专利名称：一类高通量药物筛选用微球及其制备方法
技术领域：
本发明属于高通量药物筛选用微球及其制备方法技术领域，具体涉及一种生物相容性好的高通量药物筛选用微球及其制备方法。
背景技术：
据统计，一种新药的上市平均需要15年和80亿美元，而且药物成本越来越高， 时间越来越长，可是人类面临着各种各样疾病的困扰，迫切要求能更快更便宜的生产出新药。上个世纪90年代以来，组合化学，基因组学，蛋白质组学等科学的发展，对药物的发展产生了深远的影响。但是，这些技术的发展，使得人类无法按传统的筛选方法去寻找合适药物，这就要求新技术的出现。从20世纪80年代后期以后，高通量筛选(High Throughput Screening of drugs,HTS)就作为一种新型的筛选方法，以其快速、简便、微量、高效的特点逐步得到完善和发展。邻近闪烁分析(SPA)是众多高通量筛选用的分析方法中的一种。20世纪30年代起，人们开始把放射性技术应用于各种分析技术中，1978年出现第一篇SPA专利，这种技术开始商业化，同时促使了该技术的发展与应用。面对高通量药物筛选的需求，SPA因其操作简便、灵敏性高而成为高通量药物筛选所用方法的第一个选择，用于处理数量庞大的可筛选样本，从而也成为了高通量筛选中最常用、最成熟的分析手段。与其它分析方法相区别的是，SPA有三个特殊的要素邻近闪烁材料一般为微球(里面含有荧光物质，表面连接研究标靶即受体，酶或者抗体，)、含放射性追踪物质的材料(配体，底物或者抗原)和闪烁检测器。这三个要素中至关重要的是微球载体，它对药物筛选的质量和效果将产生决定性影响。 适合SPA的微球材料有以下要求较好的透光性和适宜的表面特性以及力学强度、还要有接近理想球形的几何形状，微球粒径大小大约为5 μ m、单分散性好、表面光滑无孔、并带有适合于吸附或固定靶点大分子的功能基团。分散聚合可以制备1 μ m-10 μ m尺寸的微粒，而且粒径分布均勻，其体系包括单体、引发剂、稳定剂和溶剂。通过分散聚合制备的聚苯乙烯功能化微球具有更好的硬度、更窄的粒径分部、更大的对生物大分子的结合量。而表面含各种官能团，能更好的进行下一步改性工作。一般在聚苯乙烯微球的表面接上羧基，缩水甘油基、醛基、羟基等官能团，然后再通过与其他化合物反应，连接具有不同长度的空间臂，或者其他物质，以适合不同的蛋白质。壳聚糖是天然多糖中唯一的碱性多糖，含有氨基、羧基和羟基，而且其生物相容性很好。目前壳聚糖多直接用于合成微球[康杰等，福建医学院学报，1996， 30 (1)，CN200510057193. 5]或者制备成磁性微球[姜德生等，应用化学，200522 (10) CN200810064076. 5，]，然后表面改性，可用于多种酶的固定化，如胰蛋白酶，胃蛋白酶，漆酶等。但是很少用于改性高聚物微球。壳聚糖因其富含氨基，羧基，能与蛋白质中的氨基、羧基以及其他基团反应；而且壳聚糖在不同PH值下，带不同量的电荷，可以与蛋白质通过静电作用进行结合。另外，调节壳聚糖在微球表面的含量和分布，可以使微球表面最大程度地适合蛋白质的天然构象。把这样的微球应用于临近闪烁分析法时，其高通量药物筛选的质量和效率得到了很大的提高。
发明内容
