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-[[[2-(1-吡咯烷基)乙基]氨基]甲基]苯乙酰胺；N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-[[(2-羟基-1，1-二甲基乙基)氨基]甲基]苯乙酰胺；N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-3-[[(2-羟基乙基)氨基]甲基]苯乙酰胺；N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-3-[[(3-羟基-2，2-二甲基丙基)氨基]甲基]苯乙酰胺；3-(氨基甲基)-N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]苯乙酰胺；N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-[[(2-羟基-1-甲基乙基)氨基]甲基]苯乙酰胺；N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-[1-[(2-羟基乙基)氨基]乙基]苯乙酰胺；N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-[1-[(2-羟基-1-甲基乙基)氨基]乙基]苯乙酰胺；(αS)-N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-[[(2-羟基乙基)氨基]甲基]-α-甲基苯乙酰胺；N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-6-[[(2-羟基乙基)氨基]甲基]-3-吡啶乙酰胺；和N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-[[(2-羟基乙基)氨基]甲基]-α-甲基苯乙酰胺；及其药学上可接受的盐。
本发明的化合物具有药理学特性，特别是式I的化合物是蛋白激酶如依赖细胞周期蛋白的激酶(cdks)，例如cdc2(cdk1)、cdk2、cdk3、cdk4、cdk5、cdk6、cdk7和cdk8的抑制剂。预期新的式I化合物用于增生性疾病如癌症、炎症、关节炎、早老性痴呆和心血管疾病的疗法中。这些化合物也可以用于治疗局部和系统性真菌感染。
尤其是，式I的化合物用于治疗多种癌症，包括(但不限于)以下癌症-癌，包括膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、肾癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、宫颈癌、甲状腺癌、前列腺癌和皮肤癌；-淋巴系的造血肿瘤，包括急性淋巴白血病、B-细胞淋巴瘤和伯基特淋巴瘤；-骨髓系的造血肿瘤，包括急性和慢性髓细胞白血病和前髓细胞白血病；-间充质源的肿瘤，包括纤维肉瘤和横纹肌肉瘤；和-其它肿瘤，包括黑素瘤、精原细胞瘤、畸胎瘤、骨肉瘤、成神经细胞瘤和神经胶质瘤。
由于cdks在全身性细胞增殖的调节中的关键作用，所以作为可逆的细胞生长抑制剂的抑制剂可以用于治疗任何以细胞增殖异常为特征的疾病过程例如神经纤维瘤病、动脉粥样硬化、肺纤维化、关节炎、银屑病、肾小球肾炎、血管成形术或血管术后的再狭窄、肥大性疤痕形成、炎性肠道疾病、移植术排斥反应、血管生成和内毒素性休克。
式I的化合物也可以用于治疗早老性痴呆，正如近期发现cdk5涉及Tau蛋白的磷酸化作用(J.Biochem，117，741-749(1995))所提示的。
式I的化合物也可以作为其它蛋白激酶如蛋白激酶C、her2、raf1、MEK1、MAP激酶、EGF受体、PDGF受体、IGF受体、PI3激酶、wee1激酶、Src、Ab1、VEGF和1ck的抑制剂，并因此在治疗与其它蛋白激酶有关的疾病中有效。
式I的化合物也诱导或抑制细胞凋亡，一种对于正常发育和体内稳态至关重要的生理细胞死亡过程。细胞凋亡途径的改变成为许多人类疾病的致病原因。式I的化合物，作为细胞凋亡的调节剂将用于治疗许多与细胞凋亡失常有关的人类疾病，包括癌症(特别是，但不限于滤泡性淋巴瘤、伴有p53突变的癌、乳腺、前列腺和卵巢的激素依赖性肿瘤和癌变前的损害如家族性腺瘤样息肉病)、病毒性感染(包括但不限于疱疹病毒、痘病毒、EB病毒、Sindbis病毒和腺病毒)、自身免疫性疾病(包括但不限于系统性红斑狼疮、免疫调节性肾小球肾炎、类风湿性关节炎、银屑病、炎性肠疾病和自身免疫性糖尿病)、神经变性的疾病(包括但不限于早老性痴呆、AIDS-相关的痴呆、帕金森病、肌萎缩性侧索硬化、色素性视网膜炎、脊柱性肌肉萎缩和小脑变性)、AIDS、脊髓发育不良综合征、再生障碍性贫血、伴有心肌梗死的局部缺血性损伤、中风和再灌注损伤、心律失常、动脉粥样硬化、毒素-诱发的或酒精诱发的肝疾病、血液疾病(包括但不限于慢性贫血和再生障碍性贫血)、肌肉骨骼系统的变性疾病(包括但不限于骨质疏松和关节炎)、阿斯匹林-敏感性鼻窦炎、胰囊性纤维变性、多发性硬化、肾病和癌性痛。
另外，式I的化合物可以用于治疗化疗引起的脱发、化疗引起的血小板减少症、化疗引起的白细胞减少症或mucocitis。在治疗化疗引起的脱发方面，优选以药剂如凝胶、溶液剂、分散剂或糊剂的形式局部使用式I的化合物。
本发明的化合物可以与已知的抗癌疗法如放疗或与细胞生长抑制剂和毒害细胞药联合使用，所述药物包括但不限于微管-稳定剂、微管-破坏剂、烷化剂、抗-代谢药物、表叶毒素、抗肿瘤酶、拓扑异构酶抑制剂、丙卡巴肼、米托蒽醌、铂配位络合物、生物应答调节剂、生长抑制剂、激素/抗激素治疗剂、造血生长因子等。
可以与本发明的式I化合物联合使用的抗癌药物的种类包括但不限于蒽环类抗生素药物、长春花药物、丝裂霉素、平阳霉素、细胞毒核苷、紫杉烷、epothilones、discodermolide、蝶啶类药物、diynenes、芳香酶抑制剂和鬼臼毒素。这些类型的具体成员包括例如紫杉醇、docetaxel、7-O-甲硫基甲基紫杉醇(在US 5,646,176中公开)、3’-叔-丁基-3’-N-叔-丁氧基羰基-4-脱乙酰基-3’-脱苯基-3’-N-脱苯甲酰基-4-O-甲氧基羰基-紫杉醇(在USSN 60/179,965中公开，于2000年2月3日提交，其作为参考结合在本文中)、C-4甲基甲酸酯紫杉醇(在WO94/14787中公开)、epothilone A、epothilone B、epothilone C、epothiloneD、脱氧epothilone A、脱氧epothilone B、[1S-[1]R*，3R*(E)，7R*，10S*，11R*，12R*，16S*]]-7，11-二羟基-8，8，10，12，16-五甲基-3-[1-甲基-2-(2-甲基-4-噻唑基)乙烯基]-4-氮杂-17-氧杂双环[14.1.0]十七烷-5，9-二酮(在WO 99/02514中公开)、[1S-[1R*，3R*(E)，7R*，10S*，11R*，12R*，16S*]]-3-[2-[2-(氨基甲基)-4-噻唑基]-1-甲基乙烯基]-7，11-二羟基-8，8，10，12，16-五甲基-4，17-二氧杂双环[14.1.0]十七烷-5，9-二酮(在USSN09/506,481中公开，于2000年2月17日提交，其作为参考结合在本文中)、多柔比星、去甲柔红霉素、柔红霉素、氨蝶呤、甲氨蝶呤、甲基叶酸、二氯代-甲氨蝶呤、丝裂霉素C、泊非霉素、5-氟尿嘧啶、6-巯基嘌呤、吉西他滨、阿糖胞苷、鬼臼毒素或鬼臼毒素衍生物如依托泊苷、磷酸依托泊苷或替尼泊苷、美法仑、长春碱、长春新碱、长春西定、长春碱酰胺、环氧长春碱等。其它与本发明化合物联合使用的有效的抗癌药物包括但不限于雌莫司汀、顺铂、卡铂、环磷酰胺、平阳霉素、他莫昔芬、异环磷酰胺、美法仑、六甲三聚氰胺、塞替派、阿糖胞苷、idatrexate、三甲曲沙、达卡巴嗪、L-门冬酰胺酶、喜树碱、CPT-11、托泊替堪、阿糖胞苷、比卡鲁胺、氟他胺、亮丙瑞林、吡啶并苯并吲哚衍生物、干扰素、白细胞介素等。另外，本发明的化合物可以与那些在U.S.6,011,029中所公开的法尼基蛋白转移酶抑制剂、抗血管生成剂如制管张素和endostatin、激酶抑制剂如her2特异抗体和p53反式激活的调节剂联合使用。
如果以固定剂量配制，这些组合的产物在以下叙述的剂量范围内使用本发明的化合物及在已批准的剂量范围内使用其它的药用活性剂。当组合制剂不合适时，式I的化合物可以以任何顺序与已知的抗癌药或毒害细胞药序贯使用。
本发明也提供含有本发明化合物和药学上可接受的载体的药用组合物。本发明的药用组合物还可以含有一种或更多种药学上可接受的附加成分如明矾、稳定剂、抗菌剂、缓冲剂、着色剂、调味剂等。本发明的化合物和组合物可以口服或胃肠外给予，包括静脉内、肌内、腹膜内、皮下、直肠和局部途径给予。
对于口服使用而言，本发明的化合物和组合物可以例如以片剂或者胶囊或以溶液或悬浮液的形式给药。在口服使用的片剂的情况下，通常使用的载体包括乳糖和玉米淀粉，并且通常加入润滑剂如硬脂酸镁。对于以胶囊形式口服给药而言，所使用的载体包括乳糖和玉米淀粉。当口服给药使用含水悬浮液时，通常加入乳化剂和/或悬浮剂。另外，对于口服的组合物可以加入甜味剂和/或调味剂。作为肌内、腹膜内、皮下和静脉内使用，通常使用活性成分的无菌溶液，并且将所述溶液的pH值适当地调节和缓冲。对于静脉内使用而言，应该控制所述溶质的总浓度，以便使所述制剂等渗。
