专利名称：高通量药物筛选用载体及其合成和药物筛选的判定系统的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种高通量筛选用荧光载体微球及其合成方法、以及使用荧光载体微球建立药物筛选模型的技术路线和质量判定标准和药物筛选的智能化数学物理模型的构筑，是高分子化学、生物化学、物理化学和数学的多学科交叉领域。
背景技术：
高通量筛选技术(High-throughput Screening，HTS)是20世纪80年代后期形成的寻找药物的高新技术，是应用先进的分子生物学、细胞生物学、计算机、自动化控制等高新技术，建立的一套更适合于药物筛选的技术系统。高通量筛选技术以分子和细胞水平的实验方法为基础，以微孔板形式作为实验工具载体，以自动化操作系统执行实验过程，以计算机对实验获得的数据进行分析外理，在同一时间内可以对数以万计的样品进行快速检测。在高通量筛选中，亲近闪烁分析技术(Scintillation ProximityAssay，SPA)由于具有检测灵敏度高，分析适用性强和无须对反应物和底物进行繁琐的分离等优点已发展为高通量筛选中最常见、最基本的分析检测手段之一。在目前的药物筛选中使用的检测方法中有大约20～50％是基于亲近闪烁分析技术进行的。
亲近闪烁分析方法的基本原理是将靶分子(受体、酶或相关蛋白质)固定于含有荧光闪烁剂的载体表面，当标记的配靶与受体发生亲合时，标记同位素释放的β粒子就会激活微球中的闪烁剂产生荧光(为生物医学中的一种冷光)；反之无亲合作用时，放射性同位素距离闪烁剂较远，其释放的能量被体相环境吸收，无法激活闪烁剂，故不产生冷光。冷光闪烁现象可以为高通量筛选提供直接配-靶相互作用信息，从而为发现先导药物提供条件。从亲近技术的基本过程看，高通量筛选技术涉及荧光载体的合成技术、使用荧光载体微球建立药物筛选模型的技术路线和质量判定标准、以及药物筛选的智能化数学物理模型的构筑技术。其中，载体微球材料的合成是药物筛选的基础，荧光载体微球与靶分子的相互作用模式是影响筛选质量的关键所在。依据材料的物理特性，高通量筛选技术要求载体具有良好的生物相容性及一定的光学透明性；而载体材料的合成技术则要求方法简单，合成周期短且成本相对低廉。微球与靶分子、靶分子与靶分子自身间的相互作用，要保证靶分子天然构象的相对稳定性，以确保筛选药物的正确性。而智能化数学物理的构筑技术则要求在高通量的筛选中能方便地进行定性、定量的判断和处理。
目前，高通量筛选中荧光载体的合成主要有以下几种方法1、球外悬挂法(美国专利US Pat.No.519430)通过荧光染料与微球表面功能基团的共价结合使微球表面带有一种或几种荧光物质；2、共聚或包覆法(美国专利US Pat.No.5073498及US Pat.No.4717655)在微球的聚合过程中加入荧光物质，使荧光材料以共聚或包覆的形式固定于微球中；3、物理吸附染色法(美国专利US Pat.No.5723218)将微球浸泡于溶有荧光材料的溶液中，通过物理吸附作用使微球得以标记荧光。
目前，在高通量筛选过程中，靶分子通常以化学或静电方式连接于载体材料的表面，因此载体微球须负荷一定的功能基。药物的疗效取决于建立的筛选模型中靶分子的结构和构象，大量基础研究表明，载体表面的疏水性能对靶分子构象及吸附特异性构成显著影响。为降低载体表面疏水性对生物大分子构象的影响，常用的做法是对微球的表面进行亲水性改性。如目前国际成熟商品化的聚乙烯基甲苯荧光微球，其制备通常是先制备聚合物微球前驱体，随后用聚羟基化合物对其表面进行亲水性改性以降低表面疏水性，并进行表面功能化处理。尽管该种荧光载体在高通量筛选中获得了较大范围的应用，然而其明显的缺陷是合成过程烦琐复杂、合成周期长，且聚乙烯基甲苯的光学性有待于提高。
高通量筛选技术是以自动化为基础，每天可对几万、几十万种化合物进行测试。其中，智能化数学物理模型的技术设计是实现筛选过程智能化与自动化的基础，更是实现对样品库大规模筛选的前提。由于生物环境中，药物与靶分子(特别是多靶点体系)的作用极为复杂(如化学偶联、静电作用、疏水作用及分子间氢键作用等)，因此很难在一般意义上进行定量模型的构筑。目前，国际知名药物研究和生产机构均以各种经验关系式、构效关系式和叠代关系式等作为其实现智能化与自动化的基础。这些核心技术的构筑依赖于以往数据及经验的积累，对于高通量筛选技术起步较晚的国家(如中国)的药物研究极为不利。因此有必要将热力学、动力学及统计力学结合起来，进行筛选方面的研究和应用。
