用于筛选药物的报告基因细胞模型及其构建方法

专利名称：：用于筛选药物的报告基因细胞模型及其构建方法
技术领域：
：本发明属于生物
技术领域：
，更具体的，本发明涉及一种独特的基因构建物，含有所述构建物的载体，含有所述载体的细胞，所述细胞可作为模型用于蛋白激酶c信号通路调节药物的筛选。
背景技术：
：随着现代生物技术的快速发展，基于细胞的药物筛选模型被广泛应用于新药开发，特别是在对大量化合物的高通量筛选中。蛋白激酶C(PKC)是一类Ca2+、磷脂依赖性的蛋白激酶，在跨膜信号传递过程中起重要作用，介导多种膜受体，如G蛋白偶联受体，酪氨酸激酶受体等的跨膜信号转导。受体激活后导致下游信号分子的活化，如G蛋白、PLC等，这些信号分子再进一步活化PKC，进而引起基因的转录。TPA反应元件(TRE)是与PKC信号偶联的反应元件，当PKC激活后会导致转录因子AP-1与TRE的结合，从而激活TRE下游的基因转录[参见NetDasEvcimen，GeorgeL.King,TheroleofproteinkinaseCactivationandthevascularcomplicationsofdiabetes,PharmacologicalResearch55(2007)498-510]。PKC与多种疾病相关，如肿瘤侵袭、糖尿病综合症、脉管类疾病等，目前正作为一个热门的药物靶点进行新药开发。已上市的PKC抑制剂有礼来公司的ruboxistaurin[参见BirchKA,HeathWF，HermelingRN,JohnstonCM,Stra,L，DellC，SmithC，WilliamsonJR,Reifel-MillerA，LY290181,aninhibitorofdiabetes-inducedvasculardysfunction,blocksproteinkinaseC_stimulatedtranscriptionalactivationthroughinhibitionoftranscriptionfactorbindingtoaphorbolresponseelement,Diabetes.1996May;45(5):642-50]，用于治疗糖尿病视网膜综合症，另外还有多个PKC抑制剂正在进行临床研究，包括治疗糖尿病微血管并发症的PKC-P抑制剂，治疗乳腺癌的PKC-a反义药物Affinitak，治疗多形性成胶质细胞瘤的4enzastaurin等[参见EricChurchill,GrantBudas，AliceVallentin,TomoyoshiKoyanagi，andDariaMochly-Rosen，PKCIsozymesinChronicCardiacDisease:PossibleTherapeuticTargets1Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.2008.48:20.1-20.31]。PKC信号通路还与多种细胞膜受体的功能相关，可以通过检测PKC的激活间接监测受体的活性，从而用于受体的药物筛选。G蛋白偶联受体是人体内最主要的一类与疾病相关的细胞膜受体超家族，其内源配体囊括了激素，神经递质，细胞因子，钙离子，以及感官刺激等[参见NeubigRR，SiderovskiDP,RegulatorsofG-proteinsignallingasnewcentralnervoussystemdrugtargets,NatRevDrugDiscov.2002Mar;1(3):187-97]。市场上有近2/3的药物都通过作用于GPCR起效，在药物开发中具有巨大价值。综上，本领域还有必要进一步开发调节PKC信号通路的物质，建立筛选PKC信号通路调节物质的模型或方法。
发明内容本发明的目的在于提供一种可用于筛选调节蛋白激酶C(PKC)信号通路的物质的细胞模型及其用途。本发明的目的还在于提供基于所述细胞模型来筛选调节PKC信号通路的物质的方法。在本发明的第一方面，提供一种构建物，所述构建物从5'端到3'端依次含有式I所示的结构A—B—C(式I)其中，A具有SEQIDNO:5中第2-82位所示的序列(较佳的，A由SEQIDNO:5中第2-82位所示的序列构成)；B为巨细胞病毒(CMV)启动子序列；C为报告基因序列。在另一优选例中，所述的构建物从5'端到3'端依次含有式II所示的结构A—B—C—D(式II)其中，D为Zeocin抗性基因序列;在另一优选例中，所述的报告基因选自绿色荧光蛋白(GFP)基因，禾口/或荧光素酶(luciferase)基因。在另一优选例中，所述的绿色荧光蛋白是增强的绿色荧光蛋白(EGFP)。在另一优选例中，所述的报告基因是绿色荧光蛋白基因和荧光素酶基因的融合基因。在另一优选例中，绿色荧光蛋白基因位于荧光素酶基因的下游。在另一优选例中，A、B、C或D各元件之间为可操作地相连接。在另一优选例中，A、B、C或D各元件之间具有0-1000bp的间隔序列。