对于给予人的本发明化合物的日剂量通常由具有处方权的医师根据病人的年龄、体重、给药途径和病人的个体反应以及病人症状的严重性来决定。优选给予人的本发明的式I化合物的量从每天大约0.001mg/kg体重到大约100mg/kg体重，更优选从每天大约0.01mg/kg体重到大约50mg/kg体重，最优选从每天大约0.1mg/kg体重到大约20mg/kg体重。
cdc2/细胞周期蛋白B1激酶测定通过监测将32P掺入到组蛋白HI中的过程确定cdc2/细胞周期蛋白B1激酶的活性。所述反应物质由溶于激酶缓冲液(50mM Tris，pH8.0，10mM MgCl2，1mM EGTA，0.5mM DTT)中的50ng表达GST-cdc2的杆状病毒、75ng表达GST-细胞周期蛋白B1的杆状病毒、1μg组蛋白HI(Boehringer Mannheim)、0.2μCi的32Pγ-ATP和25μM ATP组成。将该反应物质在30℃下孵育30分钟，然后通过加入冷的三氯乙酸(TCA)至终浓度为15％终止反应，并且在冰上孵育20分钟。用PackardFiltermate Universal收集器将反应物质收获到GF/C unifilter板(Packard)上，并将该滤器在Packard TopCount 96-孔液体闪烁计数器上计数(Marshak，D.R.，Vanderberg，M.T.，Bae，Y.S.，Yu，I.J.，J.of CellularBiochemistry，45，391-400(1991)，作为参考结合在本文中)。
cdk2/细胞周期蛋白E激酶测定通过监测将32P掺入到成视网膜细胞瘤蛋白中的过程确定cdk2/细胞周期蛋白E激酶的活性。所述反应物质由溶于激酶缓冲液(50mMHepes，pH8.0，10mM MgCl2，5mM EGTA，2mM DTT)中的2.5ng表达GST-cdk2/细胞周期蛋白E的杆状病毒、500ng细菌产生的GST-成视网膜细胞瘤蛋白(aa 776-928)、0.2μCi32Pγ-ATP和25μM ATP组成。将该反应物质在30℃下孵育30分钟，然后通过加入冷的三氯乙酸(TCA)至终浓度为15％终止反应，并且在冰上孵育20分钟。用PackardFiltermate Universal收集器将反应物质收获到GF/C unifilter板(Packard)上，并将该滤器在Packard TopCount 96-孔液体闪烁计数器上计数。
cdk4/细胞周期蛋白D1激酶活性通过监测将32P掺入到成视网膜细胞瘤蛋白中的过程确定cdk4/细胞周期蛋白D1激酶的活性。所述反应物质由溶于激酶缓冲液(50mM Hepes，pH8.0，10mM MgCl2，5mM EGTA，2mM DTT)中的165ng表达为GST-cdk4的杆状病毒、282ng细菌表达为S-tag的细胞周期蛋白D1、500ng细菌产生的GST-成视网膜细胞瘤蛋白(aa 776-928)、0.2μCi32Pγ-ATP和25μM ATP组成。将该反应物质在30℃下孵育1小时，然后通过加入冷的三氯乙酸(TCA)至终浓度为15％终止反应，并且在冰上孵育20分钟。用Packard Filtermate Universal收集器将反应物质收获到GF/C unifilter板(Packard)上，并将该滤器在PackardTopCount 96-孔液体闪烁计数器上计数(Coleman，K.G.，Wautlet，B.S.，Morissey，D.，Mulheron，J.G.，Sedman，S.，Brinkley，P.，Price，S.，Webster，K.R.(1997)Identification of CDK4 Sequences involved in cyclin D，andp16 binding.J.Biol.Chem.272，3018869-18874，作为参考结合在本文中)。
为了便于进一步理解本发明，提供主要为了说明其细节的下列实施例。不应该认为本发明的范围受限于这些实施例，而本发明的范围包括全部在权利要求书中所定义的主题内容。
实施例14-(氨基甲基)-N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]苯乙酰胺的制备 A.1-叠氮基-3，3-二甲基-2-丁酮 将1-溴代-3，3-二甲基-2-丁酮(199.07g，1.115mol，1当量)与叠氮化钠(93.9g，1.444mol，1.3当量)在1.785L丙酮中混合。将该反应混合物在室温下搅拌27.5小时。过滤得到的淤浆并用丙酮(3×150mL)洗涤。在真空下浓缩滤液，得到154.3g(98.4％)1-叠氮基-3，3-二甲基-2-丁酮。HPLC 83.85％在2.57min(Phenomenex 5m C18柱4.6×50mm，含有0.2％磷酸的10-90％含水甲醇，用4分钟，4mL/min，在220nm处检测)。B.1-氨基-3，3-二甲基-2-丁酮盐酸盐 将1-叠氮基-3，3-二甲基-2-丁酮(400g，1.254mol，1当量)与12NHCl水溶液(439mL，5.26mol，4.2当量)在2L乙醇中混合。将该反应混合物在75℃下搅拌1小时，然后冷却至室温。将得到的淤浆过滤。将滤液在真空下浓缩并加入异丙醇。将该溶液再过滤。加入1.2L乙醚使所需物质从溶液中沉淀。将该物质滤出，用乙醚(2×300mL)洗涤并在真空中、50℃下干燥过夜，得到1-氨基-3，3-二甲基-2-丁酮盐酸盐184.1g(97％)。C.N-氯代乙酰基-1-氨基-3，3-二甲基-2-丁酮 在N2、-5℃下，将1-氨基-3，3-二甲基-2-丁酮盐酸盐(130.96g，0.8637mol，1当量)溶于3.025L CH2Cl2中。加入三乙胺(301mL，2.16mol，2.5当量)，随后加入溶于175mL CH2Cl2中的氯代乙酰氯(75.7mL，0.450mol，1.1当量)。将得到的淤浆在-5℃到-10℃下搅拌2小时。加入水(1.575L)，随后加入175mL浓HCl。将有机相再一次用1.75L的10％HCl水溶液洗涤，然后用500mL水洗涤。将有机相经Na2SO4干燥并在真空下浓缩，得到N-氯代乙酰基-1-氨基-3，3-二甲基-2-丁酮155.26g(93.8％)，HPLC R.T.＝2.27min(Phenomenex 5m C18柱4.6×50mm，含有0.2％磷酸的10-90％含水甲醇，用4分钟，4mL/min，在220nm处检测)。D.5-叔-丁基-2-氯代甲基噁唑 在N2下，将N-氯代乙酰基-1-氨基-3，3-二甲基-2-丁酮(180.13g，0.9398mol，1当量)与磷酰氯(262mL，2.8109mol，3当量)混合。将该反应混合物在105℃下加热1小时。将该混合物冷却至室温，然后用1.3kg冰猝灭。将含水相用乙酸乙酯(1L，然后2×500mL)萃取。将有机萃取液用饱和NaHCO3水溶液(4×1L)洗涤(用乙酸乙酯反萃取洗液数次)。合并有机相，用饱和NaHCO3水溶液(500mL)洗涤，随后用饱和NaCl水溶液(300mL)洗涤，经MgSO4干燥并在真空下浓缩，得到棕色油状物。将该粗制产物在高真空、100℃下蒸馏，得到5-叔-丁基-2-氯代甲基噁唑155.92g(96％)。HPLC R.T.＝3.62min(Phenomenex 5mC18柱4.6×50mm，含有0.2％磷酸的10-90％含水甲醇，用4分钟，4mL/min，在220nm处检测)。
另外一种使用Burgess’试剂的替代方法作为一种替代方法，可以通过使合适的氯代酰胺与2当量Burgess’盐(氢氧化(甲氧基-羰基氨磺酰基)三乙铵内盐)在四氢呋喃中反应，制备5-叔-丁基-2-氯代甲基噁唑。E.S-[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫脲 在N2下，将5-叔-丁基-2-氯代甲基噁唑(1.77g，10.2mmol，1.02当量)与硫脲(0.76g，9.98mmol，1当量)在10mL无水乙醇中混合。将该反应混合物在回流下加热1.5小时。将该混合物冷却至室温并在真空下浓缩。将得到的粗制产物用叔-丁基甲基醚研磨，得到S-[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫脲2.32g(93％)。HPLC R.T.＝2.05min(Phenomenex 5m C18柱4.6×50mm，含有0.2％磷酸的10-90％含水甲醇，用4分钟，4mL/min，在220nm处检测)。1H NMR(d-DMSO)δ9.48(s，3H)，6.85(s，1H)，4.73(s，2H)，1.24(s，9H)。F.2-氨基-5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]噻唑 将S-[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫脲(1.25g，5mmol，1当量)加入到NaOH(3.0g，75mmol，15当量)、水(10mL)、甲苯(10mL)和硫酸四丁基铵(50mg，0.086mmol，0.017当量)的混合物中。加入5-溴代-2-氨基噻唑氢溴酸盐(1.70g，5mmol，1当量)并将该反应混合物在室温下搅拌14.5小时，用水稀释并用乙酸乙酯萃取两次。