自“八五”以来，国家新药物攻关课题70％以上是仿制产品，发展新药多是以仿效为主，仿创结合，真正由我国自己研制的全新药物寥寥无几。究其原因，那就是我国药物筛选的核心技术和相关材料的研制技术远远落后于国际。高通量药物筛选需要大量的检测试剂(实际上即为建立的筛选模型)，而国内尚无规模化的产业化基地，目前我国使用的检测试剂基本依赖进口，价格十分昂贵。生物环境中药物与靶分子作用的复杂性和特异性决定了筛选模型(特别是通用性模型)设计的困难性，因此高通量筛选中药靶相互作用及固定化体系相互作用模型的设计及应用并不多见，在国内更是如此。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高通量筛选中荧光载体及其相对简单合成方法，并基于这种合成的载体形成药物筛选模型的技术路线和质量判定标准，构筑不同筛选体系的智能化数学物理定量模型。
本发明的目的可通过以下措施来达到1、荧光载体的设计及合成，即设计合成一种生物相容性较强、表面疏水性相对较弱特点的荧光载体，生物靶分子可以通过共价键或静电作用方式连接于载体表面；2、基于上述载体形成药物筛选模型的技术路线，并根据配体与靶分子及靶分子自身间的相互作用，考察这种相互作用是否对生物大分子的构象造成影响，从而建立对筛选模型的筛选质量的判定系统；3、在建立的筛选模型具有实用性的基础上，根据被筛药物组成与细胞表面受体的可能作用方式，建立高通量筛选中智能化数学物理模型，定量处理配体化合物与靶分子相互作用；以统计学及力学理论为手段，构筑高通量药物筛选的智能化与自动化的数学物理模型。
具体地说本发明的技术方案如下荧光载体的合成本发明提供的高通量药物筛选用荧光载体，其特征在于所述荧光载体材料具有光学透明性，并在其表面通过活性氢位点，将稳定剂的亲油端接枝于载体粒子的表面，亲水端位于载体粒子的外侧。
它是由下列重量配比的原料制备而成A主单体10～12％w/w；B功能单体0.2～0.8％w/w；C稳定剂1～2％w/w；D引发剂0.1～0.2％w/w；E荧光闪烁剂0.1～0.2％w/w；F分散介质100％；其中，所述主单体A为甲基丙烯酸酯或苯乙烯；功能单体B为含有醛基或磺酸基的不饱和有机物；C为聚乙烯基吡咯烷酮或聚乙烯醇，引发剂D为过氧化物类引发剂；荧光闪烁剂E为有机高度共轭体化合物；分散介质F为小分子一元醇或醇-水混合物。
进一步地，所述A主单体为甲基丙烯酸甲酯或苯乙烯；所述B功能单体为丙烯醛或丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸；所述C稳定剂为聚乙烯基吡咯烷酮；所述D引发剂为过氧化苯甲酰，所述E荧光闪烁剂为DPO(2，5-diphenyloxazole)或BPOB〔1，4-Bis(5-phonyloxazol-2-yl)benzene〕，所述F分散介质为甲醇或甲醇与水。
本发明提供的制备高通量药物筛选用荧光载体方法包括如下步骤a.主单体、闪烁剂、稳定剂、引发剂和部分分散介质一次性加入到四口反应瓶中，室温下在氮气氛中搅拌使体系混合均匀，功能单体溶于另一部分分散介质中。
b.在氮气的保护下搅拌，升温至60-80℃，反应8-15h；将溶于分散介质的功能单体缓慢地滴加至反应体系中，继续反应10-20h后分离、洗涤，即得最终目标载体。
其中，上述制备方法中所述原料配比为A主单体10～12％w/w；B功能单体0.2～0.8％w/w；C(稳定剂)1～2％w/w；
D引发剂0.1～0.2％w/w；E荧光闪烁剂0.1～0.2％w/w；F分散介质100％。
其中，所述主单体A为甲基丙烯酸酯或苯乙烯；功能单体B为含有醛基或磺酸基的不饱和有机物；C稳定剂为聚乙烯基吡咯烷酮或聚乙烯醇，引发剂D为过氧化物类引发剂；荧光闪烁剂E为有机高度共轭体化合物；分散介质F为小分子一元醇或醇-水混合物。
其中，功能单体B可以为丙烯醛或丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸；所述D引发剂可以为过氧化苯甲酰，所述E荧光闪烁剂为DPO〔2，5-diphenyloxazole〕或BPOB〔1，4-Bis(5-phonyloxazol-2-yl)benzene〕，所述F分散介质为甲醇或甲醇与水。
本发明对药物筛选模型质量的判定系统由以下步骤组成以上述合成微球为载体，以酶和相关蛋白质为靶分子，研究载体与靶分子的相互作用机制，探讨靶分子与载体及靶分子自身相互作用对筛选的影响，进而建立对药物筛选模型质量的判定系统，其主要包括(1)共价键或静电作用的方式偶联生物靶分子根据分子间相互作用的方式，如共价键、静电力等，选择载体与靶分子相应的固定化形式。通常，共价键连结方式为高通量筛选中最基本的固定化形式，其要求载体表面能提供可与靶分子键合的表面功能基。由于醛基和生物大分子的-NH2基反应能形成席夫碱(Schiff base)，且具有高的反应活性，故表面带有醛基的微球成为制备的主要载体。静电作用是生命现象中最普遍存在的一种作用，也是药物筛选中有效的联结靶分子的常用方法之一。目前常用的有磺酸基及羧酸基载体等。在药物筛选中，依靶分子性质可选用不同固定化模式。操作中，将合成功能载体微球与生物靶分子孵育一段时间，离心分离，由紫外-可见光谱测定吸附量，由吸附量的大小初步选择是共价键还是静电力形式固定。