本发明的目的是针对已有技术存在的问题，提供一类新的高通量药物筛选用微球的制备方法。本发明提供的高通量药物筛选用微球，其特征在于，它是由苯乙烯、荧光物质、功能性单体和壳聚糖组成。其中荧光物质和苯乙烯经聚合反应后形成母体微球，第一功能性单体提供环氧基、醛基、羟基和酰胺基等活性官能团，第二功能性单体提供氨基、醛基等作为交联和空间臂的官能团，壳聚糖作为生物相容性材料。筛选微球粒径一致性U < 0. 3，粒径为3-7 μ m，可用于临近闪烁分析法(SPA)。本发明提供的制备上述高通量药物筛选微球的方法，其特征在于该方法的工艺步骤和条件如下1)将0. 5-3份引发剂、1-6份分散稳定剂、300-800份分散介质、0. 1-0. 9份荧光物质和100-200份苯乙烯，在氮气保护下，于40-80°C下反应4_8小时，聚合装置转速 150-270rpm ；2)将3-8份第一功能性单体溶解在100-200份分散介质中，在40_80 V， 250-350rpm搅拌条件下，于1-4小时滴完；3)滴加完后继续反应2-6小时后，冷却，过滤，用乙醇和二次蒸馏水分别洗涤，离心2-3次，干燥得到表面含有反应活性官能团的聚苯乙烯荧光微球；4)取15-60份上述荧光微球，加入400-800份2_6wt%的氨水溶液(或者2_6wt% 的二试剂的磷酸盐缓冲液)，在25-60°C，适当搅拌速度下反应10-12小时后，用二次蒸馏水洗涤，离心。其次，加入400-800份0. 5-6wt%的二醛的磷酸盐缓冲液，在20-40°C，适当搅拌速度下反应3-6小时。最后再次用二次蒸馏水洗涤，离心，干燥备用；5)取15-60份上述微球，加入0. 5-5份的壳聚糖，2_5wt% 400-1000份醋酸溶液， 在30-60°C，适当的搅拌速度下反应4-8小时。反应完全后，分别用醋酸和蒸馏水洗涤，离心，干燥得到微球。所述的制备方法，其特征在于，反应条件温和易于实行，并且采用该方法制备的高通量药物筛选微球满足临近闪烁分析法，其一致性U < 0. 3，粒径为3-7 μ m。该方法所述的第一功能性单体，其特征为，所述的第一功能性单体为丙烯醛、丁烯醛、丙烯酸胺、丙烯酸羟丙酯、苯乙烯磺酸钠、烯丙基缩水甘油醚和甲基丙烯酸缩水甘油酯等含活性官能团烯烃中的任一种。该方法中所述的壳聚糖，其特征在于，该壳聚糖为水溶性、高密度、低密度以及纳米级壳聚糖等中的任一种。该方法中所述的荧光物质，其特征在于，该荧光物质为1，4_双[2-(5_苯基)噁唑基]苯(POPOP)、1，4- 二(5-苯基-2-噁唑基)苯(BPOB) ,2,5- 二苯基噁唑(PPO)、异硫氰酸荧光素(FITC)、四乙基罗丹明(RB200)、四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)等中的任一种。该方法中所述的二胺试剂和二醛试剂，其特征在于，该二胺试剂为乙二胺、丙二胺、丁二胺、戊二胺以及己二胺等中的一种；该二醛试剂为乙二醛、丙二醛、顶二醛、戊二醛和己二醛等中的任一种。该方法中所使用的引发剂，其特征在于，引发剂为偶氮二异丁氰(AIBN)、过氧化苯甲酰(BPO)、叔丁基过氧化氢(TBHP)、过氧化苯甲酸叔丁酯(TBPB)等中的任一种。该方法中所使用的分散稳定剂，其特征在于，分散稳定剂为聚吡咯烷酮(PVP)、聚乙二醇(PEG)、聚氧乙烯(PEO)、聚丙烯酸(PAA)、纤维素及羟丙基甲基纤维、纤维素乙酸酯、 羧甲基纤维素等中的任一种。该方法中所使用的分散介质，其特征在于，分散介质为甲醇、乙醇或者甲醇、乙醇与水的混合物中的甲醇与水的比例为30/1-50/1，乙醇与水的比例为30/1-50/1 ；本发明与已有技术相比，具有以下优点1、由于本发明制备的高通量药物筛选微球采用多种官能团物质改性，所以能满足更多的蛋白质或者酶的固定化。2、由于本发明在表面改性中引入了壳聚糖，壳聚糖良好的生物相容性，多官能团 (胺基、羟基和羧基)，使得微球表面固定化蛋白质时，蛋白质构象变化很少，使得筛选结果的质量得到很大的提高。3、本发明提供的制备高通量药物筛选微球的方法简单、工艺成熟、比较容易控制。
