专利名称：：抗肿瘤转移药物高通量筛选模型的制作方法
技术领域：
：本发明属于药物领域，涉及抗肿瘤转移药物高通量筛选模型。
背景技术：
：组织因子(tissuefactor,简称TF)，即凝血因子III，为单链跨膜糖蛋白，属于细胞因子超家族成员，是生理性止、凝血过程及多种病理性血栓形成的启动因子[1]。TF既是凝血因子VD(FVD)在细胞表面的受体，又是FVD或FW(a)的辅因子。当血管破损后或在病理情况下，血液暴露于能表达TF的细胞表面，受体TF即与其配体VD或VDa形成复合物，进而同时激活凝血因子X和IX，激活的FXa和FIXa进一步激活凝血酶原(FII)，Flla使纤维蛋白原变成纤维蛋白，从而完成凝血的级联反应，导致血液凝固。许多心血管疾病如动脉粥样硬化(AS)、急性冠脉综合征以及某些疾病的血栓栓塞性并发症都与TF密切相关W。同时，TF的生物学作用的多样性已经得到证实，除了其在凝血过程中的作用以外，TF还承担了信号受体和其他非凝血功能，使得它在系统性炎症3、败血症、动脉粥样硬化、肿瘤的血管发生及转移等疾病中都起重要作用[4]，并且与胚胎的正常发育有关[5]。这就使TF或TF/FVn(a)复合物成为抗凝、抗血栓及抗肿瘤药物等发现的一个很有吸引力的新靶点。因而从天然化合物中寻找TF抑制剂或其先导化合物可能会有深远的意义。肿瘤的转移是一个多步骤、多阶段的肿瘤细胞与宿主细胞相互作用的复杂的生物学过程，与肿瘤治疗的远期效果密切相关。大致步骤是①原发灶肿瘤细胞的增殖及游离；②肿瘤细胞浸润血管基底膜、游走至血管内；③与转移部位血管内皮细胞粘附，并穿过血管内皮细胞、游走至血管外；④转移至靶器官并增殖，形成转移灶。肿瘤的转移涉及多方面的细胞外、细胞内信号转导途径，并有多种细胞因子、生物信号分子的参与。近年来的临床观察和体内外实验研究均证实[6]:高表达TF的实体瘤(如直肠癌)细胞转移能力强，且由转移病灶建立的亚系表达TF的能力较母系细胞高。用TF单抗阻断TF受体功能后，可使侵袭至SCID小鼠肺部血管的肿瘤细胞数减少，肺转移灶减少。有学者将低表达和高表达TF的黑色素瘤细胞系分别注射至SCID小鼠体内，结果发现注射高表达TF细胞的小鼠有86%出现癌细胞转移，而注射低表达TF细胞的小鼠仅5%出现癌转移，且这种作用可被TF抗体取消m。经研究证实，TF可调节肿瘤血管的生成和抗血管生成之间的平衡。体内实验发现高表达TF的转染细胞和未经转染的细胞比较，高表达TF的转染细胞生长速度快，肿瘤体积大且血管丰富，低表达TF者则相反，并发现高表达TF的肿瘤细胞其有丝分裂活性增强，VEGF转录增强，具有抗血管生成作用的凝血酶敏感蛋白(TSP)转录减弱f81。因此，TF可能是促进肿瘤血管形成的直接诱因，而恶性肿瘤诱导血管生成是其恶性特征之一，也是肿瘤生长和转移的先决条件。高通量药物筛选(HTS)是近十年国际药业研究发展过程中兴起的一门新兴技术，它已经被世界各大医药公司广泛用于药物先导物的筛选。通过对种类繁多的合成及天然化合物作针对各种药物靶体的筛选，从中寻找最佳的先导化合物，进而用于新型药物的开发。其特点是规模大、速度快、成本相对较低，缩短新药开发周期[15'2<)]。研究发现TF与肿瘤的生成、浸润和转移相关，但目前尚未有利用的细胞水平组织因子高通量药物筛选模型进行筛选抗肿瘤转移药物的报导。
发明内容本发明的目的是建立一种能够用于筛选抗肿瘤转移药物的组织因子抑制剂高通量药物筛选模型。本发明的目的是通过下列技术方案实现的一种抗肿瘤转移药物高通量筛选模型，该模型的筛选方法是MDA-MB-435细胞接种于培养板，培养液中分别加入待筛化合物，以不加任何抑制剂为对照，共同培养适当时间后反复冰融，得细胞裂解液；细胞裂解液加入含CaCl2的人凝血酶原复合物溶液共同孵育，加入发色底物，于405nm测定吸光度，计算TF抑制率，抑制率大于20%的化合物为阳性化合物。所述抗肿瘤转移药物高通量筛选模型，其中MDA-MB-435细胞接种时的细胞密度为2~4X106/ml;培养基为含10%小牛血清的DMEM培养基；凝血酶原复合物浓度在0.008~0.012g/ml:细胞裂解液加入人凝血酶原复合物溶液共同孵育的时间为1520min。所述抗肿瘤转移药物高通量筛选模型，其中发色底物为S-2222，发色底物浓度为0.5mM。