将有机萃取液用水(4×10mL)洗涤，经MgSO4干燥并在真空下浓缩，得到2-氨基-5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]噻唑1.1g(82％)。HPLC86.3％在2.75min(Phenomenex 5m C18柱4.6×50mm，含有0.2％磷酸的10-90％含水甲醇，用4分钟，4mL/min，在220nm处检测)。1HNMR(CDCl3)δ6.97(s，1H)，6.59(s，1H)，5.40(br s，2H)，3.89(s，2H)，1.27(s，9H)。G.4-(溴代甲基)-N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]苯乙酰胺 在0℃下，将1，3-二环己基碳二亚胺(7.18g，34.8mmol，1.25当量)加入到2-氨基-5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]噻唑(7.5g，27.8mmol，1当量)和4-溴代甲基苯乙酸(7.97g，34.8mmol，1.25当量)的175mL CH2Cl2混合物中。将该反应混合物加温至室温。30分钟后，LC/MS显示该反应完成。将该混合物过滤并在真空下浓缩到20g硅胶上。将该物质在硅胶上经快速层析纯化，用60％乙酸乙酯的己烷溶液洗脱，得到4-(溴代甲基)-N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]苯乙酰胺11.5g(83％)，为黄色固体。
在另外一种制备方法中，在N2、室温下，将1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(13.8g，72mmol，2当量)加入到2-氨基-5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]噻唑(2.0g，7.42mmol，1当量)和4-溴代甲基苯乙酸(2.60g，11.3mmol，1.5当量)的CH2Cl2(30mL)混合物中。1小时后，将该反应混合物用20mL乙酸乙酯稀释并用饱和NaHCO3水溶液(2×20mL)洗涤。然后将有机相用10％柠檬酸水溶液洗涤，经MgSO4干燥并在真空下浓缩，得到黄色固体。将该物质用乙醚研磨得到4-(溴代甲基)-N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]苯乙酰胺3.01g(84.4％)。HPLCR.T.＝3.69min(YMCS5 ODS柱4.6×50mm，含有0.2％磷酸的10-90％含水甲醇，用4分钟，4mL/min，在220nm处检测)。1H NMR(CDCl3)δ7.37-7.24(m，5H)，6.54(s，1H)，4.47(s，2H)，3.93(s，2H)，3.79(s，2H)，1.27(s，9H)。H.4-(氨基甲基)-N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]苯乙酰胺 将4-(溴代甲基)-N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]苯乙酰胺(纯度70％，1.05g，1.53mmol，1当量)溶于40mL N，N-二甲基甲酰胺中并冷却至-70℃。加入过量的液态氨(6mL)，将反应容器密封后，将该混合物温热至室温。1小时后，将该反应物用乙酸乙酯稀释，用水(20mL)和饱和NaCl水溶液洗涤，经MgSO4干燥并在真空下浓缩。将得到的黄色油状物经制备性HPLC纯化，得到4-(氨基甲基)-N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]苯乙酰胺270mg(42.4％)。MS417[M+H]+；HPLC R.T.＝3.17min(YMC S5 ODS柱4.6×50mm，含有0.2％磷酸的10-90％含水甲醇，用4分钟，4mL/min，在220nm处检测)。
实施例2N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-[[(3-羟基-2，2-二甲基丙基)氨基]甲基]苯乙酰胺的制备 A.4-甲酰基苯乙酸 将4-溴代苯乙酸(10.075g，50mmol，1当量)溶于250mL无水四氢呋喃中并冷却至-60℃。加入苯基锂(1.8M溶于70％环己烷的乙醚溶液中，65mL，117mmol，2.34当量)并将该反应混合物在-75℃下搅拌50分钟。然后加入叔-丁基锂(1.7M，90mL，153mmol，3.06当量)并将该反应混合物在-75℃下搅拌40分钟，然后温热至-45℃。35分钟后，将反应混合物冷却至-65℃并加入10mL无水N，N-二甲基甲酰胺。30分钟后，加入乙酸乙酯(150mL)并加入1N HCl水溶液使该溶液的pH为10。分离含水相，用6N HCl水溶液酸化并用乙酸乙酯萃取两次。合并有机物，用水洗涤，经MgSO4干燥并在真空下浓缩。将得到的粗制物用乙醚和己烷研磨，得到1.9g米黄色物质。将滤液在硅胶上经快速层析，用3∶1∶1的己烷∶乙酸乙酯∶乙醇的1％乙酸溶液洗脱得到附加量的1.2g所述物质。经制备性HPLC后从不纯的部分中也得到附加量的产物(270mg)，共得到3.37g(41％)的4-甲酰基苯乙酸。B.N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-甲酰基苯乙酰胺 在0℃下，将草酰氯(2.0M溶于CH2Cl2中，9.1mL，18.2mmol，3当量)缓慢加入到4-甲酰基苯乙酸(2.0g，12.2mmol，2当量)的CH2Cl2溶液中。将该反应混合物在0℃下搅拌5分钟。将得到的含有酰氯的反应混合物滴加2-氨基-5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]噻唑(1.64g，6.09mmol)和三乙胺(3.2mL)的二氯甲烷溶液处理，用30分钟温热至室温。将该反应混合物用饱和NaHCO3水溶液和CH2Cl2(220mL)稀释。分离有机相，顺序用饱和NaHCO3水溶液、0.1N HCl和饱和NaCl洗涤，经MgSO4干燥。在真空下浓缩得到棕色油状物，将该油状物用己烷/乙酸乙酯溶液研磨，得到1.03g黄色固体。将滤液在硅胶上经快速层析，用50-60％梯度的乙酸乙酯的己烷溶液洗脱得到附加量的1.02g所述物质。总共得到2.05g(81％)的N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-甲酰基苯乙酰胺。HPLC97％在3.90min(YMC S5 ODS柱4.6×50mm，含有0.2％磷酸的10-90％含水甲醇，用4分钟，4mL/min，在220nm处检测)。C.N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-[[(3-羟基-2，2-二甲基丙基)氨基]甲基]苯乙酰胺 将N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-甲酰基苯乙酰胺(1.1g，2.65mmol，1当量)溶于20mL四氢呋喃中并冷却至0℃。加入3-氨基-2，2-二甲基-1-丙醇(1.0g，9.7mmol，3.7当量)，随后加入乙酸(1mL)和三乙酰氧基硼氢化钠(2.6g，12.3mmol，4.6当量)。将该反应混合物在室温下搅拌1小时。加入NaHCO3水溶液并将该混合物用乙酸乙酯萃取。合并有机物，用水洗涤，经MgSO4干燥并在真空下浓缩。将残余物溶于甲醇中并用4N HCl的二噁烷溶液酸化，在硅胶上经快速层析，用含有2.7％三乙胺的10％甲醇的乙酸乙酯溶液洗脱，得到N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-[[(3-羟基-2，2-二甲基丙基)氨基]甲基]苯乙酰胺530mg(40％)，为米黄色固体。MS503[M+H]+；HPLC97％在3.28min(YMC S5 ODS柱4.6×50mm，含有0.2％磷酸的10-90％含水甲醇，用4分钟，4mL/min，在220nm处检测)。
实施例3N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-(1-吡咯烷基甲基)苯乙酰胺盐酸盐的制备 在0℃下，将4-(溴代甲基)-N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]苯乙酰胺(2.0g，4.2mmol，1当量)溶于25mL N，N-二甲基甲酰胺中并加入到吡咯烷(5.21mL，62.4mmol，15当量)的50mLN，N-二甲基甲酰胺溶液中。将该反应混合物在0℃下搅拌15分钟，然后在室温下搅拌过夜。将该混合物用500mL乙酸乙酯稀释。将有机相顺序用饱和NaCl水溶液和饱和NaHCO3水溶液洗涤，经MgSO4干燥并在真空下浓缩。将粗制物经制备性HPLC(C18 50×500mm柱，50-100％甲醇水溶液，用30分钟)纯化，随后冻干(2×1N HCl水溶液，1×水)，得到N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-(1-吡咯烷基甲基)苯乙酰胺盐酸盐195mg(10％)，为黄色固体。MS471[M+H]+；HPLC97％在3.17min(YMC S5 ODS柱4.6×50mm，含有0.2％磷酸的10-90％含水甲醇，用4分钟，4mL/min，在220nm处检测)。
