铁和α-酮戊二酸依赖性双加氧酶的酶活检测体系和方法
【技术领域】
[0001] 本申请属于生物技术检测领域，具体设及双加氧酶活性的通用检测方法，更具体 地，设及所有W α-酬戊二酸和铁离子作为辅助因子的双加氧酶（即铁和α-酬戊二酸依 赖性双加氧酶）活性的通用检测方法。
【背景技术】
[0002] 双加氧酶，是使氧分子中的两个氧原子全部与底物相结合的氧化酶的总 称。铁和α -酬戊二酸依赖性双加氧酶[α -0x0glutarate/F'e(II)-dependent dio巧genases( α -0孤s)]属于广泛分布于自然界中的非血红素铁蛋白，是一种参与多 种氧化还原反应的重要酶类，其反应底物种类多样，可W是蛋白质，例如脯氨酷径化酶 (P皿），低氧诱导因子化ypoxia induced factor)和胶原脯氨酷径化酶（collagen prolyl hy化oxylase)等；也可W是小分子化合物，例如核酸，如A化B、FTO,因而在动物、植物和微 生物的初生及次生代谢产物的合成方面起着重要作用。例如，该酶类参与植物激素乙締、赤 霉素和黄酬类化合物等的合成等。最近的研究表明，铁和α-酬戊二酸依赖性双加氧酶是 最全能且极其重要的氧化生物催化剂。
[0003] 铁和α -酬戊二酸依赖性双加氧酶在反应中存在一个共同的机制，即亚铁离子 和α -酬戊二酸作为辅助因子，在反应中氧分子的两个氧原子，一个进入底物，另一个参与 α-酬戊二酸脱簇基反应生成班巧酸。
[0004] 目前此类酶活性的检测一般利用同位素标记分析（radioactive assay)、质谱、核 磁共振（NMR)和大分子产物对应底物结构与物理特性的改变等等。运些检测方法繁琐，不 适用于大通量药物筛选。此外，现有的检测方法仅适用于一种特定的铁和α-酬戊二酸依 赖性双加氧酶，不具备通用性。
【发明内容】
[0005] 一方面，本申请提供了铁和α -酬戊二酸依赖性双加氧酶的酶活检测体系，其包 括：铁离子、α -酬戊二酸、辅酶Α，ΝΤΡ，班巧酷辅酶A合成酶。
[0006] 在上述酶活检测体系中，还包括用于起始酶促反应的铁和酬戊二酸依赖性双加氧 酶的作用底物，W及用于终止酶促反应的钢酸锭溶液和用于显色的孔雀绿溶液。
[0007] 在一实施方案中，所述酶活检测体系中的辅酶A，NTP和班巧酷辅酶A合成酶Ξ者 的浓度为过量，例如，班巧酷辅酶A合成酶的浓度为过量，而辅酶A和NTP的浓度相同，可为 班巧酷辅酶A合成酶的对应底物Km值的5-10倍W上。在优选实施方案中，所述酶活检测 体系中的钢酸锭溶液和孔雀绿溶液均为强酸性的。
[000引另一方面，本申请提供了检测铁和酬戊二酸依赖性双加氧酶的酶活的试剂盒或微 阵列，其包括铁离子、α-酬戊二酸、辅酶A、NTP、班巧酷辅酶A合成酶。在本申请提供的试 剂盒或微阵列中，还包括用于起始酶促反应的铁和α -酬戊二酸依赖性双加氧酶的作用底 物和用于终止酶促反应的钢酸锭溶液和用于显色的孔雀绿溶液。
[0009] 在一实施方案中，所述试剂盒或微阵列中的辅酶A, ΝΤΡ和班巧酷辅酶A合成酶Ξ 者的浓度为过量，例如，班巧酷辅酶A合成酶的浓度为过量，而辅酶A和ΝΤΡ的浓度相同，可 为班巧酷辅酶A合成酶的对应底物Km值的5-10倍W上。
[0010] 在优选实施方案中，所述酶活检测体系中的钢酸锭溶液和孔雀绿溶液均为强酸性 的。
[0011] 又一方面，本申请提供了铁和α -酬戊二酸依赖性双加氧酶的酶活检测方法。
[0012] 在一实施方案中，本发明提供的铁和α -酬戊二酸依赖性双加氧酶的酶活检测方 法包括W下步骤：a)在待测样品中，加入α-酬戊二酸依赖性双加氧酶作用底物、铁离子、 α -酬戊二酸来起始反应进行反应I ;b)在步骤a)中的反应I终止之后，再加入辅酶Α、ΝΤΡ、 MgClz和班巧酷辅酶A合成酶进行反应II ;c)加入钢酸锭溶液来终止步骤b)中的反应II， 最后加入孔雀绿溶液来显色，并在620-640nm处读取吸光度，由此确定铁和酬戊二酸依赖 性双加氧酶的酶活。