具体实施例方式下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明作进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员根据上述本发明内容对本发明做出一些非本质的改进和调整，仍属于本发明保护范围。实施例1将0. 5份AIBN、1份PVP、400份无水乙醇、0. 1份POPOP和100份苯乙烯，在氮气保护，40°C，150rpm条件下反应4小时。然后将溶有3份甲基丙烯酸缩水甘油酯的100份无水乙醇缓慢滴入，相同条件下反应，控制滴加时间为1小时，滴加完后继续反应2小时。醇洗，水洗，离心，干燥。取上述制备的微球15份，加入2衬％己二胺的磷酸盐缓冲液400份， 在20°C，200rpm的条件下反应10小时，水洗，离心。继续加入2wt %乙二醛的磷酸盐缓冲液 400份，室温条件下反应3小时，水洗，离心，干燥备用。取表面含氨基和醛基的微球15份， 加入溶有0. 5份水溶性的壳聚糖的醋酸溶液400份，在30°C，200rpm的条件下，反应4小时， 醋酸洗涤，水洗涤，离心，干燥。实施例2将2份ΒΡ0，4份PEG，600份无水乙醇、0. 5份TRITC和150份苯乙烯，在氮气保护， 70°C，250rpm条件下反应5小时。然后将溶有5份烯丙基缩水甘油醚的150份无水乙醇缓慢滴入，在70°C，300rpm条件下，控制滴加时间为2小时，滴加完后继续反应5小时。醇洗， 水洗，离心，干燥。取上述制备的微球30份，加入二胺的磷酸盐缓冲液600份，在 50°C，200rpm的条件下反应12小时，水洗，离心。继续加入2衬％丙二醛的磷酸盐缓冲液 600份，室温条件下反应5小时，水洗，离心，干燥备用。取表面含氨基和醛基的微球30份， 加入溶有2份水溶性的壳聚糖的醋酸溶液600份，在50°C，200rpm的条件下，反应6小时， 醋酸洗涤，水洗涤，离心，干燥。实施例3
6
将3份TBPB，6份ΡΕ0，1000份无水乙醇、0. 9份POPOP和200份苯乙烯，在氮气保护，70°C，250rpm条件下反应8小时。然后将溶有8份甲基丙烯酸缩水甘油酯的300份无水乙醇缓慢滴入，在70°C，300rpm条件下，控制滴加时间为3小时，滴加完后继续反应6小时。 醇洗，水洗，离心，干燥。取上述制备的微球60份，加入2wt %氨水800份，在60°C，200rpm 的条件下反应12小时，水洗，离心。继续加入丁二醛磷酸盐缓冲液800份，室温条件下反应6小时，水洗，离心，干燥备用。取表面含氨基和醛基的微球60份，加入溶有5份水溶性的壳聚糖的醋酸溶液1000份，在60°C，200rpm的条件下，反应8小时，醋酸洗涤，水洗涤，离心，干燥。实施例4将2份BP0，4份PAA，600份无水甲醇、0. 5份PPO和150份苯乙烯，在氮气保护， 70°C，250rpm条件下反应4小时。然后将溶有5份苯乙烯磺酸钠的160份无水乙醇缓慢滴入，在70°C，300rpm条件下，控制滴加时间为3小时，滴加完后继续反应5小时。醇洗，水洗， 离心，干燥。取上述制备的微球15份，加入溶有5份高密度的壳聚糖的醋酸溶液600份，在 50 V，200rpm的条件下，反应8小时，醋酸洗涤，水洗涤，离心，干燥。实施例5将1份AIBN，3份纤维素，800份30/1的乙醇水、0.6份FITC和180份苯乙烯， 在氮气保护，70°C，250rpm条件下反应6小时。然后将溶有6份丙烯醛的200份30/1的乙醇水缓慢滴入，在70°C，300rpm条件下，控制滴加时间为2小时，滴加完后继续反应4小时。醇洗，水洗，离心，干燥。取上述制备的微球25份，加入4%丙二胺的磷酸盐缓冲液700份ml，在50°C，200rpm的条件下反应10小时，水洗，离心。继续加入4% (wt% ) 己二醛的磷酸盐缓冲液700份，30°C下反应6小时，水洗，离心，干燥备用。