实施例4N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-[[(2-羟基乙基)氨基]甲基]苯乙酰胺盐酸盐的制备 在0℃下，将4-(溴代甲基)-N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]苯乙酰胺(10.47g，21.8mmol，1当量)溶于100mLN，N-二甲基甲酰胺中并加入到乙醇胺(19.73mL，0.327mol，15当量)的200mL N，N-二甲基甲酰胺溶液中。将该反应混合物在0℃下搅拌1小时并用700mL乙酸乙酯稀释。将有机萃取液顺序用水和饱和NaHCO3水溶液(4×300mL)洗涤，经MgSO4干燥并在真空下浓缩。将粗制物经制备性HPLC(C18 50×500mm柱，50-100％甲醇水溶液，用30分钟)纯化，随后冻干(2×1N HCl水溶液，1×水)，得到N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-[[(2-羟基乙基)氨基]甲基]苯乙酰胺盐酸盐4.8g(47.8％)，为黄色固体。MS461[M+H]+；HPLC97％在3.15min(YMC S5 ODS柱4.6×50mm，含有0.2％磷酸的10-90％含水甲醇，用4分钟，4mL/min，在220nm处检测)。
实施例5N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-[[[2-(1-吡咯烷基)乙基]氨基]甲基]苯乙酰胺的制备 在氩气氛下，将N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-(甲酰基)苯乙酰胺(0.70g，1.68mmol，1当量)溶于28mL四氢呋喃中。加入1-(2-氨基乙基)吡咯烷(1.0mL，7.89mmol，4.7当量)，随后加入乙酸(1mL)和三乙酰氧基硼氢化钠(2.07g，9.28mmol，5.5当量)。将该反应混合物在室温下搅拌30分钟。加入NaHCO3水溶液并将该混合物用乙酸乙酯萃取。将有机萃取液经MgSO4干燥并在真空下浓缩。将所述物质在硅胶上经快速层析纯化，用含有0.6％氢氧化铵的15-30％梯度甲醇的乙酸乙酯溶液洗脱，得到N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-[[[2-(1-吡咯烷基)乙基]氨基]甲基]苯乙酰胺602mg(70％)。通过加入2.34mL 1N HCl水溶液并随后冻干，可以得到二盐酸盐为浅色易碎固体。MS514[M+H]+；HPLC100％在2.93min(YMC S5 ODS柱4.6×50mm，含有0.2％磷酸的10-90％含水甲醇，用4分钟，4mL/min，在220nm处检测)。
实施例6N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-[[(2-羟基-1，1-二甲基乙基)氨基]甲基]苯乙酰胺盐酸盐的制备 在0℃下，向1，1-二甲基乙醇胺(1.08g)的N，N-二甲基甲酰胺(1.25mL)溶液中加入4-(溴代甲基)-N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]苯乙酰胺(600mg)的N，N-二甲基甲酰胺(3mL)溶液。将该反应混合物在室温下搅拌30分钟并用甲醇水梯度的制备性HPLC纯化。合并所需部分，在真空下浓缩并冻干得到产物，为游离碱。将所述游离碱用盐酸的二噁烷溶液(4N，0.48mL)处理并在真空下浓缩得到N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-[[(2-羟基-1，1-二甲基乙基)氨基]甲基]苯乙酰胺的盐酸盐(460mg)。HPLC R.T.＝2.66min(YMC S5 ODS柱4.6×50mm，含有0.2％磷酸的10-90％含水甲醇，用4分钟，4mL/min，在220nm处检测)。MS489[M+H]+。
实施例7N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-3-[[(2-羟基乙基)氨基]甲基]苯乙酰胺盐酸盐的制备 A.N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-3-甲酰基苯乙酰胺 在0℃下，用20分钟将草酰氯(2.0M溶于CH2Cl2中，21.0mL，42.0mmol，3.13当量)加入到含有数滴N，N-二甲基甲酰胺的3-(甲酰基)苯乙酸(75％，3.5g，16.0mmol，1.2当量)的CH2Cl2溶液中。将该反应混合物在0℃下搅拌20分钟，然后温热至室温。10分钟后，将该反应混合物在真空、室温下浓缩1.5小时。将酰氯中间体溶于60mL CH2Cl2中并在0℃下，用40分钟将得到的溶液加入到2-氨基-5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]噻唑和三乙胺(5.90mL，42.3mmol，3.15当量)的120mL CH2Cl2溶液中。将该反应混合物在0℃下搅拌30分钟。加入饱和NaHCO3水溶液并将该混合物用CH2Cl2萃取。将有机萃取液顺序用0.05N HCl水溶液和饱和NaCl水溶液洗涤并经MgSO4干燥。将有机相在真空下浓缩得到棕色油状物，将该油状物用乙醚研磨得到N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-3-甲酰基苯乙酰胺5.04g(90.6％)。HPLC87％在3.930min(YMC S5 ODS柱4.6×50mm，含有0.2％磷酸的10-90％含水甲醇，用4分钟，4mL/min，在220nm处检测)。B.N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-3-[[(2-羟基乙基)氨基]甲基]苯乙酰胺盐酸盐 在N2下，将乙醇胺(0.73mL，12.1mmol，5当量)加入到N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-3-(甲酰基)苯乙酰胺(1.0g，2.4mmol，1当量)的60mL无水四氢呋喃溶液中。将该反应混合物搅拌15分钟。加入乙酸(1mL)和三乙酰氧基硼氢化钠(2.97g，14.0mmol，5.8当量)并将反应混合物搅拌40分钟。加入NaHCO3水溶液并将该混合物用乙酸乙酯(3×80mL)萃取。将有机萃取液经MgSO4干燥并在真空下浓缩。将该物质在硅胶上经快速层析纯化，用含有0.2-0.4％氢氧化铵的10-20％梯度甲醇的乙酸乙酯溶液洗脱。用1.5mL 1N HCl水溶液酸化，随后冻干得到N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-3-[[(2-羟基乙基)氨基]甲基]苯乙酰胺盐酸盐686mg(57.5％)，为米黄色泡沫状固体。MS461[M+H]+；HPLCR.T.＝2.670min(YMC S5 ODS柱4.6×50mm，含有0.2％磷酸的10-90％含水甲醇，用4分钟，4mL/min，在220nm处检测)。
实施例8N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-3-[[(3-羟基-2，2-二甲基丙基)氨基]甲基]苯乙酰胺的制备 在N2下，将3-氨基-2，2-二甲基-1-丙醇(0.37g，3.59mmol，5当量)加入到N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-3-(甲酰基)苯乙酰胺(300mg，0.72mmol，1当量)的20mL无水四氢呋喃溶液中。加入乙酸(0.5mL)和三乙酰氧基硼氢化钠(0.80g，3.58mmol，5当量)并将反应混合物搅拌1.5小时。加入NaHCO3水溶液并将该混合物用乙酸乙酯萃取。将有机萃取液经MgSO4干燥并在真空下浓缩。将该粗制物在硅胶上经快速层析纯化，用含有0.5％氢氧化铵的10-20％梯度甲醇的乙酸乙酯溶液洗脱，得到N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-3-[[(3-羟基-2，2-二甲基丙基)氨基]甲基]苯乙酰胺0.206g(57％)。用1NHCl水溶液酸化，随后冻干得到上述物的盐酸盐，为灰白色易碎固体。MS583[M+H]+；HPLCR.T.＝3.38min(YMC S5 ODS柱4.6×50mm，含有0.2％磷酸的10-90％含水甲醇，用4分钟，4mL/min，在220nm处检测)。