[0013] 在优选实施方案中，步骤a)中的反应I于100°C下加热来终止，加热时间为，例如 30分钟。
[0014] 在优选实施方案中，步骤b)中的反应II加入溶解于硫酸的钢酸锭溶液来终止。
[0015] 在另一实施方案中，本发明提供的铁和α -酬戊二酸依赖性双加氧酶的酶活检测 方法包括W下步骤：a)在待测样品中，加入α-酬戊二酸依赖性双加氧酶作用底物、铁离 子、α -酬戊二酸来起始反应进行反应I，同时加入辅酶Α、ΝΤΡ、MgClz和班巧酷辅酶A合成 酶进行反应II ;b)加入钢酸锭溶液来终止反应，再加入孔雀绿溶液来显色，并在620-640nm 处读取吸光度，由此确定铁和酬戊二酸依赖性双加氧酶的酶活。此外，本申请还提供了上述 的酶活检测体系，上述的试剂盒或微阵列，W及上述的方法在检测铁和α -酬戊二酸依赖 性双加氧酶的酶活中的应用。
[0016] 可见，本申请利用铁和α -酬戊二酸依赖性双加氧酶运一类酶催化不同反应后都 产生班巧酸的特性，通过检测反应产生的班巧酸的量的方法，来检测铁和α -酬戊二酸依 赖双加氧酶的活性。与现有技术中检测铁和α-酬戊二酸双加氧酶检测底物的消耗和首要 产物的产生，W及由此产生需要依赖层析、质谱或同位素标记等耗时耗力的方法不同，本申 请所提供的铁和α-酬戊二酸依赖性双加氧酶的酶活检测体系和方法仅通过检测副产物 班巧酸的产生来检测酶活，测量依赖简单仪器读取可见光光吸收，因而省时省力。
【附图说明】
[0017] 图1为本申请提供的铁和α -酬戊二酸依赖性双加氧酶的酶活检测方法的示例性 原理图。 阳01引图2为本申请实施例1中编码班巧酷辅酶A合成酶β，α链的sucC和sucD基因 的基因图谱。
[0019] 图3为本申请实施例1中班巧酷辅酶A合成酶的PCR扩增产物电泳结果图。
[0020] 图4为本申请实施例1中班巧酷辅酶A合成酶的质粒转化电泳验证结果图。
[0021] 图5为本申请实施例1中班巧酷辅酶A合成酶的蛋白纯化电泳结果图。
[0022] 图6为本申请实施例1中班巧酷辅酶A合成酶的活性验证，其中1为没有班巧酸 (黄色）；2为50 μΜ班巧酸（没有酶，黄色）；3为500 μΜ班巧酸（没有酶，黄色）；4为 5 μ Μ班巧酷辅酶A合成酶和50 μ Μ班巧酸（浅绿色）；5为0. 5 μ Μ班巧酷辅酶A合成酶和 500 μ Μ班巧酸（绿色）。
[0023] 图7为本申请实施例1中制作的憐酸浓度标准曲线。
[0024] 图8为本申请实施例1中不同抑条件下，根据不同班巧酸浓度（10-100 μ Μ)建立 的班巧酸辅酶A合成酶反应标准曲线，反应时间为45min。
【具体实施方式】
[0025] 提供W下定义和方法用W更好地界定本申请W及在本申请实践中指导本领域普 通技术人员。除非另作说明，术语按照相关领域普通技术人员的常规用法理解。
[00%] 在本文中所使用的"NTP"，是核巧Ξ憐酸（nucleoside tri地OS地ate)的缩写，指 一种含有Ξ个憐酸基团的核巧酸，包括腺巧Ξ憐酸（ATP)、鸟巧Ξ憐酸（GTP)、胞巧Ξ憐酸 (CTP)、胸腺巧Ξ憐酸灯TP) W及尿巧Ξ憐酸扣T巧等，其经水解可生成相应的核巧二憐酸 NDP并释放出无机憐酸Pi。在具体实施方案中所使用的核巧Ξ憐酸种类，取决于所使用的 班巧酸辅酶A合成酶的来源和种类。
[0027] 在本文中所使用的"强酸性"，是指一种物质在溶剂中能向其它物质提供质子的能 力，25°C下，当抑《7时，溶液呈强酸性。在具体实施方案中使用硫酸作为溶剂来获得强酸 性溶液，例如，通过将25mM钢酸锭溶解于3. 4M硫酸来制备钢酸锭溶液，通过将ImM孔雀绿 溶解于6mM硫酸来制备孔雀绿溶液。
[002引在本文中所使用的"酶活"，定义为单位时间内（Imin)单位质量的酶（mg)转化生 成产物的量。就铁和α-酬戊二酸依赖性双加氧酶的酶活而言，指单位时间内（Imin)单位 质量的双加氧酶（mg)转化生成班巧酸的量（nmole或pmole)，即nmoles班巧酸· min iflig 待测双加氧酶1。
[0029] 在一实施方案中，本申请所提供的酶活检测方法包括W下步骤：