取上述微球20 份，加入溶有5份低密度的壳聚糖的醋酸溶液600份，在50°C，200rpm的条件下，反应8小时，醋酸洗涤，水洗涤，离心，干燥。实施例6将2份BP0、4份羟丙基甲基纤维、600份50/1的甲醇水、5份BPOB和150份苯乙烯，在氮气保护，70°C，250rpm条件下反应4小时。然后将溶有5份丙烯酸羟丙酯的200份 50/1的甲醇水缓慢滴入，在70°C，300rpm条件下，控制滴加时间为3小时，滴加完后继续反应5小时。醇洗，水洗，离心，干燥。取上述微球15份，加入溶有3份纳米级别的壳聚糖的醋酸溶液400份，在25°C，200rpm的条件下，反应5小时，醋酸洗涤，水洗涤，离心，干燥。实施例7将1份TBHP，3份纤维素乙酸酯，800份30/1的乙醇水、6份BPOB和180份苯乙烯，在氮气保护，70°C，250rpm条件下反应6小时。然后将溶有6份丁烯醛的200份30/1的乙醇水缓慢滴入，在70°C，300rpm条件下，控制滴加时间为2小时，滴加完后继续反应4 小时。醇洗，水洗，离心，干燥。取上述制备的微球30份，加入6衬％戊二胺的磷酸盐缓冲液 700份，在50°C，200rpm的条件下反应10小时，水洗，离心。继续加入6wt%戊二醛的磷酸盐缓冲液700份1，30°C下反应6小时，水洗，离心，干燥备用。取上述微球20份，加入溶有 5份水溶性的壳聚糖的醋酸溶液600份，在50°C，200rpm的条件下，反应8小时，醋酸洗涤， 水洗涤，离心，干燥。实施例8
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将1份TBPB，3份羧甲基纤维素，800份50/1的乙醇水、0. 9份RB200和180份苯乙烯，在氮气保护，70°C，250rpm条件下反应6小时。然后将溶有4份丙烯酸胺的200份 50/1的乙醇水缓慢滴入，在70°C，300rpm条件下，控制滴加时间为2小时，滴加完后继续反应4小时。醇洗，水洗，离心，干燥。取上述微球15份，加入溶有3份纳米级别的壳聚糖的醋酸溶液400份，在25°C，200rpm的条件下，反应5小时，醋酸洗涤，水洗涤，离心，干燥。对比例将0. 2份AIBN，0. 4份PVP，600份乙醇和150份苯乙烯，在氮气保护，70°C，250rpm 条件下反应5小时。将溶有5份苯乙烯磺酸钠的150份乙醇缓慢滴入，控制滴加时间为3 小时，且继续反应4小时。醇洗，水洗，离心，干燥。
权利要求
1.一类高通量药物筛选用微球，其特征在于它是由苯乙烯、荧光物质、功能性单体和壳聚糖组成，含有150-600份聚苯乙烯、3-8份第一功能单体、1-4份第二功能单体、0. 1-0.9 份荧光物质和0. 5-5份的壳聚糖；其中荧光物质和苯乙烯经聚合反应形成母体微球；第一功能性单体提供环氧基、磺酸基、醛基、羟基和酰胺基活性官能团；第二功能性单体提供氨基、醛基作为交联和空间臂的官能团；壳聚糖作为生物相容性材料；筛选微球粒径一致性U < 0. 3，粒径为3-7 μ m，可用于临近闪烁分析法(SPA)。
2.根据权利要求1所述的一类高通量药物筛选用微球，其特征在第一功能性单体为丙烯醛、丁烯醛、丙烯酸胺、丙烯酸羟丙酯、苯乙烯磺酸钠、烯丙基缩水甘油醚和甲基丙烯酸缩水甘油酯含活性官能团烯烃中的任一种；所述的第二功能性单体为二胺试剂、氨水或二醛试齐LU
3.根据权利要求1所述的一类高通量药物筛选用微球，其特征在于壳聚糖为水溶性、 高密度、低密度以及纳米级壳聚糖中的任一种。