优选的，A、B元件之间具有0-20bp(更佳的0-10bp，如3bp)的间隔序列；B、C元件之间具有0-1000bp(如735bp)的间隔序列；C、D元件之间具有0-600bp(如371bp)的间隔序列。在本发明的第二方面，提供一种载体，所述的载体中含有所述的构建物。在本发明的第三方面，提供一种细胞，所述细胞具有蛋白激酶C信号通路；并且，所述细胞含有所述的载体；或其基因组中整合有所述的构建物。在另一优选例中，所述的细胞是真核细胞。在另一优选例中，所述的细胞选自(但不限于)CH0细胞，HEK-293细胞或Hela细胞。在另一优选例中，所述的细胞含有Gi/o偶联的G蛋白偶联受体(GPCR，如CCR5)或酪氨酸激酶受体(也是PKC通路成员)。在本发明的第四方面，提供所述的细胞的用途，用于筛选调节(如激活或抑制)蛋白激酶C(PKC)信号通路的物质(如小分子、化合物或多肽)。在另一优选例中，所述的细胞用于蛋白激酶C激活剂(如激动剂)或抑制剂(如拮抗剂)的筛选，或用于G蛋白偶联受体的激活剂或抑制剂的筛选。在本发明的第四方面，提供一种筛选调节蛋白激酶C信号通路的潜在物质的方法，所述方法包括(1)将候选物质给予所述的细胞；和(2)检测所述细胞中报告基因的表达情况；其中，若所述候选物质可提高报告基因的表达，则表明该候选物质是激活蛋白激酶C信号通路的潜在物质；若所述候选物质可降低报告基因的表达，则表明该候选物质是抑制蛋白激酶C信号通路的潜在物质。在另一优选例中，步骤(l)包括在测试组中，将候选物质加入到所述的细胞(或细胞培养物)中；和/或步骤(2)包括检测测试组的体系中报告基因的表达，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的所述的细胞；如果测试组中报告基因的表达在统计学上高于(优选显著高于，如高50°/。以上，较佳的高100%以上；更佳的高200。/。以上)对照组，就表明该候选物是激活蛋白激酶C信号通路的潜在物质；如果测试组报告基因的表达在统计学上低于(优选显著低于，如低50%以上，较佳的低100%以上；更佳的低200%以上)对照组，就表明该候选物是抑制激活蛋白激酶C信号通路的潜在物质。在另一优选例中，所述方法还包括步骤对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以进一步选择和确定对于调节蛋白激酶C信号通路有用的物质。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。图l显示了重组报告基因载体的示意图。图2显示了PKC激动剂在转染了报告基因载体的HEK-293细胞中可激活荧光素酶的表达。其中，A，转染了报告基因质粒但未加入PKC激动剂刺激的细胞；B，转染了报告基因质粒同时还加入100nMPKC激动剂刺激的细胞；C，裂解细胞后检测得到的荧光素酶活性与gal(beta-gal)活性的比值比较(n二2，平均值士标准偏差)。图3显示了PKC激动剂在转染了报告基因载体的Hela细胞中可激活荧光素酶的表达。其中，A，转染了报告基因质粒但未加入PKC激动剂刺激的细胞；B，转染了报告基因质粒同时还加入100nMPKC激动剂刺激的细胞，C，裂解细胞后检测得到的荧光素酶活性与P-gal活性的比值比较(n二2，平均值士标准偏差)。图4显示了PKC激动剂以及CCR5激动剂在CH0/CCR5/luc细胞系中均可激活报告基因的表达。其中，A，未加入激动剂剌激的CH0/CCR5/luc细胞；B，加入100nMPKC激动剂PMA刺激的CH0/CCR5/luc细胞；C，加入10nMCCR5激动剂RANTES刺激的CH0/CCR5/luc细胞；D，裂解细胞后检测得到的荧光素酶活性比较(『2，平均值士标准偏差)。图5显示了CCR5激动剂RANTES对CH0/CCR5/luc细胞系中报告基因的激活作用呈浓度依赖性。其中，A，CH0/CCR5/lucG4克隆；B，CH0/CCR5/lucE8克隆；C，CH0/CCR5/lucA10克隆;D，CH0/CCR5/lucHll克隆；E，CH0/CCR5/lucD2克隆；包括5个RANTES的浓度梯度0.1nM，1nM，3.16nM，10nM，和IOOnM。(n=2，平均值士标准偏差)。图6显示了PKC抑制剂在转染了报告基因载体的Hela细胞中可抑制PMA引起的报告基因的表达。其中，PKC抑制剂为Ro-318220(Ro)，所用浓度为luM。图7显示了CCR5拮抗剂在CH0/CCR5/luc细胞系中可抑制报告基因表达的激活。四个CCR5拮抗剂作为筛选样品，其CCR5活性在其他实验中己知。DMSO作为阴性对照。(n=2，平均值士标准偏差)。8具体实施方式本发明人经过深入研究和设计，在质粒载体中组合兼容包括12-0-十四酰-佛波醇-13-乙酸酯(TPA)反应元件(TRE)、巨细胞病毒(CMV)启动子、报告基因和抗性基因的元件，这些元件可良好的配合，在转染入哺乳动物细胞后，可在细胞内高灵敏度地报告蛋白激酶C信号通路的情况。