(2)选择载体与靶分子适当的外部环境(pH和离子强度)靶分子性质依赖于外部环境，如pH条件及离子强度等。在等电点附近，靶分子几乎不带电，其结构处于折叠或缔合状态，其结果使固定化量增加，此时由筛选获得的化合物可能不符合生物体环境中靶分子的真实构象；远离等电点，静电排斥作用将使蛋白质吸附量急剧减小，也不符合生物体环境中靶分子的真实构象。因而，应选择与靶分子所处的生物体环境相近的pH条件。
离子强度对靶分子构象和固定化量的影响可分为两种，其一是所谓的“原盐效应”，另一是静电作用。原盐效应使蛋白质游离浓度减小，结果将降低药物筛选中靶分子的固定化量，从而降低高通量筛选的检测灵敏性；其次，由于盐离子的存在，其所带电荷对靶蛋白分子的双电层有压缩作用，将降低靶分子间的静电作用范围，所以能增加药物筛选中靶分子的固定化量；结果在靶蛋白的等电点附近，蛋白质吸附量随离子强度增加而下降；在远离等电点时，随着离子强度的增加，蛋白质吸附量相应能增加药物筛选中靶分子的固定化量；结果在靶蛋白的等电点附近，蛋白质吸附量随离子强度增加而下降；在远离等电点时，随着离子强度的增加，蛋白质吸附量相应增加。静电作用的不利点是双电层的压缩可能对靶分子性质影响，特别是有些阴离子还能和氨基键合，将导致靶分子构象的改变，从而影响筛选的真实性。因此，在高通量筛选中，体系应采用较低的离子强度或不引入离子，以消除“原盐效应”和静电作用对靶分子构象的影响。
(3)利用紫外原位技术考察固定化过程中对靶分子构象的影响药物的疗效取决于靶分子在生物体内和体外筛选过程中构象的一致性。因此，在高通量筛选中，固定化过程不应使靶分子构象发生重大改变，否则体外获得的化合物将会变为体内的无效物。本发明利用紫外原位技术在线监测固定化过程中靶分子紫外吸收曲线的变化。在固定化过程中，由于载体与靶分子相互作用的存在，靶分子的紫外吸收光谱会逐步发生变化。若UV光谱图变化较大，则说明靶分子与载体相互作用较强，使靶分子的构象发生了大的改变，由体外筛选获得的化合物将会变为体内无效的化合物，没有治疗效果；反之，若吸收光谱仅出现最大吸收峰位的小幅或微幅漂移，而不呈现光谱图形的重大变化，则靶分子与载体相互作用较弱，由体外筛选获得的化合物将具有治疗效果。
(4)动态条件下测定靶分子的吸附等温线在高通量筛选中，依据靶分子与载体材料的相互作用原理，载体材料的生物相容性要求对靶分子的构象和活性等性质影响较小，不能使靶分子变性。因此，载体材料的生物相容生必须在动态中考查。由于固定化过程是吸附与脱附的平衡过程，所以测定体相中靶分子性质随时间的变化就可了解吸附-脱附过程中载体材料对靶分子性质的影响。吸附等温线及相关动力学过程是研究靶分子固定化规律的基本手段，更是研究分子间相互作用的定量判别依据之一。吸附动力学可以给出吸附达到平衡时(即吸附达最大量)所需的时间，为等温线的测定提供选择平衡条件的基础。在不同时间段测定载体对靶分子的吸附量，当吸附量达最大值时，与之对应的时间称之为平衡时间。等温线测定时，以生物靶分子的不同浓度体系测定其相应吸附量，以平衡浓度对吸附量作吸附等温线。从吸附等温线获得数据经与多种吸附模型拟合后，可确定靶分子遵守的固定化规律，初步了解吸附-脱附动态过程中载体材料对靶分子生物构象的影响的大小。
(5)以经典理论(Langmuir，Freundlich，Temkin和Association等温模型)为手段，探讨靶分子间可能存在的相互作用，及靶分子在表面存在的状态及分子间相互作用形式对筛选质量可能造成的影响，从而建立了本发明所述的筛选质量的评估系统。
在高通量筛选模型的构建中，靶分子与载体表面、表面相与表面相、表面相与体相靶分子相互作用能对靶分子构象构成显著影响。靶分子构象的变化可能使体外筛选获得的化合物变成体内无效的化合物，因此应对分子间相互作用进行评估。在目前研究分子间的相互作用时，Langmuir、Freundlich及Temkin经典吸附理论已被广泛采用。其中，Langmuir经典理论被认为各种理论发展的基础，是一个理想的模型，类似于理想气体状态方程。大量实践证明，Langmuir理论只适用理想模型，即靶分子间相互作用极弱或无相互作用，且载体表面是均匀的情形。本发明中按下式对吸附过程进行拟合CQ=1KQm+1QmC]]>式中C为靶分子平衡浓度；Q与Qm分别为实际吸附量及最大吸附量；K为靶分子与载体的亲合常数。依据上式可知，在高通量筛选中，若C/Q对C作图为一直线，则靶分子间没有相互作用或相互作用极弱。此时分子间相互相用对靶分子构象影响较小，故用此靶分子作为受体建立的高通量药物筛选模型，筛选获得的化合物可直接应用于生物体环境中。