实施例93-(氨基甲基)-N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]苯乙酰胺的制备 在N2下，向N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-3-(甲酰基)苯乙酰胺(1.51g，3.63mmol)的乙腈(20mL)溶液中加入叔-丁基物质(1.26g，10.7mmol)，随后加入三氟乙酸(0.54mL)和三乙基硅烷(1.71mL，10.7mmol)。将反应混合物在室温下搅拌20小时并用乙醚稀释。将得到的有机溶液顺序用饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤，经硫酸钠干燥并蒸发至干，得到2.55g粗制产物。将该粗制产物溶于二氯甲烷(35mL)中，冷却至0℃并加入三氟乙酸(15mL)。将该反应混合物在室温下搅拌16小时，在真空下浓缩并经制备性HPLC纯化，得到3-(氨基甲基)-N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]苯乙酰胺(472mg)。MS417[M+H]+；HPLC R.T.＝3.24min(YMC S5 ODS柱4.6×50mm，含有0.2％磷酸的10-90％含水甲醇，用4分钟，4mL/min，在220nm处检测)。
实施例104-[[(2，3-二羟基丙基)氨基]甲基]-N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]苯乙酰胺盐酸盐的制备 在室温下，将4-(溴代甲基)-N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]苯乙酰胺(2.0g，4.16mmol，1当量)加入到3-氨基-1，2-丙二醇(5.0mL，64.5mmol，15.5当量)的20mL N，N-二甲基甲酰胺和40mL无水四氢呋喃混合物中。将该反应混合物搅拌5小时并在真空下浓缩。将混合物用160mL乙酸乙酯稀释并用10％LiCl水溶液洗涤两次，用饱和NaCl水溶液洗涤一次。将有机相经MgSO4干燥并在硅胶上经快速层析纯化，用含有0.8％氢氧化铵的15％甲醇的乙酸乙酯溶液洗脱，得到4-[[(2，3-二羟基丙基)氨基]甲基]-N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]苯乙酰胺1.08g(49.3％)。用1N HCl水溶液酸化，随后冻干得到上述物的盐酸盐为米黄色固体。MS491[M+H]+；HPLCR.T.＝2.53min(YMC S5 ODS柱4.6×50mm，含有0.2％磷酸的10-90％含水甲醇，用4分钟，4mL/min，在220nm处检测)。
实施例11N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-[[[2-羟基-1-(羟基甲基)乙基]氨基]甲基]苯乙酰胺盐酸盐的制备 将4-(溴代甲基)-N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]苯乙酰胺(1.0g，2.08mmol，1当量)溶于20mL N，N-二甲基甲酰胺中并在0℃下，加入到2-氨基-1，3-丙二醇(2.84g，31.2mmol，15当量)的50mL N，N-二甲基甲酰胺溶液中。将该反应混合物在室温下搅拌18小时。将混合物用500mL乙酸乙酯稀释并用饱和NaCl水溶液(2×250mL)和饱和NaHCO3水溶液(3×300mL)洗涤。将有机相经MgSO4干燥并在真空下浓缩。用1N HCl水溶液酸化，随后冻干得到N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-[[[2-羟基-1-(羟基甲基)乙基]氨基]甲基]苯乙酰胺盐酸盐790mg(77.4％)，为黄色固体。MS491[M+H]+；HPLCR.T.＝2.53min(YMC S5 ODS柱4.6×50mm，含有0.2％磷酸的10-90％含水甲醇，用4分钟，4mL/min，在220nm处检测)。
实施例12N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-[[(2-羟基-1-甲基乙基)氨基]甲基]苯乙酰胺盐酸盐的制备 将2-氨基-1-丙醇(1.88g，24.97mmol，15当量)冷却至0℃并用5分钟加入4-(溴代甲基)-N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]苯乙酰胺(0.80g，1.66mmol，1当量)在3.75mL N，N-二甲基甲酰胺中的溶液。将该反应混合物在室温下搅拌1小时。将该混合物直接用制备性HPLC(Sep Tek柱50×500mm，10-100％含水甲醇，用60分钟，45mL/min，在220nm处检测)纯化。将合适的部分冻干得到N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-[[(2-羟基-1-甲基乙基)氨基]甲基]苯乙酰胺658mg(83.7％)。用4N HCl的二噁烷溶液酸化得到所述物的盐酸盐，为灰白色固体。MS475[M+H]+；HPLC100％在2.60min(YMC S5 ODS柱4.6×50mm，含有0.2％磷酸的10-90％含水甲醇，用4分钟，4mL/min，在220nm处检测)。
实施例13N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-[1-[(2-羟基乙基)氨基]乙基]苯乙酰胺盐酸盐的制备 A.4-(2-(乙氧基羰基)乙烯基)苯乙酸 在氩气氛、0℃下，将4-溴代苯乙酸(86.02g，0.748mol，1当量)溶于含有乙酸乙酸(64mL，0.591mol，0.79当量)、丙烯酸叔-丁基酯(20mL，0.136mol，0.18当量)、乙酸钯(II)(1.81g，8.06mmol，0.01当量)和三苯膦(4.40g，16.7mmol，0.022当量)的无水N，N-二甲基甲酰胺中。用40分钟加入N，N-二异丙基乙胺(178mL)并将该反应混合物在100℃下加热17小时。将混合物冷却至室温并用1.5L 1N HCl水溶液稀释。将含水相用乙酸乙酯(3×1L)萃取。将有机萃取液顺序用1N HCl水溶液(2×1L)、水(1L)和饱和NaCl水溶液(0.5L)洗涤，经Na2SO4干燥并在真空下浓缩，得到定量收率(107.4g)的4-(2-(乙氧基羰基)乙烯基)苯乙酸，为带有叔-丁基酯的顺式和反式烯烃的混合物。B.4-甲酰基苯乙酸 在氩气氛下，将部分A的粗制物质(107.4g)溶于1L二噁烷和1L水的混合物中。加入四氧化锇水溶液(10％，2.0g)，随后加入高碘酸钠(209g，0.98mol)和4-甲基吗啉N-氧化物(2.30g，19.6mmol)。48小时后，将该反应混合物用氩气冲洗30分钟，然后在室温下再搅拌47小时。将该混合物过滤除去固体，用1L乙酸乙酯漂洗。将含水相用1L乙酸乙酯萃取。将合并的有机萃取液用1L水洗涤，随后用0.5L 1NNaOH水溶液洗涤。将含水相用60mL浓HCl酸化并用1L乙酸乙酯萃取。将该有机萃取液用0.5L水、0.5L饱和NaCl水溶液洗涤，用MgSO4干燥并在真空下浓缩，得到36g 4-甲酰基苯乙酸，为黄色固体。C.N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-甲酰基苯乙酰胺 将4-甲酰基苯乙酸(1.72g，10.5mmol，1.1当量)与2-氨基-5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]噻唑(2.56g，9.53mmol，1当量)、CH2Cl2(20mL)和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(2.61g，13.6mmol，1.3当量)混合。将该反应混合物在室温下搅拌1小时，用40mL CH2Cl2稀释并顺序用1N HCl水溶液(2×20mL)、饱和NaHCO3水溶液(20mL)和饱和NaCl水溶液(2×50mL)洗涤，经MgSO4干燥并在真空下浓缩，得到N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-甲酰基苯乙酰胺3.41g(86％)。D.N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-[(1-羟基)乙基]苯乙酰胺 在氩气氛、-78℃下，将N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2噻唑基]-4-甲酰基苯乙酰胺(3.315g，7.98mmol，1当量)溶于100mL无水四氢呋喃中。用5分钟加入溴化甲基镁(3M溶于乙醚中，5.60mL，16.8mmol，2.1当量)并将该反应混合物在-78℃下搅拌1.75小时。将反应混合物用饱和NH4Cl水溶液猝灭并用100ml饱和NaHCO3水溶液稀释。将该混合物用250mL乙酸乙酯萃取。将含水相用1N HCl水溶液酸化至pH5，然后用乙酸乙酯(2×300mL)萃取。将合并的有机萃取液用饱和NaCl水溶液(100mL)洗涤，经MgSO4干燥并在真空下浓缩，得到N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-[(1-羟基)乙基]苯乙酰胺2.87g(83％)。E.N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-[(1-氯代)乙基]苯乙酰胺 在氩气氛、0℃下，将N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2噻唑基]-4-[(1-羟基)乙基]苯乙酰胺(0.550g，1.27mmol，1当量)溶于5.5mL无水四氢呋喃中。