如本文所用，所述的"可操作地连接"是指两个或多个核酸区域或核酸序列的功能性的空间排列。例如启动子区被置于相对于报告基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的转录受到该启动子区域的引导，从而，启动子区域被"可操作地连接"到该核酸序列上。构建物及载体本发明提供了一种构建物，所述构建物从5'端到3'端依次含有TRE重复序列，CMV启动子序列，和报告基因序列。所述的TRE是作为与PKC信号偶联的反应元件，当PKC被激活或被抑制后，可导致转录因子AP-1与TRE发生反应，从而启动TRE下游基因的表达。本发明的构建物中，TRE的下游基因为报告基因，因此可通过检测报告基因的表达方便地得知PKC的激活或抑制情况。本发明采用TRE重复序列，比采用单一TRE具有更好的反应灵敏性。单个的TRE由9个碱基组成ATGAGTCAG。优选的，所述的TRE重复序列含有9个TRE序列(9XTRE);更优选的，所述的9个TRE序列之间不含有其它间隔性的碱基序列(即具有SEQIDNO:5中第2-82位所示的序列)。本发明人发现，相对于有间隔序列的情况，采用9个连续串联的TRE序列(其中无间隔碱基序列)制备构建物，在转入细胞并制备成细胞筛选模型后，当受到PKC调节剂刺激时，细胞模型的敏感性更理想。所述的"启动子"是指一种核酸序列，其通常存在于目的基因编码序列的上游(5'端)，能够引导核酸序列转录为mRNA。本发明釆用CMV启动子，所述的CMV启动子适用于作为真核表达启动子。作为本发明的优选方式，所述的报告基因启动子为去除增强子的CMVmin启动子，这是由于CMV本身具有很强的启动子活性，其自带的增强子可一定程度提高信号本底，并且去除增强子的CMV更有利于TRE增强子与报告基因的直接偶联，所述启动子例如可从pcDNA3质粒上页通过PCR或酶切的方式获得。在CMV启动子的下游为报告基因，所述的报告基因与CMV启动子可操作的相连接，所述的报告基因可以是不影响所述TRE重复序列的反应状态、可在CMV启动子的启动下表达、且可指示(或被检测到)表达情况的基因。作为本发明的优选方式，所述的报告基因选自绿色荧光蛋白(GFP)基因，禾B/或荧光素酶(luciferase，Luc)基因。GFP作为一种标记蛋白，其内源荧光基团在受到紫外光或蓝光激发时可高效发射清晰可见的绿光。所述的GFP还包括在野生型GFP基础上进行改进的蛋白，比如进行基因优化(如去除隐蔽性内含子等)；或通过氨基酸替换提高GFP脱辅基蛋白在高温(如37'C)条件下的正确折叠，以及改变GFP光谱特性等。因此，作为本发明的优选方式，所述的GFP是增效的绿色荧光蛋白(EGFP)，EGFP为对绿色荧光蛋白进行改进后的蛋白，与GFP具有很高的同源性，在表达后发光的效果更为理想。本领域人员很容易获得GFP或EGFP的序列，例如，可从pEGFP-Nl质粒上通过PCR或酶切的方式获得。荧光素酶作为报告基因有如下特点l)本底低荧光素酶本身在哺乳动物细胞中无表达，与特定的反应元件偶联后可用于特定药物的筛选；2)反应敏感荧光素酶介导的化学发光反应效率高，发光强，易于检测；3)反应迅速荧光素酶介导的发光反应速度快，每个样品仅需几秒种的检测时间；4)底物清洁荧光素底物反应敏感且不含同位素，有益于生态环境的保护。作为本发明的优选方式，所述的报告基因是GFP和Luc的融合基因。釆用GFP作为报告基因，可在不裂解细胞的情况下、通过较为直观的方法观察到细胞内GFP的表达的情况(呈现绿色)；釆用Luc作为报告基因，需要将细胞裂解，加入荧光素酶底物，测得的结果准确性高。因此将两者进行融合来作为报告基因，将更有利于药物筛选过程中对结果的判断。作为本发明的特别优选的方式，所述的构建物中，在报告基因的下游，还包含有Zeocin抗性基因序列。本领域人员可理解，不同抗性基因对于其上下游的一些元件的功能、或对于目的基因的表达可产生不同的影响，因而需要在构建时选择合适的抗性基因。而采用Zeocin作为抗性基因来制备构建物，Zeocin的表达对于TRE的反应影响较小，且可良好地用于稳定转染细胞株的筛选和单克隆。在所述的构建物中，A、B、C或D各元件之间以可操作的方式进行连接，各种功能性元件的操作性连接方式是本领域人员所熟知的。通常，A、B、C或D各元件之间具有0-1OOObp的间隔序列。本发明还提供了一种载体，所述的载体含有前面所述的构建物。所述的表达载体是适合于哺乳动物细胞的克隆和表达的载体。作为本发明的优选方式，所述的表达载体是PGL系列载体，更优选的为PGL-3载体。含有所述构建物的PGL-3载体在转入细胞并制备成细胞筛选模型后，细胞模型的敏感性特别好。所述的载体中还可以含有一些对于TRE的反应或报告基因的表达没有负面影响作用的其它元件。细胞模型及用途本发明还提供一种细胞，所述细胞具有蛋白激酶C信号通路；并且，所述细胞含有前面所述的载体；或其基因组中整合有前面所述的构建物。