Freundlich及Temkin吸附理论仅适用于在靶分子存在相互作用及靶分子与载体表面相互作用较强的情形。与Freundlich理论相比，Temkin吸附理论描述的是相互作用更强的体系。在本发明的高通量筛选实验中，可分别按下式对吸附过程进行拟合lnQ=m1nlnC+lnKQm]]>(Freundlich理论定量表达式)Q＝A0lnC+A0lnf(Temkin理论定量表达式)式中C、Q及Qm的物理意义同上，分别为靶分子平衡浓度，实际吸附量与最大吸附量；K、A0和f为常数。显然，在高通量筛选中，若InQ(或Q)对lnC为一直线，则靶分子间存在着较强的相互作用。分子间相互相用对靶分子构象影响较大，筛选条件下靶分子的构象可能已不同于生物体环境中靶分子的真实构象。此时，筛选获得的配体化合物的有效性有待于进一步竞争实验的证实，特别是对遵守Temkin理论的体系。
缔合模型主要应用于等电点附近的筛选体系。在高通量筛选中，靶分子性质依赖于pH条件。在等电点附近，蛋白质分子几乎不带电，其结构处于折叠或缔合状态，其结果使固定化量增加；远离等电点，静电排斥作用将使蛋白质吸附量急剧减小。药物的疗效取决于靶分子的构象及自身的结构。靠近蛋白质等电点，靶分子结构已处于折叠状态，此时由筛选获得的化合物可能不符合生物体环境中靶分子的真实构象。判别时，可按下式对吸附过程进行拟合CmQ=1KQm+1QmCm]]>(相互作用弱的体系)lnQ=(mn)lnC+lnKQm]]>(相互作用强的体系)
式中C、Q和Qm的物理意义同上，分别为靶分子平衡浓度、实际固定化量和最大固定量；K为亲合常数；m为靶分子缔合度；n为常数。在高通量筛选中，若Cm/Q对Cm作图为一直线，则靶分子固定化是以缔合状态进行的。如前所述，药物的疗效取决于靶分子的构象及自身的结构。缔合状态分子构象已不同于游离态靶分子的真实构象，此时由筛选获得的化合物基本不具备发展为合格药物的潜力。
在进行高通量筛选模型(也即筛选试剂)的制备时，可采用批实验的形式。在一个带有搅拌装置的恒温槽内，放置数个反应管。反应前将载体材料和靶分子在给定温度下恒温约30分钟，再放入反应管内进行固定化。固定一定时间后离心分离上清液，以紫外分光光度法测定残余靶分子量，吸附量以总量减去残余靶分子量计算。当以酶为靶分子研究固定化对靶分子生物活性的影响时，可用固定化前后酶活性的变化来表征。将离心分离后的固定化样品重新分散于给定的缓冲液中，再加入底物进行催化水解，酶活性以单位时间催化水解产物量表示。经固定化的酶，其活性降低率的大小，即代表了载体对靶分子生物构象影响的程度。
通过以上途径，本发明将靶分子的固定化形式、载体对靶分子构象及活性的影响程度、靶分子自身的相互作用、外部环境在高通量筛选中的角色进行了有效的概括，并能对筛选的质量进行初步的评估。本发明所提出的方法不仅适用于本文中所合成的载体和选择的蛋白，而且可适用于许多类似的相关过程，尤其是动态法的提出能对固定化过程中蛋白质的性质进行在线的跟踪。
本发明智能化数学物理模型包括(1)确定药物与靶分子的亲合常数KA(或解离常数Kd)；(2)依据筛选条件下药物与靶标的相互作用模式，建立高通量药物筛选的定量处理系统，即给出药物发挥最佳疗效的最适浓度。
具体地说，本发明智能化用数学物理模型是这样建立的(1)确定药物与靶分子的亲合常数KA(或解离常数Kd)药物研制和开发的首要步骤是寻找和鉴定与生物靶分子具有高亲合力的配体化合物。因此在高通量药物筛选中，配体化合物的亲合常数KA(或离解常数Kd)是极其重要的参数。它不仅是对配体化合物亲合能力大小的评价标志，更是对高通量筛选药物质量评估的最基本的参数之一。
在配体化合物与受体(或抗原与抗体、酶与底物等)特异性结合的过程中，配体化合物一方面由于受到靶分子的亲合作用力与靶分子结合；而另一方面受自身热运动及频率振动的影响，趋向于逃离结合位点。当配体化合物与靶分子的结合速率与解离速率相等时，配体化合物与靶分子亲合作用达成动态平衡。基于Langmuir理论的处理可获得Cm=1KAmm+1mmC---(1)]]>
式中m为配体对靶分子的结合量，其值可由固定化前后配体化合浓度的变化求得；C为配体化合物体相浓度(平衡浓度)；KA和mm为配靶亲合常数及靶分子对配体的最大结合量。在筛选条件下，以C/m对C作图，由直线的斜率可求得配体化合物的最大结合量，而以斜率除以截距可求得配体对靶标的亲合常数KA。当将采样参数编程后，由计算机自动完成库化合物与标记配靶亲合常数的比较，计算机便可直接给出是否有必要对该配体化合物继续研究的信息。若标记配靶亲合常数大于计算机中的亲合常数，则说明所筛选的配体，即被筛物的疗效强，或可成为拮抗剂；反之，说明疗效弱，或无用。
(2)依据筛选条件下药物与靶标的相互作用模式，建立高通量筛选的定量处理系统高通量筛选实现的是对样品库大规模的筛选，所以要求借助各种数学物理模型，对大量实验数据进行快速的分析与定量处理，并给出相关的定量信息。在生物环境中，药物与靶点的作用极为复杂，要想用常规的微分方程对其进行定量描述则极为因难，而且也得不到宏观的统计性。本发明率先将热力学、动力学及统计力学结合起来，依据上述的几种药物与靶分子相互作用方式，对药物筛选过程中药物与靶点间的作用模式进行了定量处理，获得了它们相应的定量关系式，见李松军，刘白玲，胡杰，高通量药物筛选中筛选模型的建立，“中国科学院研究生院学报，2004，21(3)，333-339。