所述抗肿瘤转移药物高通量筛选模型，其中MDA-MB-435细胞接种时的细胞密度为4X10ml;凝血酶原复合物浓度在0.008g/ml;细胞裂解液加入人凝血酶原复合物溶液共同孵育时间为15min。所述抗肿瘤转移药物高通量筛选模型，该模型的具体筛选方法是生长良好的MDA-MB-435细胞按4xl06/ml接种于96孔培养板，每孔180^1细胞液，培养至细胞状态良好，贴壁80%左右，吸干培养基，空白孔及对照组分别加入20(HU新鲜培养基，给药孔分别加入新鲜培养基和2(^1待筛选化合物，放入37'C孵箱共同培养6h，反复冻融3次，取细胞裂解液；1^细胞裂解液与2^浓度为0.01g/ml的人凝血酶原复合物溶液在384孔板中、37'C下共同孵育15min,然后每孔加入2C^l浓度为0.5mM的37'C预热的S-2222，37'C温育3min，用微孔板测读仪以405nm测定吸光度，计算抑制率；以不加任何抑制剂的为阴性对照，初筛化合物终浓度为lxlO—SM，加入化合物后抑制率大于20%的，为阳性化合物。本发明的有益效果本发明选用人乳腺癌细胞MDA-MB-435成功建立了快速稳定、灵敏度高、操作简便的抗肿瘤转移药物筛选模型，具有微量、准确的特点，适用于高通量筛选抗肿瘤转移药物。图1:生长良好的435细胞；图2:不同细胞密度对测定的影响；图3:凝血酶原复合物不同浓度对测定的影响；图4:不同孵育时间对实验的影响；图5:不同CaCl2浓度对实验的影响；图6:不同EDTA浓度对实验的影响；图7:不同发色底物浓度对实验的影响；图8:九种细胞TF活性测定。具体实施例方式以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。实施例1材料和方法1.仪器<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>2.材料和试剂MDA-MB-435(人乳腺癌细胞，中国医学科学研究院基础所细胞库)、IM-3(人肝癌细胞，中山医院肝癌研究所)、LLC细胞(荧光标记Lewis肺癌细胞，南京大学模式动物中心)、SGC-7901(人胃癌细胞，医科院基础所细胞库)、BGC-823(人胃癌细胞，医科院基础所细胞库)、HL-60(人白血病细胞，医科院基础所细胞库)、A549(人肺癌细胞，医科院基础所细胞库)、L-02(人肝细胞，医科院基础所细胞库)、Bel-7402细胞(人肝癌细胞，医科院基础所细胞库)DMEM培养基，1640培养基等(GIBCO公司)。细胞培养常规试剂(胰蛋白酶，批号1013S04，AMRESCO分装，南京生兴生物技术有限公司；氨苄青霉素，批号0321S05，AMRESCO分装，南京生兴生物技术有限公司；链霉素，批号0307S05CA，AMRESCO分装，南京生兴生物技术有限公司；碳酸氢钠，分析纯，批号021010767，南京化学试剂一厂)。新生小牛血清(GIBCO公司)。人凝血酶原复合物(华兰生物工程股份公司)。S-2222(Sigma)CaCl2，EDTA均为化学纯。3.溶液配制3.1:培养基DMEM培养基将lOgDMEM干粉溶于卯OmL三蒸水中，加入NaHC033.7g，氨苄青霉素0.1183g，链霉素0.1g，缓慢搅拌4h,调节pH至7.2，稀释至1L,抽滤除菌，分装时加入10%小牛血清，4'C保存。1640培养基将10g1640干粉溶于900mL三蒸水中，加入NaHC032.0g，氨节青霉素0.1183g，链霉素0.1g，缓慢搅拌4h,调节pH至7.2,稀释至1L，抽滤除菌，分装时加入10%小牛血清，4'C保存。3.2:PBS(pH7.2)称取KCI0.2g,KH2P040.2g，NaCl8g,Na2HP04'12H202.08g,依次溶于1000ml三蒸水中，高压灭菌，4'C保存。3.3:消化液称取胰蛋白酶1.25g，溶于500ml灭菌PBS中，室温搅拌4小时，过滤除菌，得胰蛋白酶溶液。称取EDTA0.1g，溶于500mLPBS中，搅拌至溶解，高温灭菌，得EDTA溶液。将EDTA溶液和胰蛋白酶溶液按体积比1:l混合，4'C保存。4.