所述的细胞对于检测蛋白激酶C信号通路的变化特别敏感，可作为良好的药物筛选细胞模型。作为本发明的优选方式，所述的细胞是真核细胞。蛋白激酶C信号通路广泛分布于真核细胞特别是哺乳动物细胞内。作为本发明的优选方式，所述的细胞选自(但不限于)CH0细胞，服K-293细胞或Hela细胞。所述的细胞带有真核抗性，所述的真核抗性为Zeocin抗性，可良好地用于稳定转染细胞株的筛选和单克隆。本发明的细胞可作为细胞模型，用于筛选调节(如激活或抑制)蛋白激酶C(PKC)信号通路的物质，也即筛选蛋白激酶C信号通路的激活剂(如激动剂、上调剂等)或抑制剂(如拮抗剂，下调剂等)。所述的物质例如小分子物质、化合物或多肽。作为本发明的优选方式，所述的细胞还含有Gi/o偶联的G蛋白偶联受体(如CCR5)或酪氨酸激酶受体。上述受体存在于细胞膜上，与PKC信号通路相关。例如，CCR5在被激活后，可引起下游信号分子的活化，再进一步活化PKC，进而引起基因的转录。因此，可通过检测PKC的激活间接监测细胞膜相关受体的活性，从而用于受体的药物筛选。本发明还提供了一种构建报告基因细胞模型的方法，包括以下步骤(1)将EGFP序列连接到pGL3载体上的荧光素酶基因序列的下游，连接后得到荧光素酶与EGFP的融合基因；(2)将zeocin抗性基因连接到(l)获得的载体中荧光素酶与EGFP的融合基因的下游，用于真核抗性筛选；(3)将CMVmin启动子连接于(2)获得的载体上荧光素酶与EGFP的融合基因的上游，构成真核表达元件；(4)将9个串联的TRE序列连接到(3)获得的载体上；(5)在哺乳类动物细胞中转染(4)获得的质粒，培养转染的细胞，zeocin筛选两周后挑选单克隆，培养成细胞系。在另一优选例中，EGFP序列通过NcoI酶切位点与pGL3质粒上的荧光素酶基因连接构成荧光素酶与EGFP融合蛋白。在本发明的一个优选例中，所述的细胞选自HEK-293和Hela。在本发明的一个优选例中，所述的细胞为CHO/CCR5(即含有CCR5的CHO细胞)。筛选方法本发明以TRE作为分子靶点，可进行针对PKC信号转导通路的药物筛选，包括(但不限于)PKC激活剂或抑制剂的筛选，或偶联PKC信号转导通路的细胞受体(如G蛋白偶联受体或酪氨酸激酶受体)激活剂或抑制剂的筛选。因此，本发明提供了一种筛选调节蛋白激酶C信号通路的潜在物质的方法，所述方法包括将候选物质给予所述的细胞；和检测所述细胞中报告基因的表达情况；其中，若所述候选物质可提高报告基因的表达，则表明该候选物质是激活蛋白激酶C信号通路的潜在物质；若所述候选物质可降低报告基因的表达，则表明该候选物质是抑制蛋白激酶C信号通路的潜在物质。在本发明的优选方式中，在进行筛选时，为了更易于观察到蛋白激酶C信号通路的变化，还可设置对照组，所述的对照组可以是不添加所述候选物质的所述的细胞。作为本发明的一种优选方式，应用PKC激动剂来激活所述细胞中的PKC信号通路，从而筛选可拮抗PKC激动剂对于PKC信号通路的激活作用的拮抗剂。12在本发明的一些实例中，提供了筛选PKC信号通路的拮抗剂方法，包括先釆用PKC激动剂(如佛波醇-12-十四烷酸-13-乙酸酯，PMA)激活细胞内的PKC信号通路，然后用候选药物处理细胞，观察候选药物处理前后细胞内的报告基因的表达情况，如被PKC激动剂激活的PKC信号通路在候选药物处理后表达比处理前显著降低，则该候选药物是潜在的PKC信号通路的拮抗剂。作为本发明的一种优选方式，应用表达G蛋白偶联受体的所述细胞模型来筛选，从而筛选通过调节G蛋白偶联受体而影响PKC信号通路的调节剂。在本发明的一些实例中，提供了筛选G蛋白偶联受体激动剂或拮抗剂的方法。例如，筛选G蛋白偶联受体拮抗剂(如完全拮抗剂或者部分拮抗剂)的方法包括先应用G蛋白偶联受体(如CCR5)激动剂(如可选自RANTES、MIP-la或MIP-l(3)处理细胞，然后用候选药物处理细胞，观察候选药物处理前后细胞内的报告基因的表达情况，如被G蛋白偶联受体激动剂激活的PKC信号通路在候选药物处理后表达比处理前显著降低，则该候选药物是潜在的PKC信号通路的拮抗剂，或是潜在的G蛋白偶联受体的拮抗剂。这些初步筛选出的物质可构成一个筛选库，可对这些物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以进一步选择和确定对于调节蛋白激酶C信号通路有用的物质。因此，本发明还包括一类通过本发明的筛选方法获得的调节PKC信号通路或细胞受体的调节剂。本发明的主要优点在于(1)首次在质粒载体中优化组合了TPA反应元件(TRE)、巨细胞病毒(CMV)启动子、报告基因和抗性基因，这些元件可良好的配合，在转染入哺乳动物细胞后，可在细胞内高灵敏度地报告蛋白激酶C信号通路的情况。(2)本发明的细胞模型可用于对多个药物靶点进行筛选，以及进行针对多种适应症的药物筛选，包括糖尿病，慢性心脏病，HIV感染，自身免疫性疾病等°(3)本发明可高通量化，可快速、简便地筛选药物，适合用于大规模的药物筛选。