依据药物活性成分的不同，筛选条件下药物与靶标的定量模式相应分为以下三种A.单一组分小分子化合物的筛选定量处理系统在简单活性小分子化合物的筛选定量处理中，由于体系只有一种活性成分，故直接由统计理论可获得结果ΔCB*=ama-b=nBCA0CB02nB-n]]>其中ΔCB*为最佳药物作用量(ΔCB=CB0-CB]]>，指反应前后体系中药物浓度的变化)a、b、m为常数(m=CA0CB0]]>，a＝nB，b＝n-nB)，n为可结合位点数，nB为被药物分子占据的位点数，CA0和CB0分别为靶分子和药物分子的初始浓度。
B.多组分药物的筛选定量处理系统在多组分药物筛选的处理中，若不同活性组分结合位点不同，则对具体组而言，与单组分子处理相似。当结合位点相同时，不同组分间存在着相互竞争；其最终结合量则由其与靶分子的亲合力差异决定。靶分子对任意活性成分的吸收量用统计权重法处理，可得以下公式。
ΔCB*=xΣi=1maiΣi=1m(ai+bi)θi=nBCA0CB0n]]>式中符号及意义同上。
C.成分复杂药物(如中草药)的筛选定量处理系统中草药成为极为复杂，其大多数组分不为人们了解，且取材地不同时组分可能不同。在与靶标作用时，这类药物与靶标的亲合作用与它们的组成密切相关。当不同活性组分结合位点不同时，其定量与单活性化合物的筛选系统相同。当结合位点相同时，亲合能力强的将被靶标吸收，而亲合能力相对较弱的则不被吸收。依据统计及力学理论可获得这类药物与靶分子亲合时的定量关系ΔCB*=CA0nBRTexp(E‾RT)]]>ΔCB*、CA0、nB意义同上。式中R为标准气体常数(8.314J·mol·K-1)，T为热力学绝对温度(K)， 为体系中组分与靶分子的平均亲合能。从上式可知，在这类药物的筛选过程中，药物与靶点的相互作用不仅与靶标浓度及靶点分布密切相关，而且还与测试温度密切相关。因此，在筛选这类药物时要严格控制测试温度。当将不同参数输入计算机后，这类药物的吸收量取决于靶标的初始浓度。通过药物的吸收与靶标浓度的标准曲线又可推得药物对结合位点的占据情况，从而为药理研究提供了直接的理论依据。
在计算的帮助下，以上三式可成为靶点占据情况判别的重要依据之一。
纵上所述，K值是确定被筛化合物是否可作为药物(也即前导药物)的标准，ΔCB*给出了使药物发挥最佳疗效的最适浓度，K与ΔCB*结合，在高通量药物筛选中作为高通量药物筛选的定性和定量依据，即确立了本发明智能化用数学物理模型。
本发明的特点从以上说明可以看出，本发明由载体材料的一步合成方法、筛选中相互作用模型设计和智能化数学物理模型的构筑技术等三个模块构成，分别涉及高分子化学、生物化学、物理化学及统计学等科学的范畴，形成了一个完整高通量筛选技术系统。
本发明合成载体有如下特点与其它载体材料，聚甲基丙烯酸甲酯微球不仅具有良好的生物相容性和相对较弱的疏水性，而且还具一定的光学透明性。因此，聚甲基丙烯酸甲酯更适合用作高通量筛选的载体材料。而聚苯乙烯微球则具有易于表面功能化，与生物大分子结合量大的特点。
为使生物大分子能以共价或静电作用的方式连接于载体的表面，本发明选择了含有醛基或磺酸基的不饱和有机化合物作为功能单体。依分散聚合机理可知，稳定剂对形成粒子的稳定化机理主要是空间位阻机理；合成中，通过活性氢位点，稳定剂的亲油端被接枝于粒子的表面，亲水端位于外侧，从而合成载体表面的疏水性明显降低。因此，本发明合成载体具有功能化、生物相容性较强、表面疏水性相对较弱的特点。
本发明是通过分散聚合法一步合成功能化、生物相容性较好、表面疏水性相对较弱、粒径范围1～10μm的荧光载体，本发明合成方法具有如下特点1.采用分散聚合的方法，合成方法简单，操作便利，一步便可合成目标载体；2.反应过程中不必改变实验装置或进行载体表面改性等处理；3.合成的目标产物离心分离后即可用于筛选模型的构筑和应用。
本发明对高通量筛选用载体的评估方案具有如下特点1.模型实验设计是动态的而非静态的，动态的实验设计有利于了解更真实的固定化过程；2.吸附等温线的测定可以确定靶分子固定化机制；3.经典吸附理论的应用可以从侧面了解分子可能存在的相互作用，有利于对筛选质量作初步的评估；4.外部环境影响的测试可以为外部环境对筛选质量的影响提供洞察力，有利于筛选条件的选择。
通过以上途径，本发明对载体对靶分子性质的影响、靶分子的固定化形式、靶分子间的相互作用、外部环境在高通量筛选中的角色进行了有效的囊括，并能对筛选的质量进行初步的评估。
本发明智能化数学物理模型的特点在于1.药物与靶标的相互作用的几种形式及靶分子存在的几种状态在本发明智能化模型设计时均已被考虑，具有一定系统性；2.模型的构筑是化学热力学、动力学及统计学在高通量筛选过程的具体应用，理论与实际结合，更具有实用性；3.相对于常用的经验关系式，本发明模型对经验数据的依赖性较少，可操作性强；4.首次系统地构筑了中草药筛选模型；5.模型构筑时考虑了分子间相互作用对筛选质量的影响，并能对靶分子与靶分子、靶分子与微球、体相与表面相之间存在相互作用进行描述，其智能化水平明显较同类筛选模型高；6.模型能对靶分子的固定化形式进行直接的评估，并能提供高通量筛选实验设计是否合理及是否继续的信息。