实验步骤4.1实验条件的确定4丄I细胞密度对实验的影响以细胞密度为横坐标，OD405为纵坐标，细胞密度以10"ml为单位，选定测量范围0.5~8，测定此范围内不同细胞密度下的吸光度值，来选取最合适的细胞密度。4丄2凝血酶原复合物的浓度对实验的影响以凝血酶原复合物浓度为横坐标，OD405为纵坐标，浓度以g/L为单位，选定测量范围6~20，测定此范围内不同凝血酶原复合物浓度下的吸光度值，来选取最合适的凝血酶原复合物浓度。4丄3孵育时间对实验的影响以时间为横坐标，OD4()5为纵坐标，孵育时间以min为单位，选定测量范围1035min，测定此范围内不同孵育时间下的吸光度值，来选取最合适的孵育时间。4丄4CaCl2浓度对实验的影响以CaCl2浓度为横坐标，OD405为纵坐标，浓度以mmol/L为单位，选定测量范围50~200,测定此范围内不同CaCl2浓度下的吸光度值，来选取最合适的CaCl2浓度。4.1.5EDTA浓度对测定的影响以EDTA浓度为横坐标，OD405为纵坐标，浓度以mmol/L为单位，选定测量范围50200，测定此范围内不同EDTA浓度下的吸光度值，来选取最合适的EDTA浓度。4丄6不同发色底物浓度对实验的影响以S-2222浓度为横坐标，OD4Q5为纵坐标，浓度以mmol/L为单位，选定测量范围0.0625-1，测定此范围内不同发色底物浓度下的吸光度值，来选取最合适的发色底物浓度。4.2细胞株的筛选选取生长状态良好，成指数生长的九种细胞(MDA-MB-435、IM-3、LLC、SGC-7901、BGC-823、HL-60、A549、L-02、Bel-7402)，按4><106/ml接种于96孔培养板，每孔细胞液，培养至细胞状态良好，贴壁80%左右，反复冻融3次，取细胞裂解液，采用下文介绍的发色底物法来测定九种细胞的TF活性，选取合适的细胞进行本实验。4.3细胞的培养4.3.1细胞复苏从液氮罐中取出细胞冻存管，迅速放入37'C水浴中，并不时摇动，在lmin内使其完全融化。经75%乙醇消毒冻存管外壁后，于室温下1000rmin"离心5min,弃去上层液，加入1mlDMEM+10%小牛血清培养基重悬，转移至细胞培养瓶中，再加入培养基(MDA-MB-435、IM-3用DMEM培养基，其余细胞用1640培养基，下同)10ml左右，吹匀，37'C、5。/。C02培养细胞至贴壁后更换培养基，继续培养。4.3.2细胞传代MDA-MB-435细胞培养于含10%小牛血清的DMEM培养基中，37°C、5%二氧化碳培养箱中孵育，23天换液一次。待细胞长满细胞培养瓶底时倒去培养基，加入含0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA的消化液，37'C消化至细胞成片脱落(显微镜下细胞由皱变圆)，再加入含血清培养基终止反应，反复吹打使细胞悬浮，快速转移至10ml无菌有帽离心管中，1000rmin—'离心5min，弃上层液，加入5ml培养基重悬细胞，并转移至培养瓶中，37°C、5%<:02培养至细胞贴壁后更换培养基，继续培养。4.3.3MDA-MB-435常规细胞形态观察取培养瓶中生长至融合的MDA-MB-435细胞，换上新鲜培养基，用倒置相差显微镜观察细胞生长情况。结果显示如图1，细胞均匀铺满瓶底，排列整齐，胞桨饱满，生长良好。取第20~30代细胞用于试验。4.4加药MDA-MB-435细胞按4xl06/ml接种于96孔培养板，每孔180^1细胞液，培养至细胞状态良好，贴壁80%左右，吸干培养基，空白孔及对照组(阴性对照不加药)分别加入200pl新鲜培养基，给药孔分别加入18(^1新鲜培养基和2(^1lxl(T5M的各种待筛选化合物，放入37'C孵箱共同培养6h，反复冻融3次，取细胞裂解液。4.5TF促凝活性的测定(发色底物法)4.5.1基本原理根据TF-VIIa复合物活化的Xa可以使发色底物(chromogenicsubstrate,S-2222)分解为多肽和对硝基苯胺(pNA),后者在405nm处有吸收高峰，用微孔板测读仪测定405nm处的OD值，该值能反映TF的活性水平W。该方法灵敏、简单、快速，是国际上公认的测定TF活性的方法。