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室指南(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。实施例l荧光素酶和EGFP融合蛋白表达载体的构建以pEGFP-Nl(Clontech)为模板，用PCR的方法获得EGFP基因片段，并在引物两端分别设计限制性内切酶酶切位点HindIII和BspHI。pGL3(promega)用HindIII，Ncol双酶切后，酶切产物与载体质粒pGL3酶切片段连接。连接产物转化大肠杆菌DH5a，挑选阳性克隆，抽提质粒，并进行双酶切鉴定。经鉴定连接成功的质粒记为pGL3-EGFP，在导入细胞后可表达EGFP与萤光素酶(luciferase)的融合蛋白。EGFP引物序列Ph5GCAGATCTTCATGAGTCAGACAGGCGTGTACGG3(SEQIDNO.1);P2:5AGGAAGCTTCGGTCCCGGTG3(SEQIDNO.2)。实施例2插入真核抗性基因的报告基因载体构建将pSV40/Zeo2质粒(购自invitrogen)用Bamffl和SalI双酶切，回收得到的l.lkb条带，与pGL3-EGFP的BglII和SalI双酶切产物连接。连接产物转化大肠杆菌DH5a，挑取5个单克隆在大肠杆菌内扩增，抽提质粒，并进行双酶切鉴定。鉴定成功后的质粒记为pGL3-EGFP-Zeo。实施例3插入真核表达调控元件的报告基因载体构建以pcDNA3为模板，用PCR的方法拉CMVmllin启动子，并在引物两端分别设计限制性内切酶酶切位点BglII和HindIII，酶切产物与载体质粒pGL3-EGFP-Zeo酶切产物连接。连接产物转化大肠杆菌DH5a，挑取5个单克隆在大肠杆菌内扩增，抽提质粒，并进行双酶切鉴定。鉴定成功后的质粒记为pGL3-CMVmin-EGFP-Zeo。根据TRE的序列，设计9个串联的TRE，并在体外人工合成两条互补单链，序列两端分别设计KpnI和BglII的酶切位点，由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。体外将两条单链退火，退火产物与pGL3-CMVmin-EGFP-Zeo酶切产物直接连接。连接产物转化大肠杆菌DH5a，挑取5个单克隆在大肠杆菌内扩增，抽提质粒，并进行双酶切鉴定。鉴定成功后的质粒记为pGL3-9TRE-CMVmin-EGFP-Zeo，并送往上海生工生物工程技术服务有限公司测序，以鉴定所有反应元件序列的正确性。报告基因载体的模式图如图l。CMVmin引物序列P3:5-3GGAAGATCTGTAGGCGTGTACGG(SEQIDNO.3);P4:5-3CCCAAGCTTGGGTCTCCCTATA(SEQIDNO.4)。串联的TRE引物序列P5:5-3CATGAGTCAGATGAGTCAGATGAGTCAGATGAGTCAGATGANO.5);(其中，前后的C作为粘性末端)；P6:5-3(SE(5IDNO.6)。实施例4PKC激动剂在HEK-293细胞中可激活报告基因的表达HEK-293细胞(人胚胎肾细胞，购自ATCC)用含10%胎牛血清的MEM细胞培养液，放于含5%002的37'C细胞培养箱中培养。HEK-293细胞以每孔20000个的密度铺24孔板，24小时后细胞汇合度约90%。用磷酸钙法转染(分子克隆实验方法，第二版，787792页)，每孔转染200ngpGL3-9TRE-CMVmin-EGFP-Zeo质粒，同时转染50ngp-gal质粒作为转染内参。转染后8小时换新鲜培养液，37°C，5%<302条件下培养过夜。转染后24小时用无血清培养液换液，继续培养24小时。然后在细胞培养体系中加入终浓度为100riM的PKC激动齐lJPMA(购自Sigma)，培养12小时后荧光显微镜下观察荧光。然后吸取培养液，加入荧光素酶裂解液(购自Promega)，裂解10分钟后，将细胞裂解液置-8(TC保存待检测。检测之前室温化开细胞裂解液，并在室温平衡至少30分钟。平衡好的细胞裂解液再分别测试P-gal活性和荧光素酶活性。取10ul裂解液，加入40ulTris和50ul(3-gal检测缓冲液，37'C培养2小时后加入100ulNaHC03终止反应，在酶标仪上用405nM的滤片检测读数。另取取20ul裂解液，加入10ul荧光素酶底物(购自Promega)，在微盘冷光检测仪(Microlumatplus,购自perkinelmer)上读数。结果表明，磷酸钙转染后的293细胞成功表达了(3-gal，见图2A,其读数用于排除转染率上的误差(即作为basal)。报告基因质粒也成功表达，在荧光显微镜下能看到明显的绿色荧光，见图2B。在100nM的PMA刺激的细胞中，绿色荧光强度显著强于未刺激的细胞，而荧光素酶活性则比未刺激的细胞提高了约IO倍，见图2C。