专利名称：一种用α-酮戊二酸交联固定纤维素酶的方法
技术领域：
本发明属酶化学工程技术领域，特别是涉及一种用a-酮戊二酸交联固定纤维素酶的 方法。
技术背景a-酮戊二酸是生物化学中被经常使用的一种试剂，它不仅对生物体无毒，且也同时是 非常有用的生物化学试剂。a-酮戊二酸是生物体内柠檬酸循环的重要中间体，也是异柠檬 酸脱氢酶、a-酮戊二酸脱氢酶复合体等多种酶的作用底物。最近研究发现a-酮戊二酸还具 有杀死癌细胞等多种功效，是一种重要的、常用的且具有极大市场潜力的生物试剂。纤维素酶的固定化研究，研究至今已有近十年的时间，但是在交联剂的选择上一直都 没有很大的突破，大多数都采用的是化学试剂，而化学试剂容易使酶中毒，而使酶失活的 缺点。 发明内容本发明所要解决的技术问题是提供一种使用新的交联剂固定纤维素酶的方法，该方法 的特点是无毒、具有生物相容性、反应条件温和、反应简单、载酶量高、比活高和催化效 率高，易从反应体系中分离、可回收反复使用、能提高酶的利用率和降低生产成本。本发明解决其技术问题所采用的技术方案是提供一种用a-酮戊二酸交联固定纤维素 酶的方法，包括下列步骤(1) 利用质量分数为16%，以25%醋酸溶解的壳聚糖溶液，包裹磁性粉末制备磁性 纳米微粒；(2) 用a-酮戊二酸与包裹上壳聚糖的磁性纳米微粒反应，进行交联，制得含有交联 臂的磁性纳米微粒；(3) 用配制好的浓度为l-15mg/ml的纤维素酶溶液，与磁性纳米微粒反应，固定纤 维素酶；(4) 通过改变固定化的条件，优化固定化的条件，选择最大限度地固定纤维素酶的 固定化的条件。所述的磁性纳米微粒是指具有生物活性的磁性纳米微粒，其直径分布均匀，直径均在 20-40nm左右。所述的a-酮戊二酸与包裹上壳聚糖的磁性纳米微粒反应是，150-300mga-酮戊二酸，5-15ml磁性纳米微粒，PH值6.5 7.0之间，100-150r/min， 20-50。C反应12-36小时。所述的步骤(3)的反应是，l-15mg/ml纤维素酶溶液，5-15ml具有交联臂的磁性纳米微粒，100-150r/min， 20-50。C反应2-8小时。所述的步骤(4)优化固定条件是指，改变温度、纤维素酶的浓度、纤维素酶的用量、PH值，确定最佳固定条件。有益效果1) 本发明所得到的纳米磁性微粒固定化酶，具有载酶量高、比活高和催化效率高的特 点。2) 本发明所得到的纳米磁性微粒固定化酶，易从反应体系中分离、可回收反复使用， 这样就可以达到提高酶的利用率和降低生产成本等优点。3) 本发明的操作简单、反应温和。不会因反应过度剧烈而使酶失活。4) 本发明所使用的交联剂一a-酮戊二酸，无毒，具有生物活性和生物相容性。不会让 酶中毒而失活，且对酶具有亲和性。是一种很好的交联剂。
图1为具有生物相容性的纳米磁性微粒的透视电镜照片。 图2为未包裹上壳聚糖的磁性粉末的FT-IR图谱。 图3为包裹上壳聚糖的纳米磁性微粒的FT-IR图谱。 图4为酶浓度对酶固定化的影响。 图5为PH值对酶固定化的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术 人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限 定的范围。以壳聚糖包裹的纳米磁性微粒的制备，具体步骤如下1) 在50'C下，用醋酸溶液(25wt。/。)溶解壳聚糖，制得壳聚糖溶液(16wt.%)。2) 10mlFe3O4中加入lml的Span-80，再将上述的壳聚糖溶液倾到入其中，在700r/min下 搅拌15min。然后超声振荡30min，再在700r/min下搅拌30 min。3) 在磁场存在的条件下，用蒸馏水洗3次，完成沉降过程。以(X-酮戊二酸为交联剂的生物相容性磁性纳米粒子的制备，具体步骤如下1) 用PH=5.6的醋酸缓冲溶液溶胀包裹了壳聚糖的纳米磁性微粒.2) 在上述溶液中加入0.25ga-酮戊二酸，用6moI/lNaOH调PH值至4.5 5.0，然后缓慢 加入NaBH4 0.15g，用HC1 (15wt.%)调PH值至6.5 7.0，反应24h。3) 分别用乙醇(100wt.%)和无水乙醚，洗三次。 