从上可以看出，由于本发明所提供的技术和材料涉及高通量筛选技术核心，原则上适用于一切筛选过程，因此本发明所提出的方法不仅适用于本文中所合成的载体和选择的蛋白，而且适用于许多类似的相关过程，尤其是动态法的提出能对固定化过程中蛋白质的性质进行在线跟踪。
附图1本发明(实施例1)由分散聚合法一步合成的醛基化荧光微球的粒度分布曲线(平均粒径9.864μm；一致性系数0.218781)。
附图2本发明(实施例2)由分散聚合法一步合成的磺基化荧光微球的粒度分布曲线(平均粒径3.130μm；一致性系数0.251607)。
附图3本发明(实施例1和2)合成荧光载体的荧光光谱(Ex./Em.＝306nm/362nm)。
附图4本发明(实施例3)高通量筛选中化学固定化对靶分子构象影响的原位UV曲线。
附图5本发明(实施例3)高通量筛选中化学固定化对靶分子活性及热稳定性影响曲线附图6本发明(实施例3)高通量筛选中固定化对靶分子时间稳定性影响曲线。
附图7本发明(实施例3)高通量筛选中pH条件对靶分子活性影响曲线。
附图8本发明(实施例4)高通量筛选中载体对靶分子性质影响原位UV曲线附图9本发明(实施例4)高通量筛选中分子间相互作用的Langmuir拟合。
附图10本发明(实施例4)高通量筛选中分子间相互作用的Freundlich拟合。
附图11本发明(实施例4)高通量筛选中分子间相互作用的Association拟合。
附图12本发明(实施例4)高通量筛选中pH条件对靶分子固定化量的影响。
附图13本发明(实施例4)高通量筛选中离子强度对靶分子固定化量的影响。
附图14本发明(实施例5)高通量筛选中配体化合物与靶分子的Langmuir模型及亲合常数的测定方法。
附图15本发明(实施例6)高通量筛选中单活性小分子化合物与靶分子的亲合作用。
附图16本发明(实施例6)高通量筛选中多组分药物及成分极为复杂药物与靶分子的亲合作用。
附图17本发明(实施例7)高通量筛选中靶分子间相互作用较强体系的Freundlich及Temkin模型。
附图18本发明(实施例7)高通量筛选中等电点附近靶分子间的Association模型。
由上可以看出，在本发明中，载体材料的合成方法、合成载体微球的基本特征如粒度大小及分布和生物相容性、生物靶分子与载体的相互作用及靶分子自身相互作用、智能化数学物理模型的建立等均获得了描述，这些构成了一个完整高通量筛选技术系统。下面将结合具体实施例对本发明作进一步详述，但不应理解为是对本发明的进一步限定，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，做出其它多种形式的修改、替换或变更所实现的技术均属于本发明的范围。
具体实施例方式
实施例1本发明高通量筛选中荧光载体的合成(一)分散聚合法一步合成的醛基化载体微球。
将8g甲基丙烯酸甲酯或苯乙烯，0.8g聚乙烯基吡咯烷酮，0.1g 2，5二苯基噁唑或DPO(2，5-diphenyloxazole)或BPOB〔1，4-Bis(5-phonyloxazol-2-yl)benzene〕，0.14g过氧化苯甲酰，80g分散介质(甲醇/水＝7/1)放入100ml反应瓶中，室温下搅拌30min使体系混合均匀。固定搅拌速率250rpm，在氮气的保护下升温至70℃，反应10h后，缓慢滴加3.2wt％丙烯醛的甲醇溶液10g。共聚14h后，离心分离后便后得目标载体(表面醛基含1.53mmol·g-1载体；Ex./Em.＝306nm/362nm)。通过以上操作，可由分散聚合法一步合成表面醛基化、粒径约10μm、单分散的荧光微球(粒度分布见附图1；荧光光谱表征见附图3)。
实施例2本发明高通量筛选中荧光载体的合成(二)分散聚合法一步合成的磺基化载体微球。
磺基化的荧光载体的合成步骤同实施例1。将功能单体替换为丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸的甲醇溶液便可。在合成中，改变单体、稳定剂、荧光试剂、引发剂的用量或调节甲醇与水的配比可用来制备不同粒径的荧光载体。通过以上操作，可由分散聚合法一步合成表面磺基化、粒径3.130μm、近单分散的荧光微球(粒度分布见附图1；荧光光谱表征见附图3)。
实施例3本发明高通量药物筛选用载体的评估(一)筛选条件下，靶分子通常以化学共价键或静电方式连接于载体材料的表面，因此须调查化学与静电连接方式对靶分子性质可能造成的影响，并初步对它们在筛选中扮演的角色进行初步的评估。本实施例选择胃蛋白酶为靶分子模板化合物，以合成的醛基化微球为载体，研究固定化对靶分子性质如活性及构象造成的影响。研究时，采用批实验的形式，一个带有搅拌装置的恒温槽内，放置数个反应管。与自由酶作对比，评价化学固定化对酶活性、稳定性及构象造成的影响，并研究它们对筛选质量可能造成的影响。