4.根据权利要求1所述的一类高通量药物筛选用微球，其特征在于荧光物质为1，4_双 [2-(5-苯基)噁唑基]苯(POPOP)、1，4-二 (5-苯基-2-噁唑基)苯(BPOB)、2，5-二苯基噁唑(PPO)、异硫氰酸荧光素(FITC)、四乙基罗丹明(RB200)、四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC) 中的任一种。
5.根据权利要求2所述的一类高通量药物筛选用微球，其特征在于二胺试剂为乙二胺、丙二胺、丁二胺、戊二胺和己二胺中的任一种；所述的二醛试剂为乙二醛、丙二醛、丁二醛、戊二醛和己二醛中的任一种。
6.一种制备权利要求1、2或3所述的高通量药物筛选用微球的方法，其特征在于该方法的工艺步骤和条件如下1)将0.5-3份引发剂、1-6份分散稳定剂、300-800份分散介质、0. 1-0. 9份荧光物质和100-200份苯乙烯，在氮气保护下，于40-80°C下反应4-8小时，聚合装置转速150-270 rpm ；2)将3-8份第一功能性单体溶解在100-200份分散介质中，在40-80°C，250-350rpm搅拌条件下，1-4小时滴完；3)滴加完后继续反应2-6小时后，冷却，过滤，用醇和二次蒸馏水分别洗涤，离心2-3 次，干燥得到表面含有反应活性官能团的聚苯乙烯荧光微球；4)取15-60份上述荧光微球，加入400-800份2_6wt%的氨水溶液(或者2_6wt%的二胺试剂的磷酸盐缓冲液)，在25-60°C，适当搅拌速度下反应10-12小时后，用二次蒸馏水洗涤，离心；其次，加入400-800份0. 5-6wt %的二醛的磷酸盐缓冲液，在20_40°C，适当搅拌速度下反应3-6小时；最后再次用二次蒸馏水洗涤，离心，干燥备用；5)取15-60份上述微球，加入0.5-5份的壳聚糖，2-5wt% 400-1000份醋酸溶液，在 30-60°C，适当的搅拌速度下反应4-8小时；反应完全后，分别用醋酸和蒸馏水洗涤，离心， 干燥得到微球。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于引发剂为偶氮二异丁氰(AIBN)、过氧化苯甲酰(BPO)、叔丁基过氧化氢(TBHP)、过氧化苯甲酸叔丁酯(TBPB)中的任一种。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于分散稳定剂为聚吡咯烷酮(PVP)、聚乙二醇 (PEG)、聚氧乙烯(PEO)、聚丙烯酸(PAA)、纤维素及羟丙基甲基纤维、纤维素乙酸酯、羧甲基纤维素中的任一种。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于分散介质为甲醇、乙醇或者甲醇、乙醇与水的混合物中的一种；其中，甲醇与水的比例为30/1-50/1，乙醇与水的比例为30/1-50/1。
全文摘要
本发明公开一类高通量药物筛选用微球及其制备方法，其中含有150-600份聚苯乙烯、3-8份第一功能性单体、1-4份第二功能性单体、0.1-0.9份荧光物质和0.5-5份壳聚糖。本发明提供的微球满足高通量药物筛选中临近闪烁分析法(SPA)要求，其粒径大小在3-7μm，一致性U＜0.3(U值越小，说明其粒径分布越窄)。微球表面的壳聚糖中含有氨基，羧基和羟基，这些可以与蛋白质的氨基，羧基和其它基团共价结合或者静电结合。另外，壳聚糖在微球表面会形成亲/疏水区域，可以与蛋白质形成疏水作用，同时壳聚糖的生物相容性良好，从而避免了筛选时蛋白质的构象改变，可提高筛选质量和效率。
文档编号C08L51/00GK102432973SQ20111025751
公开日2012年5月2日 申请日期2011年8月22日 优先权日2010年8月20日
发明者刘白玲, 彭钢, 江正武, 赵春霞 申请人:中国科学院成都有机化学有限公司