实施例5PKC激动剂在Hda细胞中可激活报告基因的表达Hela细胞(人宫颈癌细胞，购自ATCC)用含10。/。胎牛血清的MEM细胞培养液，放于含5%(:02的37'C细胞培养箱中培养。Hela细胞以每孔1500个的密度铺96孔板，24小时后细胞汇合度约95%。用Lipofectamine(购自Invitrogen)转染，每孔转染150ngpGL3-9TRE-CMVmin-EGFP-Zeo质粒，同时转染100ng卩-gal质粒作为转染内参。转染后5小时换新鲜培养液，37°C，5%(:02条件下培养过夜。其余操作步骤同实施例4。结果表明，脂质体转染后的Hela细胞成功表达了p-gal，见图3A，其读数用于排除转染率上的误差(即作为basal)。报告基因质粒也成功表达，在荧光显微镜下能看到明显的绿色荧光，见图3B。在100nM的PMA刺激的细胞中，绿色荧光强度显著强于未刺激的细胞，而荧光素酶活性则比未刺激的细胞提高了IO倍，见图3C。实施例6PKC抑制剂在Hela细胞中可抑制PMA引起的报告基因表达Hela细胞以每孔1500个的密度铺96孔板，24小时后细胞汇合度约95%。用Lipofectamine(购自Invitrogen)转染，每孑L转染150ngpGL3-9TRE-CMVmin-EGFP-Zeo质粒，同时转染100ng(3-gal质粒作为转染内参。转染后5小时换新鲜培养液，37°C，5%(302条件下培养过夜。转染后24小时用无血清培养液换液，继续培养24小时。然后在细胞培养体系中加入终浓度为lmM的PKC拮抗剂Ro31-8220(购自Sigma)，37°C，5%(:02条件下预孵育3小时后加入终浓度为10nM的PKC激动剂PMA，培养10小时后收细胞。其余操作步骤同实施例4。结果表明，脂质体转染后的Hela细胞成功表达了(3-gal，其读数用于排除转染率上的误差(即作为basal)。报告基因质粒也成功表达，在荧光显微镜下能看到明显的绿色荧光。在10nM的PMA刺激的细胞中，荧光素酶活性显著高于未刺激的细胞，而加入Ro31-8220和PMA的细胞中，荧光素酶的活性与本底表达并无明显差异，见图6。说明10nM的PMA对PKC的激动作用被Ro31-8220成功抑制。此结果与其他文献报道一致，说明本发明构建的报告基因系统可应用于PKC拮抗剂的筛选。实施例7CHO/CCR5细胞系的建立从人白细胞(全血来源上海市血液中心)的总cDNA文库中通过RT-PCR克隆目的基因，得到编码CCR5的全长DNA，用限制性内切酶HindlII/Xho1(购自Promega)双酶切它们的全长DNA及空质粒pcDNA3(购自Invitrogen)，再通过T4连接酶(购自Promega)将它们的全长DNA插入pcDNA3(购自Invitrogen)中，得到质粒pcDNA3-CCR5。质粒的序列通过测序得到确证。CCR5PCR弓l物P7:5-3TCTAAGCTTGGCACGAGTCG3(SEQIDNO.7);P8:5-3TACCTCGAGAACAGGCAACGTA3(SEQIDNO.8)。CHO细胞(中华仓鼠卵细胞，购自ATCC)用含10。/。胎牛血清的a-MEM细胞培养液，放于含5%<:02的37'C细胞培养箱中培养。用Lipofectamine2000分别转染上述质粒于CHO细胞中。72小时后在培养液中加入600吗/mlG418(G418为一种抗生素，pcDNA3含G418抗性基因)，维持两周使得那些有G418抗性的细胞存活下来。接着，用MiniMACs免疫磁珠快速分选法(MiltenyiBiotec公司)筛选表达CCR5的CHO细胞，重复两次后挑单克隆。FACS(荧光活化的细胞筛选，Fluorescence-activatedCellSorting)检测细胞表面CCR5表达情况用0.04%EDTA-PBS(PBS:磷酸缓冲溶液)消化细胞，每管加入约106个细胞，用冷的PBS洗两遍；加入10)ag/ml—抗(小鼠来源anti-CXCRl、anti-CXCR4或anti-CCR5，均购自R&D)100ial，4。C避光孵育lh;用冷的0.1。/。BSA-PBS洗细胞17两次，加入1:100稀释的FITC标记的羊抗小鼠的二抗(购自JacksonImmunoResearch)80pl，4。C避光孵育40min;用冷的0.1。/。BSA-PBS洗细胞两次，加入300plPBS重悬细胞，用流式细胞仪(FACS)检测细胞表面荧光强度。淘汰受体表达低的克隆。此后FACS定期检测细胞的受体表达情况，选择维持3个月受体表达阳性率没有明显下降且用["S]-GTP丫S结合实验检测受体功能稳定的克隆作为稳定表达受体的细胞系。上述制备获得的细胞系记为CHO/CCR5，用于后续的实施例。实施例8报告基因载体在CHO/CCR5细胞系中稳定转染与CHO/CCR5/luc细胞系的建立CHO/CCR5细胞用含G418和10。/。