a.胃蛋白酶的化学固定化及固定化对酶构象的影响室温下，取约0.5g醛基化载体于10mL不同浓度蛋白酶(1到40mg/mL)的硼酸缓冲液中(pH＝11.5)孵育2h。吸附结束后，以3000rpm的转速离心分离。上清液以紫外分光光度计测定残余蛋白量，吸附量以总量减去残余蛋白量计算。化学固定化对靶分子构象的影响由原位紫外技术进行在线监测(附图4)。研究表明，化学固定化对靶分子构象能构成一定的影响。由于固定化使靶分子构象发生了一定的变化，所以，此时由筛选获得的化合物质量及确凿有效性需竞争实验进一步考察。
b.胃蛋白酶活性及稳定性的测定以酶催化干酪素水解生成酪氨酸为探针反应，游离酶和固定化酶活性获得评价。在37℃恒温水浴反应器内，2mL蛋白酶与5mL干酪素(1-wt％)反应5min后(pH3.0)，加入5mL三氯乙酸溶液(5-wt％)终止反应，产物经离心分离。取上清液于280nm处测定产生酪氨酸量。为测定活性随时间的变化，酶和固定化酶分别搁置一段时间，每隔三天取样测定其活性的变化。化学固定化对酶活性和稳定性的影响见附图5及6，结果表明，固定化有利于靶分子稳定性的提高，从而有利于筛选过程。
c.pH条件对蛋白酶活性的影响pH条件对蛋白酶活性的影响测定与步骤2类似，在25～60℃及pH2.2～5.0改变pH值测定蛋白酶的活性。pH条件对蛋白酶活性的影响见附图7，结果显示pH条件能对酶活性构成显著影响，从而对筛选质量构成影响。因此选择与靶分子所处的生物体环境相近的pH条件至关重要。
d.高通量筛选质量的初步评估依实验结果(附图4、5、6和7)，探讨固定化对靶分子性质，如活性、稳定性及构象产生影响的程度，决定真实筛选条件下是否有必要使用竞争实验来验证筛选所获药物的有效性。
实施例4本发明高通量药物筛选用载体的评估(二)如前所述，筛选条件下，靶分子通常以化学或静电方式连接于载体材料的表面。实施例3研究了化学偶联对筛选可能造成的影响，本实施例调查静电作用在筛选中扮演的角色。本实施例选择生物医学研究中常用的牛血清蛋白(BSA)为靶分子模板化合物，以合成的磺基化微球为载体，研究静电环境中，蛋白质与载体、蛋白质与蛋白质、表面相与体相分子间相互作用对靶分子构象及筛选质量造成的影响。操作时，与实施例一类似，采用批实验的形式，一个带有搅拌装的恒温槽内，放置数个反应管。
a.静电条件下BSA的吸附及动态中载体材料的相容性取不同浓度BSA溶液5mL与固含量约为60mg/mL磺基化载体小球3mL于37℃吸附至动态平衡。动态中，以原位紫外技术监测载体对BSA性质的影响。如前所述，蛋白质在载体材料表面的固定化是一个动态的过程。配体化合物一方面由于受到靶分子的亲合作用力与靶分子结合；而另一方面受自身热运动及频率振动的影响，趋向于逃离载体表面。当配体化合物与靶分子的结合速率与解离速率相等时，配体化合物与靶分子亲合作用达成动态平衡。因此，载体材料的生物相容性必须在动态中检测，其结果见附图8。结果显示经过若干吸附-脱附循环后，合成载体材料没有使靶分子性质如构象变化，靶分子仍然保持最初的构象。这些表明，合成载体具有良好的生物相容性。
b.吸附等温线的测定及分子间相互作用探讨BSA吸附等温线测定操作与步骤a类似，吸附结束后，以3000rpm的转速离心分离。上清液以紫外分光光度计测定残余蛋白量，吸附量以总量减去残余蛋白量计算。以经典吸附理论模型如Langmuir、Freundlich及Association等模型对实验数据进行拟合，探讨分子间作用。附图9、10结果显示，静电作用对靶分子性质构成影响；在静电条件下，靶分子间存在着明显的相互作用。如前所述，分子间相互作用能对靶分子构象及筛选质量造成的影响。因此，此时，筛选所获的潜药的有效性需进一步竞争实验室的验证。当在等电点附近进行筛选时，如附图11所示，靶分子间存在着严重的缔合现象。此时，靶分子的构象已远离生物环境中靶分子的真实构象，因此，此时获得的活性化合物并无发展为药物的潜力。
c.pH条件及离子强度的影响改变体系的pH值及离子强度(NaCl)，测定它们对吸附量的影响。附图12和13的结果显示，pH条件及离子强度对靶分子固定化量存在着显著的影响，从而对高通量筛选分析检测灵敏度构成影响。
d.静电条件下筛选质量的评估基于步骤a、b、c的实验结果(附图8～13)，研究静电条件下载体与靶分子及靶分子间相互作用对药物筛选质量可能造成的影响，探索筛选条件在高通量筛选中扮演的角色。