用6分钟加入亚硫酰氯(0.102mL，1.40mmol，1.1当量)并将该反应混合物在0℃下搅拌25分钟。将混合物用300mL乙酸乙酯稀释并用饱和NaHCO3水溶液(2×30mL)和饱和NaCl(30mL)洗涤。将有机相用MgSO4干燥并在真空下浓缩，得到N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-[(1-氯代)乙基]苯乙酰胺533mg(93％)。F.N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-[1-[(2-羟基乙基)氨基]乙基]苯乙酰胺盐酸盐 将N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2噻唑基]-4-[(1-氯代)乙基]苯乙酰胺(480mg，1.07mmol，1当量)溶于2.5mL N，N-二甲基甲酰胺中并在0℃下，用7分钟加入到2-氨基乙醇(979mg，16.0mmol，15当量)中。将该反应混合物在室温下搅拌20分钟。将混合物直接经制备性HPLC(Sep Tek柱50×500mm，15-100％含水甲醇，用50分钟，45mL/min，在220处检测)纯化。将所需部分在真空下浓缩并用1N HCl水溶液酸化。冻干得到N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-[1-[(2-羟基乙基)氨基]乙基]苯乙酰胺盐酸盐220mg(38％)，为灰白色固体。MS475[M+H]+；HPLC98％在2.66min(YMC S5 ODS柱4.6×50mm，含有0.2％磷酸的10-90％含水甲醇，用4分钟，4mL/min，在220nm处检测)。
实施例14N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-[1-[(2-羟基-1-甲基乙基)氨基]乙基]苯乙酰胺盐酸盐的制备 将N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-[(1-氯代)乙基]苯乙酰胺(0.60g，1.33mmol，1当量)溶于3.75mL N，N-二甲基甲酰胺中并在0℃下，缓慢加入到2-氨基-1-丙醇(1.50g，20.0mmol，15当量)中。将该反应混合物在室温下搅拌20分钟，过滤并将得到的固体经制备性HPLC(Sep Tek柱50×500mm，20-100％含水甲醇，用50分钟，49mL/min，在220处检测)纯化。将所需部分在真空下浓缩并用1N HCl水溶液酸化。冻干得到N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-[1-[(2-羟基-1-甲基乙基)氨基]乙基]苯乙酰胺盐酸盐550mg(79％)，为白色固体。MS489[M+H]+；HPLC98％在2.70min(YMC S5 ODS柱4.6×50mm，含有0.2％磷酸的10-90％含水甲醇，用4分钟，4mL/min，在220nm处检测)。
实施例15(S)-N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-[[(2-羟基乙基)氨基]甲基]-α-甲基苯乙酰胺的制备 A.(S)-2-[4-氯代甲基]苯基丙酸 在氩气氛下，将(S)-2-苯基丙酸(1.380g，9.19mmol，1当量)与7.0mL 37％HCl水溶液、KCl(3.426g，45.95mmol，5当量)、氯化四甲基铵(252mg，2.30mmol，0.25当量)和低聚甲醛(827mg，27.6mmol，3当量)混合。将该反应混合物在100℃下加热22小时，冷却并用乙酸乙酯(2×75mL)萃取。将有机萃取液经Na2SO4干燥并在真空下浓缩。将该物质经制备性HPLC纯化，得到(S)-2-[4-氯代甲基]苯基丙酸(94％对位)540mg(基于回收原料629mg的54％)，为澄清的油状物。e.e＝89％。B.(S)-4-(氯代甲基)-N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-α-甲基苯乙酰胺 在室温、氩气氛下，将1，3-二环己基碳二亚胺(617mg，2.99mmol，1.1当量)加入到2-氨基-5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]噻唑(732mg，2.72mmol，1当量)和(S)-2-[4-氯代甲基]苯基丙酸(540mg，2.72mmol，1当量)的10mL CH2Cl2混合物中。1.5小时后，将该混合物通过硅藻土过滤，在真空下浓缩并在硅胶上经快速层析纯化，用60％乙酸乙酯的己烷溶液洗脱，得到(S)-4-(氯代甲基)-N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-α-甲基苯乙酰胺872mg(71％)，为泡沫状白色固体。C.(S)-N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-[[(2-羟基乙基)氨基]甲基]-α-甲基苯乙酰胺 在氩气氛下，将(S)-4-(氯代甲基)-N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-α-甲基苯乙酰胺(872mg，1.94mmol，1当量)溶于10mL N，N-二甲基甲酰胺中。加入2-氨基乙醇(1.77g，29mmol，15当量)并将该反应混合物在室温下搅拌2小时。将混合物在真空下浓缩并经制备性HPLC纯化。将所需部分在真空下浓缩，得到(S)-N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-[[(2-羟基乙基)氨基]甲基]-α-甲基苯乙酰胺610mg(53％)。用1N HCl水溶液酸化并冻干得到所述物质的盐酸盐，为浅黄色固体。MS475[M+H]+；HPLCR.T.＝3.23min(YMC S5 ODS柱4.6×50mm，含有0.2％磷酸的10-90％含水甲醇，用4分钟，4mL/min，在220nm处检测)。
实施例16N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-6-[[(2-羟基乙基)氨基]甲基]-3-吡啶乙酰胺的制备 A.6-甲基-3-吡啶乙酸乙酯，N-氧化物 将6-甲基-吡啶乙酸乙酯(1.20g，6.70mmol，1当量)与3-氯代过苯甲酸(50％，2.77g，8.03mmol，1.2当量)的25mL CHCl3溶液混合。将该反应混合物在室温下搅拌4小时。将混合物通过2英寸的Al2O3垫过滤两次并用100mL 10％甲醇的CH2Cl2溶液洗脱。在真空下浓缩得到6-甲基-3-吡啶乙酸乙酯，N-氧化物1.29g(99％)。B.6-羟基甲基-3-吡啶乙酸乙酯 将6-甲基-3-吡啶乙酸乙酯，N-氧化物(920mg，4.71mmol，1当量)溶于70mL CH2Cl2中并与2，6-二甲基吡啶(5.1mL，37.7mmol，8当量)和三氟乙酸酐(4.8mL，33mmol，7当量)混合。将该反应混合物在70℃下加热20分钟，冷却至室温，在真空下浓缩。加入无水乙醇(70mL)，随后加入浓氢氧化铵(8.4mL)。将该混合物在45℃下加热20分钟，冷却至室温，在真空下浓缩并用120mL饱和NaHCO3水溶液稀释。将含水相用乙酸乙酯(3×150mL)萃取。将有机萃取液用饱和NaCl水溶液(100mL)洗涤，经MgSO4干燥并在真空下浓缩。在硅胶上经快速层析纯化，用1-2％梯度甲醇的CH2Cl2溶液洗脱，得到6-羟基甲基-3-吡啶乙酸乙酯611mg(66％)。C.6-[[叔-丁基二苯基甲硅烷基]氧基]甲基-3-吡啶乙酸乙酯 将6-羟基甲基-3-吡啶乙酸乙酯(500mg，2.56mmol，1当量)溶于20mL CH2Cl2中并与三乙胺(0.54mL，3.84mmol，1.5当量)和叔-丁基氯代二苯基硅烷(0.73mL，2.82mmol，1.1当量)混合。将该反应混合物在室温搅拌4.5小时。加入附加量的含有N，N-二甲基氨基吡啶(31mg，0.26mmol，0.1当量)的0.25mL叔-丁基氯代二苯基硅烷。2小时后，将该反应混合物用250mL乙酸乙酯稀释。将有机相用饱和NaHCO3水溶液(2×40mL)和饱和NaCl水溶液(100mL)顺序洗涤，经MgSO4干燥并在真空下浓缩。在硅胶上经快速层析纯化，用10-25％梯度乙酸乙酯的己烷溶液洗脱，得到6-[[叔-丁基二苯基甲硅烷基]氧基]甲基-3-吡啶乙酸乙酯795mg(72％)。D.6-[[叔-丁基二苯基甲硅烷基]氧基]甲基-3-吡啶乙酸 将6-[[叔-丁基二苯基甲硅烷基]氧基]甲基-3-吡啶乙酸乙酯(786mg，1.81mmol，1当量)溶于8mL甲醇中并与1N NaOH水溶液(3mL，3mmol，1.65当量)混合。将该反应混合物在室温下搅拌1小时，用50mL5％柠檬酸水溶液稀释，用乙酸乙酯(3×70mL)萃取。将有机相顺序用水(40mL)和饱和NaCl水溶液(100mL)洗涤，经MgSO4干燥并在真空下浓缩得到6-[[叔-丁基二苯基甲硅烷基]氧基]甲基-3-吡啶乙酸691.7mg(94％)。