胎牛血清的a-MEM细胞培养液，放于含5%C02的37'C细胞培养箱中培养。CHO/CCR5以每孔75000个的密度铺24孔板，24小时后细胞汇合度约90%。用Lipofectamine(购自Invitrogen)转染，每孑L转染500ngpGL3-9TRE-CMVmin-EGFP-Zeo质粒。转染后5小时换新鲜培养液，37°C，5%C02条件下培养过夜。转染24小时后，将孔内的细胞以不同的密度铺24孔板，24小时后在培养液中加入250吗/mlZeocin(购自Invitrogen)，维持筛选压力两周，每隔三天换一次液。随后，细胞在无血清培液中培养24小时，再加入10nM的RANTES培养12小时，用0.04。/。EDTA-PBS消化细胞，离心后去除上清，加入无血清培液重新悬浮，浓度为l(^个/ml。FACS分选并收集带GFP荧光的细胞，培养24小时后，用0.04。/。EDTA-PBS消化细胞，并用培液稀释至10个/ml，铺96孔板。培养两周后挑选有单克隆的孔，进行荧光素酶报告基因检测。选择阳性细胞克隆扩大，冻存，记为CHO/CCR5/luc。其中五个单克隆分别记为D2，AIO，Hll，E8和G4。实施例9PKC激动剂在CHO/CCR5/luc细胞系中可激活报告基因的表达CHO/CCR5/luc细胞用含Zeocin和10%胎牛血清的a-MEM细胞培养液，放于含5%032的37'C细胞培养箱中培养。CHO/CCR5/luc细胞每孔1200个的密度铺96孔板，24小时后用无血清的a-MEM细胞培养液换液，继续培养24小时后，加入终浓度为100nM的PMA、终18浓度10nM的RANTES、或者DMSO。培养12小时后裂解细胞，取20ul裂解液，加入10ul荧光素酶底物(购自Promega)，在微盘冷光检测仪(Microlumatplus,购自perkinelmer)上读数。结果表明，报告基因在CH0/CCR5/luc细胞中有本底表达，见图4A，有可见的绿色荧光及可测的荧光素酶活性，证明报告基因确实已经稳定转染。100nM的PMA处理后，细胞裂解液的荧光素酶活性显著提高，见图4B，证明报告基因系统在CH0/CCR5/luc细胞中工作正常。在加入10nMRANTES后，可明显引起荧光素酶报告基因活性的增加，见图4C。荧光素酶的活性比较见图4D。实施例IOCCR5激动剂RANTES在CHO/CCR5/luc细胞系中可激活报告基因的表达CHO/CCR5/luc细胞每孔1200个的密度铺96孔板，24小时后用无血清的a-MEM细胞培养液换液，继续培养24小时后，加入不同终浓度的RANTES(购自R&D)，终浓度分别是0.1nM，0.3nM，lnM,3nM，10nM，100nM。培养12小时后裂解细胞，取20ul裂解液，加入10ul荧光素酶底物(购自Promega),在微盘冷光检测仪(Microlumatplus，购自perkinelmer)上读数。结果表明，所选的五个单克隆，D2，AIO，Hll，E8禾口G4，均稳定表达了荧光素酶报告基因，有明显的本底表达。RANTES激动后引发CCR5受体介导的信号转导，激活PKC，进而引起荧光素酶报告基因活性的增加，并与RANTES呈浓度依赖性，见图5A-E。5个CHO/CCR5/luc克隆的RANTES刺激曲线EC50值如表1。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>五个单克隆的RANTES刺激ECso值均在l10nM之间，表明报告基因细胞系的剂量反应有较高的敏感性，可用于激动剂药物的大规模筛选，同时还可以用于针对RANTES的拮抗剂筛选。实施例llCCR5拮抗剂在CHO/CCR5/luc细胞系中可抑制报告基因表达的激活CHO/CCR5/luc细胞G4克隆每孔1200个的密度铺96孔板，24小时后用无血清的a-MEM细胞培养液换液，继续培养24小时后，加入终浓度是IOOnM的药物(分别是CCR5拮抗剂TD0501，TD0232，TD0082或TD0517，均由上海靶点药物有限公司提供)，在37'C，5%(302条件下预培养3小时后，在培养体系中加入终浓度为10nM的RANTES。继续培养10小时后，裂解细胞，其余操作步骤同实施例9。结果表明，RANTES可显著刺激荧光素酶报告基因的表达，证明本发明构建的药物筛选系统工作正常。在筛选的5个药物中，TD0501不能拮抗RANTES对CCR5受体的激动作用，而TD0232，TD0082以及TD0517均表现出了CCR5拮抗剂的活性，见图7。在本方法上得到的结论与通过其他筛选方法得出的结论一致，证明了本方法的可靠性。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。