原理如下TF+FVHra2+，FVDapH7.3，FXCa2+，FVHaFXapH7.3S-2222_FYa,peptide(多肽)+pNApH8.4另外，结合参考文献及实际情况，本实验设计采用商品化的人凝血酶原复合物(PPSB)作为因子VD、X的来源16，71。4.5.2步骤细胞裂解液(18^1)与人凝血酶原复合物溶液(2nl，0.01g/ml，含有CaCl25mmol/l)在384孔板中、37'C下共同孵育15min，然后每孔加入37'C预热的Chromogen^substrate(20^1，0.5mM，含25mmol/LEDTA)，37'C温育3min，用微孔板测读仪以405nm测定吸光度[6'8。(CaCl2、EDTA皆为终浓度)步骤如下细胞裂解液U8pl)+凝血酶原复合物溶液(2jil，0.01g/ml，含有CaCl2,5mmo1/1)37°C15minChromogenicsubstrate(20(^1，0,5mM，含25mmol/LEDTA)37。CmmA4054.6数据处理本实验以不加任何抑制剂的为阴性对照，初筛化合物终浓度为lxlO—5M。将加入化合物后抑制率大于20%的，定义为具有抑制活性，以+表示。阴性对照组OD值-药敏组OD值TF抑制率％=-x100%阴性对照组OD值.5.实验结果5.1实验条件的确定5丄1细胞密度对实验的影响细胞密度会直接影响测定结果的阴性值，继而影响活性化合物的筛选。根据实验，确定合适的细胞密度为2~4X106/ml。结果见图-2。5丄2凝血酶原复合物的浓度对实验的影响实验测定，适宜的凝血酶原复合物浓度在0.0080.012g/ml范围内，本实验采用的浓度为0.008g/ml。结果见图-3。5丄3孵育时间对实验的影响孵育时间会直接影响TF-VDa复合物的形成，接着影响因子Xa的激活，时间太短反应不完全，会使模型的灵敏度下降，而反应时间太长，也将难以反映抑制剂的真实效应。实验发现1520min的反应时间较为合适，见图-4。实验孵育时间为15min。5丄4CaCl2浓度对实验的影响从图-5中可以清楚的看出，当CaCh浓度为100mmol/L时在405nm处的吸光度最大，本实验正是采用了这个浓度。5丄5EDTA浓度对测定的影响从图-6中可以看出，EDTA浓度为50或10Ommo1/1时的吸光度测定值均较高，本实验使用50rnmo1/1的EDTA浓度。5丄6不同发色底物浓度对实验的影响从图-7可以看出，发色底物浓度为0.5mM时的吸光度值(OD4G5)较大，实验灵敏度较高，且浓度大小合适，不易造成浪费，故以后的实验均采用0.5mM的发色底物浓度。以上实验分别对细胞密度、孵育时间及各种试剂的使用浓度等条件进行了优化，结果见表l。表l:实验各影响因素的条件优化<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>5.2细胞株的筛选(九种细胞TF活性测定)通过对LLC、SGC-7901、MDA-MB-435、BGC-823、HL-60、A549、L-02、IM-3、Bd-7402九种细胞TF促凝活性的测定，筛选出TF活性高、具有高转移能力的人乳腺癌细胞MDA-MB-435作为建模所用细胞株。(LLC为小鼠肺癌细胞，所以不优先选择)筛选结果如表-2和图-8:表2:九种细胞TF活性测定<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>实施例2按实施例1方法采用最适条件对不同化合物进行筛选，结果见表2、3。最适条件为细胞采用MDA-MB-435，细胞接种时的细胞密度为4X106/ml;凝血酶原复合物浓度在0.008g/ml;细胞裂解液加入人凝血酶原复合物溶液共同孵育时间为15min。发色底物为S-2222,发色底物浓度为0.5mM,CaCl2最适浓度为100mmol/L，EDTA最适浓度为50mmol/L。操作方法生长良好的MDA-MB-435细胞按4><106/ml接种于96孔培养板，每孔180pl细胞液，培养至细胞状态良好，贴壁80%左右，吸干培养基，空白孔及对照组分别加入20(^1新鲜培养基，给药孔分别加入18(^1新鲜培养基和20pl待筛选化合物，放入37。C孵箱共同培养6h，反复冻融3次，取细胞裂解液；18nl细胞裂解液与2pl浓度为0.01g/ml的人凝血酶原复合物溶液在384孔板中、37'C下共同孵育15min，然后每孔加入20^d浓度为0.5mM的37。