E.N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-6-[[叔-丁基二苯基甲硅烷基]氧基]甲基-3-吡啶乙酰胺 将6-[[叔-丁基二苯基甲硅烷基]氧基]甲基-3-吡啶乙酸(681mg，1.68mmol，1当量)与2-氨基-5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]噻唑(453mg，1.68mmol，1当量)、CH2Cl2(5mL)、2，6-二甲基吡啶(0.5mL)和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(354.4mg，1.84mmol，1.1当量)混合。将该反应混合物在室温下搅拌1.5小时，用250mL乙酸乙酯稀释，顺序用5％柠檬酸水溶液(2×60mL)、饱和NaHCO3水溶液(50mL)和饱和NaCl水溶液(50mL)洗涤。将有机相经MgSO4干燥，在真空下浓缩并在硅胶上经快速层析纯化，用1-9％梯度甲醇的CH2Cl2溶液洗脱，得到N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-6-[[叔-丁基二苯基甲硅烷基]氧基]甲基-3-吡啶乙酰胺(774mg，70％)。F.N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-6-羟基甲基-3-吡啶乙酰胺 将实施例16部分E的产物(760mg，1.16mmol，1当量)溶于15mL无水四氢呋喃中并与氟化四丁基铵(1.0M溶于四氢呋喃中，3mL，3.0mmol，2.6当量)混合。将该反应混合物在室温下搅拌1小时，用100mL5％柠檬酸水溶液稀释，用乙酸乙酯(3×120mL)萃取。将有机萃取液顺序用饱和NaHCO3水溶液(60mL)和饱和NaCl水溶液(60mL)洗涤，经MgSO4干燥并在真空下浓缩。在硅胶上经快速层析纯化，用6％甲醇的CH2Cl2溶液洗脱，得到N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-6-羟基甲基-3-吡啶乙酰胺(411mg，85％)，为无色固体。HPLC100％在2.50min(YMC S5 ODS柱4.6×50mm，含有0.2％磷酸的10-90％含水甲醇，用4分钟，4mL/min，在220nm处检测)。G.N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-6-氯代甲基-3-吡啶乙酰胺 在室温下，向N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-6-羟基甲基-3-吡啶乙酰胺(410mg)的氯仿(10mL)溶液中加入亚硫酰氯(79μL，1.8mmol)。将该反应混合物搅拌30分钟，用饱和碳酸氢钠溶液稀释并用乙酸乙酯(3×120mL)萃取。将合并的有机萃取液用饱和氯化钠溶液(2×30mL)洗涤，经硫酸镁干燥，过滤并在真空下浓缩，得到粗制产物(480mg)，将其经层析纯化得到N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-6-氯代甲基-3-吡啶乙酰胺(328mg，77％)。H.N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-6-[[(2-羟基乙基)氨基]甲基]-3-吡啶乙酰胺 向氨基乙醇(681mg)中加入N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-6-氯代甲基-3-吡啶乙酰胺(325mg，0.74mmol)的N，N-二甲基甲酰胺(1mL)溶液。将该反应混合物在室温下搅拌1小时，用甲醇稀释并过滤得到粗制产物。经制备性HPLC纯化后得到N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-6-[[(2-羟基乙基)氨基]甲基]-3-吡啶乙酰胺(248mg，72％)。
实施例17(R)-4-[[(2，3-二羟基丙基)氨基]甲基]-N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]苯乙酰胺盐酸盐的制备 在N2下，将(R)-3-氨基-1，2-丙二醇(5.0g，54.9mmol，10.5当量)溶于50mL N，N-二甲基甲酰胺中。分小份加入4-(溴代甲基)-N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]苯乙酰胺(2.50g，5.20mmol，1当量)并将该反应混合物在室温下搅拌2小时。将该混合物用乙酸乙酯(250mL)稀释并用水和10％LiCl水溶液洗涤。将含水相用乙酸乙酯反萃取两次。将有机萃取液经MgSO4干燥并在真空下浓缩。在硅胶上经快速层析纯化，用10-20％梯度含有0.5％氢氧化铵的甲醇的乙酸乙酯溶液洗脱，得到(R)-4-[[(2，3-二羟基丙基)氨基]甲基]-N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]苯乙酰胺1.80g(65.6％)。用1N HCl水溶液酸化得到其盐酸盐，为白色易碎固体。MS491[M+H]+；HPLC98％在2.54min(YMC S5 ODS柱4.6×50mm，含有0.2％磷酸的10-90％含水甲醇，用4分钟，4mL/min，在220nm处检测)。[α]D23＝+0.074°(c1.0，甲醇)。
实施例18(S)-4-[[(2，3-二羟基丙基)氨基]甲基]-N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]苯乙酰胺盐酸盐的制备 在N2下，将(S)-3-氨基-1，2-丙二醇(6.3g，68.9mmol，13.2当量)溶于40mL N，N-二甲基甲酰胺中。分小份加入4-(溴代甲基)-N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]苯乙酰胺(2.50g，5.20mmol，1当量)并将该反应混合物在室温下搅拌1小时。将该混合物用乙酸乙酯(300mL)稀释并用冰水和10％ LiCl水溶液洗涤。将有机萃取液经MgSO4干燥并在真空下浓缩。在硅胶上经快速层析纯化，用10-20％梯度含有0.6％氢氧化铵的甲醇的乙酸乙酯溶液洗脱，得到(S)-4-[[(2，3-二羟基丙基)氨基]甲基]-N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]苯乙酰胺1.765g(69％)。用1N HCl水溶液酸化得到其盐酸盐，为白色易碎固体。HPLC98％在2.54min(YMC S5ODS柱4.6×50mm，含有0.2％磷酸的10-90％含水甲醇，用4分钟，4mL/min，在220nm处检测)；[α]D23＝-8.4°(c1.0，甲醇)。
权利要求
1.式I的化合物及其对映异构体、非对映异构体和药学上可接受的盐 其中R是烷基；R1和R2各独立是氢或烷基；R3是氢或烷基，和R4是氢或由一个或两个羟基或一个NR5R6基团取代的烷基，或R3和R4与它们所连接的氮原子一起形成4-到7-元杂环，其中R3R4由-(CH2)n-代表，其中n是3、4、5或6的整数；R5和R6各独立是氢、烷基、取代的烷基、环烷基或取代的环烷基，或R5和R6与它们所连接的氮原子一起形成4-到7-元杂环，其中R5R6由-(CH2)m-代表，其中m是3、4、5或6的整数；和X是CH或N。
2.权利要求1的化合物，其中R是叔-丁基；R1和R2各独立是氢或甲基；R3是氢和R4是氢、-CH2C(CH3)2CH2OH、-CH2CH2OH、-C(CH3)2CH2OH、-CH(CH2OH)2、-CH2CH(OH)CH2OH、-CH(CH3)CH2OH或 或R3和R4与它们所连接的氮原子一起形成5-元杂环，其中R3R4由-(CH2)4-代表；和X是CH或N。
3.权利要求1的式Ia的化合物及其对映异构体、非对映异构体和药学上可接受的盐 其中R1和R2各独立是氢或甲基；和R3是氢，和R4是氢、-CH2C(CH3)2CH2OH、-CH2CH2OH、-C(CH3)2CH2OH、-CH(CH2OH)2、-CH2CH(OH)CH2OH、-CH(CH3)CH2OH或 或R3和R4与它们所连接的氮原子一起形成5-元杂环，其中R3R4由-(CH2)4-代表。
4.权利要求3的式Ia的化合物，其中R1和R2各独立是氢或甲基；和R3是氢，和R4是-CH2C(CH3)2CH2OH、-CH2CH2OH、-C(CH3)2CH2OH、-CH(CH2OH)2、-CH2CH(OH)CH2OH、-CH(CH3)CH2OH或 或R3和R4与它们所连接的氮原子一起形成5-元杂环，其中R3R4由-(CH2)4-代表。
5.权利要求1的式Ib的化合物及其对映异构体、非对映异构体和药学上可接受的盐 其中R1和R2各独立是氢或甲基；和R3是氢，和R4是氢、-CH2C(CH3)2CH2OH、-CH2CH2OH、-C(CH3)2CH2OH、-CH(CH2OH)2、-CH2CH(OH)CH2OH、-CH(CH3)CH2OH或 或R3和R4与它们所连接的氮原子一起形成5-元杂环，其中R3R4由-(CH2)4-代表。