序列表<110〉中国科学院上海生命科学研究院<120〉用于筛选药物的报告基因细胞模型及其构建方法<130〉080832<160〉8〈170>Patentlnversion3.3<210〉1<211〉33〈212〉DNA<213〉人工序列<220〉<221〉misc—feature<223>引物〈400〉1gcagatcttcatgagtcagacaggcgtgtacgg33<210〉2〈211>20〈212〉隠<213>人工序列<220〉<221〉misc一feature<223〉引物<400〉2aggaagcttcggtcccggtg20<210〉3<211>23<212〉隱<213>人工序列<220〉<221〉misc_feature<223>引物<400>3ggaagatctgtaggcgtgtaegg<210〉4<211〉22<212〉腿<213〉人工序列<220〉<221〉misc—feature<223〉引物<400>4cccaagcttgggtctccctata<210〉5<211>83<212〉DNA〈213〉人工序列<220〉<221〉misc—feature<223>引物<400〉5catgagtcagatgagtcagatgagtcagatgagtcagatgagtcagatgagtcagatgag60tcagatgagtcagatgagtcagc83〈210〉6〈211〉91<212>DNA<213〉人工序列<220〉<221>niisc_feature〈223〉引物<400>6tcgagctgactcatctgactcatctgactcatctgactcatctgactcatctgactcatc60tgactcatctgactcatctgactcatggtac91<210〉7<211〉2022<212〉腿<213〉人工序列〈220〉<221〉misc—feature<223〉引物<■>7tctaagcttggcacgagtcg20<210>8〈211>22<212>DNA〈213〉人T序列权利要求1.一种构建物，其特征在于，所述构建物从5’端到3’端依次含有式I所示的结构A—B—C(式I)其中，A具有SEQIDNO5中第2-82位所示的序列；B为巨细胞病毒启动子序列；C为报告基因序列。2.如权利要求l所述的构建物，其特征在于，所述的构建物从5'端到3'端依次含有式II所示的结构A—B—C—D(式n)其中，D为Zeocin抗性基因序列。3.如权利要求l所述的构建物，其特征在于，所述的报告基因选自绿色荧光蛋白基因，禾口/或荧光素酶基因。4.一种载体，其特征在于，所述的载体含有权利要求1-3任一所述的构建物。5.—种细胞，其特征在于，所述细胞具有蛋白激酶C信号通路；并且，所述细胞含有权利要求4所述的载体；或其基因组中整合有权利要求l-3任一所述的构建物。6.如权利要求5所述的细胞，其特征在于，所述的细胞选自CH0细胞，HEK-293细胞或Hela细胞。7.如权利要求5所述的细胞，其特征在于，所述的细胞含有Gi/o偶联的G蛋白偶联受体或酪氨酸激酶受体。8.权利要求5所述的细胞的用途，其特征在于，所述的细胞用于筛选调节蛋白激酶C信号通路的物质。9.一种筛选调节蛋白激酶C信号通路的潜在物质的方法，其特征在于，所述方法包括(1)将候选物质给予权利要求5或6所述的细胞；和(2)检测所述细胞中报告基因的表达情况；其中，若所述候选物质可提高报告基因的表达，则表明该候选物质是激活蛋白激酶C信号通路的潜在物质；若所述候选物质可降低报告基因的表达，则表明该候选物质是抑制蛋白激酶C信号通路的潜在物质。10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤(l)包括在测试组中，将候选物质加入到权利要求5或6所述的细胞中；和/或步骤(2)包括检测测试组的体系中报告基因的表达，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的权利要求5或6所述的细胞；如果测试组中报告基因的表达在统计学上高于对照组，就表明该候选物是激活蛋白激酶C信号通路的潜在物质；如果测试组报告基因的表达在统计学上低于对照组，就表明该候选物是抑制激活蛋白激酶c信号通路的潜在物质。全文摘要本发明属于生物
技术领域：
，公开了一种独特的基因构建物，所述构建物兼容了TPA反应元件、巨细胞病毒启动子、报告基因和抗性基因的元件，这些元件可良好的配合，在转染入哺乳动物细胞后，可在细胞内高灵敏度地报告蛋白激酶C信号通路的情况。本发明还公开了含有所述构建物的载体，含有所述载体的细胞，所述细胞可作为模型用于蛋白激酶C信号通路调节药物的筛选。本发明提供的报告基因细胞模型可用于筛选与蛋白激酶C信号通路相关的药物，具有机制明确、操作简便、可高通量化的特点，对蛋白激酶C信号通路相关的药物筛选有积极的意义。文档编号C12N15/11GK101544975SQ200810035070公开日2009年9月30日申请日期2008年3月25日优先权日2008年3月25日发明者瑜吴,应锁环,瑾张,翟培彬,杨苏,钢裴,力陈,陈仁海申请人:中国科学院上海生命科学研究院