以纤维素酶固定纳米磁性微粒的制备，具体步骤如下1) 用醋酸缓冲溶液溶解纤维素酶，以2: l的体积比，将纤维素酶溶液和纳米磁性微粒反 应，在37'C， 120r/min下，反应4小时。2) 甩醋酸缓冲液清洗上述产物，直至洗脱液中再也没有游离酶的存在。用紫外分光光度 计在280nm的波长下，监测游离酶的存在与否。3) 用醋酸缓冲液保存所制得的固定化酶。以羟甲基纤维素钠盐为底物的紫外分光光度法酶活的表征，具体步骤如下游离酶活的测定将纤维素酶溶解在0.2mol/L醋酸缓冲液(PH=5.6)中，制成浓度为 lmg/ml的酶溶液。取上述的酶溶液lml，加入4ml羟甲基纤维素钠盐(CMC-Na)，在50°C 下反应5min。然后立即加入lml 2mol/L氢氧化钠溶液和2ml DNS溶液。摇匀后将上述的 混和溶液放入沸水浴中，5min后立即取出，流水冷却，用蒸馏水定容至20ml。与520nm 波长下比色。固定酶活的测定在一定量的固定化酶磁性粒子中，加入4ml羟甲基纤维素钠盐 (CMC-Na)，按上述方法测定固定化酶的活力。以纳米磁性微粒为载体的纤维素酶固定化的条件优化，具体步骤如下1) 酶溶液的浓度确定。取7组各5ml磁性微粒，分别加入浓度为lmg/ml、3mg/ml、6mg/ml、 7mg/ml、 9mg/ml、 10mg/ml、 11 mg/ml (PH=5.6)的纤维素酶溶液进行固定，并测定 酶的活力。最适的给酶浓度为10mg/ml。2) 反应Ph值的确定。取6组各5ml磁性微粒，加入酶溶液的Ph值分别为4.4、 4.8、 5.0、 5.4、 5.8、 6.0，进行固定，并测定酶的活力。当反应体系的Ph值为4.8时，酶活最高。
权利要求
1.一种用α-酮戊二酸交联固定纤维素酶的方法，包括下列步骤(1)利用质量分数为16％，以25％醋酸溶解的壳聚糖溶液，包裹磁性粉末制备磁性纳米微粒；(2)用α-酮戊二酸与包裹上壳聚糖的磁性纳米微粒反应，进行交联，制得含有交联臂的磁性纳米微粒；(3)用配制好的浓度为1-15mg/ml的纤维素酶溶液，与磁性纳米微粒反应，固定纤维素酶；(4)通过改变固定化的条件，优化固定化的条件，选择最大限度地固定纤维素酶的固定化的条件。
2. 根据权利要求1所述的一种用a-酮戊二酸交联固定纤维素酶的方法，其特征在于所 述的磁性纳米微粒是指具有生物活性的磁性纳米微粒，其直径分布均匀，直径均在 20-40nm左右。
3. 根据权利要求1所述的一种用a-酮戊二酸交联固定纤维素酶的方法，其特征在于所 述的a-酮戊二酸与包裹上壳聚糖的磁性纳米微粒反应是，150-300mga-酮戊二酸, 5-15ml磁性纳米微粒，PH值6.5 7.0之间，100-150r/min， 20-50。C反应12-36小时。
4. 根据权利要求1所述的一种用a-酮戊二酸交联固定纤维素酶的方法，其特征在于所 述的步骤(3)的反应是，l-15mg/ml纤维素酶溶液，5-15ml具有交联臂的磁性纳米微 粒，100-150r/min， 20-50。C反应2-8小时。
5. 根据权利要求1所述的一种用a-酮戊二酸交联固定纤维素酶的方法，其特征在于所 述的步骤(4)优化固定条件是指，改变温度、纤维素酶的浓度、纤维素酶的用量、PH 值，确定最佳固定条件。
全文摘要
本发明涉及一种用α-酮戊二酸交联固定纤维素酶的方法，该方法包括(1)磁性纳米微粒的制备。(2)α-酮戊二酸与磁性纳米微粒反应。(3)交联固定纤维素酶。(4)优化纤维素酶的固定条件。本发明利用纳米磁性粒子高比表面积，以及壳聚糖所具有的反应性氨基和生物相容性，可以得到具有载酶量高、比活高和催化效率高的纳米磁性微粒固定化酶。该固定化酶具有易从反应体系中分离、可回收反复使用，以及其制备过程简单，反应过程温和，提高酶的利用率和降低生产成本等优点。特别是交联剂α-酮戊二酸无毒，不会使酶失活，也不会因反应过度剧烈降低酶的活性。
文档编号C12N11/02GK101275130SQ20081003498
公开日2008年10月1日 申请日期2008年3月21日 优先权日2008年3月21日
发明者何智妍, 周毓婷, 朱利民, 聂华丽, 勇 薛 申请人:东华大学