6.权利要求5的式Ib的化合物，其中R1和R2各独立是氢或甲基；和R3是氢，和R4是-CH2C(CH3)2CH2OH、-CH2CH2OH、-C(CH3)2CH2OH、-CH(CH2OH)2、-CH2CH(OH)CH2OH、-CH(CH3)CH2OH或 或R3和R4与它们所连接的氮原子一起形成5-元杂环，其中R3R4由-(CH2)4-代表。
7.权利要求1的式Ic的化合物及其对映异构体、非对映异构体和药学上可接受的盐 其中R1和R2各独立是氢或甲基；和R3是氢，和R4是氢、-CH2C(CH3)2CH2OH、-CH2CH2OH、-C(CH3)2CH2OH、-CH(CH2OH)2、-CH2CH(OH)CH2OH、-CH(CH3)CH2OH或 或R3和R4与它们所连接的氮原子一起形成5-元杂环，其中R3R4由-(CH2)4-代表。
8.权利要求7的式Ic的化合物，其中R1和R2各独立是氢或甲基；和R3是氢，和R4是-CH2C(CH3)2CH2OH、-CH2CH2OH、-C(CH3)2CH2OH、-CH(CH2OH)2、-CH2CH(OH)CH2OH、-CH(CH3)CH2OH或 或R3和R4与它们所连接的氮原子一起形成5-元杂环，其中R3R4由-(CH2)4-代表。
9.权利要求1的化合物，它选自N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-[[[2-羟基-1-(羟基甲基)乙基]氨基]甲基]苯乙酰胺；4-[[(2，3-二羟基丙基)氨基]甲基]-N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]苯乙酰胺；(R)-4-[[(2，3-二羟基丙基)氨基]甲基]-N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]苯乙酰胺；(S)-4-[[(2，3-二羟基丙基)氨基]甲基]-N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]苯乙酰胺；4-(氨基甲基)-N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]苯乙酰胺；N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-[[(3-羟基-2，2-二甲基丙基)氨基]甲基]苯乙酰胺；N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-(1-吡咯烷基甲基)苯乙酰胺；N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-[[(2-羟基乙基)氨基]甲基]苯乙酰胺；N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-[[[2-(1-吡咯烷基)乙基]氨基]甲基]苯乙酰胺；N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-[[(2-羟基-1，1-二甲基乙基)氨基]甲基]苯乙酰胺；N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-3-[[(2-羟基乙基)氨基]甲基]苯乙酰胺；N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-3-[[(3-羟基-2，2-二甲基丙基)氨基]甲基]苯乙酰胺；3-(氨基甲基)-N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]苯乙酰胺；N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-[[(2-羟基-1-甲基乙基)氨基]甲基]苯乙酰胺；N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-[1-[(2-羟基乙基)氨基]乙基]苯乙酰胺；N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-[1-[(2-羟基-1-甲基乙基)氨基]乙基]苯乙酰胺；(αS)-N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-[[(2-羟基乙基)氨基]甲基]-α-甲基苯乙酰胺；N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-6-[[(2-羟基乙基)氨基]甲基]-3-吡啶乙酰胺；和N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-[[(2-羟基乙基)氨基]甲基]-α-甲基苯乙酰胺；及其药学上可接受的盐。
10.N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-[[[2-羟基-1-(羟基甲基)乙基]氨基]甲基]苯乙酰胺和其药学上可接受的盐。
11.N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-[[(2-羟基-1，1-二甲基乙基)氨基]甲基]苯乙酰胺和其药学上可接受的盐。
12. 4-[[(2，3-二羟基丙基)氨基]甲基]-N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]苯乙酰胺和其药学上可接受的盐。
13.(R)-4-[[(2，3-二羟基丙基)氨基]甲基]-N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]苯乙酰胺和其药学上可接受的盐。
14.(S)-4-[[(2，3-二羟基丙基)氨基]甲基]-N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]苯乙酰胺和其药学上可接受的盐。
15.一种药用组合物，它包含权利要求1的化合物和药学上可接受的载体。
16.一种药用组合物，它包含权利要求1的化合物及与其混合的药学上可接受的载体和以固定剂量配制的抗癌药。
17.一种药用组合物，它包含权利要求1的化合物及与其混合的药学上可接受的载体和以固定剂量配制的p53反式激活调节剂。
18.一种用于调节细胞凋亡的方法，该方法包括给予需要其的哺乳类动物有效调节细胞凋亡量的权利要求1的化合物。
19.一种用于抑制蛋白激酶的方法，该方法包括给予需要其的哺乳类动物有效抑制蛋白激酶量的权利要求1的化合物。
20.一种用于抑制依赖细胞周期蛋白的激酶的方法，该方法包括给予需要其的哺乳类动物有效抑制依赖细胞周期蛋白的激酶量的权利要求1的化合物。
21.一种用于抑制cdc2(cdk1)的方法，该方法包括给予需要其的哺乳类动物有效抑制cdc2量的权利要求1的化合物。
22.一种用于抑制cdk2的方法，该方法包括给予需要其的哺乳类动物有效抑制cdk2量的权利要求1的化合物。
23.一种用于抑制cdk3的方法，该方法包括给予需要其的哺乳类动物有效抑制cdk3量的权利要求1的化合物。
24.一种用于抑制cdk4的方法，该方法包括给予需要其的哺乳类动物有效抑制cdk4量的权利要求1的化合物。
25.一种用于抑制cdk5的方法，该方法包括给予需要其的哺乳类动物有效抑制cdk5量的权利要求1的化合物。
26.一种用于抑制cdk6的方法，该方法包括给予需要其的哺乳类动物有效抑制cdk6量的权利要求1的化合物。
27.一种用于抑制cdk7的方法，该方法包括给予需要其的哺乳类动物有效抑制cdk7量的权利要求1的化合物。
28.一种用于抑制cdk8的方法，该方法包括给予需要其的哺乳类动物有效抑制cdk8量的权利要求1的化合物。
29.一种治疗增生性疾病的方法，该方法包括给予需要其的哺乳类动物治疗有效量的权利要求15的组合物。
30.一种治疗癌症的方法，该方法包括给予需要其的哺乳类动物治疗有效量的权利要求15的组合物。
31.一种治疗炎症、炎性肠疾病或移植排斥的方法，该方法包括给予需要其的哺乳类动物治疗有效量的权利要求15的组合物。
32.一种治疗关节炎的方法，该方法包括给予需要其的哺乳类动物治疗有效量的权利要求15的组合物。
33.一种治疗增生性疾病的方法，该方法包括给予需要其的哺乳类动物治疗有效量的权利要求16的组合物。
34.一种治疗癌症的方法，该方法包括给予需要其的哺乳类动物治疗有效量的权利要求16的组合物。
35.一种治疗增生性疾病的方法，该方法包括给予需要其的哺乳类动物治疗有效量的权利要求17的组合物。
36.一种治疗癌症的方法，该方法包括给予需要其的哺乳类动物治疗有效量的权利要求17的组合物。
37.一种治疗与依赖细胞周期蛋白的激酶有关的疾病的方法，该方法包括给予需要其的受治疗者有效量的至少一种权利要求1的化合物。
38.一种治疗化疗引起的脱发、化疗引起的血小板减少症、化疗引起的白细胞减少症或mucocitis的方法，该方法包括给予需要其的哺乳类动物治疗有效量的权利要求1的化合物。
全文摘要
本发明介绍式(I)的化合物及其对映异构体、非对映异构体和药学上可接受的盐。所述式(I)的化合物是蛋白激酶抑制剂并用于治疗增生性疾病如癌症、炎症和关节炎。它们也用于治疗早老性痴呆、化疗引起的脱发和心血管疾病。
文档编号C07D521/00GK1433415SQ00818899
公开日2003年7月30日 申请日期2000年12月7日 优先权日1999年12月15日
发明者S·D·金巴尔, K·S·金 申请人:布里斯托尔-迈尔斯斯奎布公司