C预热的S-2222，37'C温育3min，用微孔板测读仪以405nm测定吸光度，计算抑制率；以不加任何抑制剂的为阴性对照，初筛化合物终浓度为lxlO'SM，加入化合物后抑制率大于20%的，为阳性化合物。表2、部分初筛结果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>说明a:lxl(T5M，b:lxl(T6M，c:lxl(T7M，d:lxl(T8M。编号为104967的化合物是姜黄素；编号为104147的化合物是小檗碱；DT-13为短葶山麦冬皂苷C;其余的编号化合物的结构与名称由样品提供者控制。由于TF可调节肿瘤血管的生成和抗血管生成之间的平衡，高表达TF的肿瘤细胞转移能力强，因此，筛选得到的TF抑制率较高的化合物可作为抗肿瘤转移药进行进一步的研究。对照例:用Bel-7402做筛选模型筛选DT13结果见表4(其他实验方法及条件相同)，结果表明采用Bel-7402细胞建模与采用MDA-MB-435细胞相比灵敏性低，不利于抗肿瘤转移药物的筛选。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>权利要求1、一种抗肿瘤转移药物高通量筛选模型，其特征在于该模型的筛选方法是MDA-MB-435细胞接种于培养板，培养液中分别加入待筛化合物，以不加任何抑制剂为对照，共同培养适当时间后反复冰融，得细胞裂解液；细胞裂解液加入含CaCl2的人凝血酶原复合物溶液共同孵育，加入发色底物，于405nm测定吸光度，计算TF抑制率，抑制率大于20％的化合物为阳性化合物。2、根据权利要求1所述抗肿瘤转移药物高通量筛选模型，其特征在于MDA-MB-435细胞接种时的细胞密度为24X10"ml;培养基为含10。/。小牛血清的DMEM培养基；凝血酶原复合物浓度在0.0080.012g/ml;细胞裂解液加入人凝血酶原复合物溶液共同孵育的时间为1520min。3、根据权利要求1所述抗肿瘤转移药物高通量筛选模型，其特征在于发色底物为S-2222,发色底物浓度为0.5mM。4、根据权利要求1所述抗肿瘤转移药物高通量筛选模型，其特征在于MDA-MB-435细胞接种时的细胞密度为4X106/ml;凝血酶原复合物浓度在0.008g/ml;细胞裂解液加入人凝血酶原复合物溶液共同孵育时间为15min。5、根据权利要求1所述抗肿瘤转移药物高通量筛选模型，其特征在于该模型的筛选方法是生长良好的MDA-MB-435细胞按4xl(^/ml接种于96孔培养板，每孔180^1细胞液，培养至细胞状态良好，贴壁80%左右，吸干培养基，空白孔及对照组分别加入200nl新鲜培养基，给药孔分别加入18(^1新鲜培养基和2(^1待筛选化合物，放入37'C孵箱共同培养6h，反复冻融3次，取细胞裂解液；181^1细胞裂解液与2^浓度为0.01g/ml的人凝血酶原复合物溶液在384孔板中、37'C下共同孵育15min,然后每孔加入20pl浓度为0.5mM的37匸预热的S-2222,37。C温育3min，用微孔板测读仪以405nm测定吸光度，计算TF抑制率；以不加任何抑制剂的为阴性对照，初筛化合物终浓度为lx10—5M,加入化合物后抑制率大于20%的，为阳性化合物。全文摘要本发明属于药物领域，公开了抗肿瘤转移药物高通量筛选模型。该模型的筛选方法是MDA-MB-435细胞接种于培养板，培养液中分别加入待筛化合物，以不加任何抑制剂为对照，共同培养适当时间后反复冰融，得细胞裂解液；细胞裂解液加入含CaCl<sub>2</sub>的人凝血酶原复合物溶液共同孵育，加入发色底物，于405nm测定吸光度，计算抑制率，抑制率大于20％的化合物为阳性化合物。本发明选用人乳腺癌细胞MDA-MB-435成功建立了快速稳定、灵敏度高、操作简便的抗肿瘤转移药物筛选模型，具有微量、准确的特点，适用于高通量筛选抗肿瘤转移药物。文档编号G01N21/00GK101376907SQ20081015644公开日2009年3月4日申请日期2008年10月10日优先权日2008年10月10日发明者余伯阳,立孙,寇俊萍,张陆勇,伟施,袁胜涛申请人:中国药科大学