本发明高通量筛选中智能化数学物理模型构筑的具体实例本发明筛选用智能化构筑技术源于大量基础研究工作，用于指导筛选过程。该技术不仅构筑了高通量筛选中配体化合物与靶分子亲合作用的定量基础，而且还能对筛选质量进行初步的评估。本发明的部分智能化模块，如智能化分子间相互作用及质量初步评估系统，在前文中已结合模型实验设计进行了说明，但为了便于理解及本技术的完整性，下文一并将其列出。在生物环境中，药物与靶标的相互作用极为复杂，特异性强，宏观观测的现象通常是大量微观运动的外在表现。要想用常规的微分方程对配靶相互作用进行定量描写则极为因难，而且也得不到宏观的统计性。因此，在当今药物筛选领域，常用的做法是采用统计的手段对其进行定理处理。
实施例5智能化数学物理模型构筑(一)以高通量筛选中配体化合物与靶分子相互作用为基础，研究配体化合物与靶分子的亲合常数。在高通量筛选中，配体化合物一方面由于受到靶分子的亲合作用力与靶分子结合；而另一方面受自身热运动及频率振动的影响，趋向于逃离载体表面。当配体化合物与靶分子的结合速率与解离速率相等时，配体化合物与靶分子亲合作用达成动态平衡(附图14)。基于Langmuir理论的处理可获得Cm=1KAmm+1mmC---(1)]]>
式中m为配体对靶分子的结合量，其值可由固定化前后配体化合浓度的变化求得；C为配体化合物体相浓度(平衡浓度)；KA和mm为配靶亲合常数及靶分子对配体的最大结合量。显然，在筛选条件下，以C/m对C作图，由直线的斜率可求得配体化合物的最大结合量，而以斜率除以截距可求得配体对靶标的亲合常数KA。在高通量筛选中，由于筛选的化合物样品量大，很难用人工方法完成对大量数据的分析与处理。当将以上关系编程后，采样参数经计算机处理后便可直接给出结果。
实施例6智能化数学物理模型构筑(二)在生物体环境中，药物通过与生物大分子特定位点(靶点)结合产生药理效应。依据药物活性成分的不同，筛选条件下药物与靶标的定量模式相应分为以下三种形态a.单活性小分子化合物与靶标作用的定量处理系统(附图15)依据药物与靶标的不同作用模式，统计力学理论可给出相应的结果。对单活性小分子化合物的筛选定量处理系统，由于其活性成分仅有一种，所以处理相应简单。统计理论可直接给出结果C=n!nB!(n-nB)!×(CB0-CB)nB(CA0CB0-CB0+CB)n-nB(CA0)n-1(CB0)n---(2-0)]]>式中C为药物与靶标复合物浓度；n为总结合位点；nB为药物占据结合位点数；CA0为靶分子数；CB0及CB分别为药物初始浓度及残余浓度。因在一定实验条件下，n、nB为定值，CA0和CB0为已知。为便于说明，将常数归类后上式可简化为C＝K(ΔCB)A(m-ΔCB)B(2-1)式中，K=n!nB!(n-nB)!(CA0)n-1(CB0)n;]]>m=CA0CB0;]]>a＝nB和b＝n-nB均为定值，ΔCB=CB0-CB]]>是反应前后体系中药物浓度的变化，即细胞对药物的吸收。由于药物与靶点的键合分布为一峰形曲线，有一极值，即药物与靶点键合的最可几分布值。对上式求导可得最佳药物作用量dCdΔCB=Ka(ΔCB0)a-1(m-ΔCB)b+Kb(ΔCB)a(m-ΔCB)b-1=0---(2-2)]]>所以最佳药物作用量为ΔCB*=ama-b=nBCA0CB02nB-n---(2-3)]]>
由上式可以看出，药物的最佳作用量不仅与靶点分布密切相关，而且还与药物初始浓度密切相关。
b.多组分药物与靶标作用的定量处理系统(附图16)在高通量筛选中，多组分药物中不同活性组分可能占据靶分子相同位点，亦可能占据不同结合位点。当不同活性组分结合位点不同时，其定量与单活性化合物的筛选系统相同，各组分的定量表达同式(2-0)。当结合位点相同时，不同活性组分相互竞争结合位点。这里设C为药物与靶标复合物浓度；n为总结合位点；nB为药物占据总结合位点数；CA0为靶分子数CB0及CB分别为药物初始总浓度及残余总浓度。经统计理论处理后可得药物筛选中的定量关系式C=n!(CA0)nm-1(CB0)nm(n-nB)!Πi=1m(θinB)!Πi=1m{[θi(CB0-CB)]θinB[CA0CB0-θi(CB0-CB)]n-θinB}---(3-0)]]>θi在具体条件下是一个定值，表征组分对靶分子的亲合力差异，其值可由实验测定。在高通量筛选中，(3-0)最初只是一种经验的智能化模块。本发明通过模型的技术设计，明确给出了其具体来源。
因在一定实验条件下，n、nB、θi为定值，CA0和CB0为已知，所以上式可简化为C=KΠi=1m[(θiΔCB)ai(x-θiΔCB)bi]---(3-1)]]>式中，K=n!(n-nB)!Πi=1m(θinB)(CA0)mn-1(CB0)mn;]]>x=CA0CB0;]]>ai＝θinB和bi＝n-θinB均为定值，ΔCB=CB0-CB]]>是反应前后体系中药物浓度的变化。两边取对数lnC=lnK+Σi=1mailn(θiΔCB)+Σi=1mbiln(x-θiΔCB)---(3-2)]]>以lnC对ΔCB求导可得极值dlnCdCB=Σi=1maiΔCB-Σi=1mbiθix-θiΔCB=0---(3-3)]]>与之相对应的得最佳药物吸收量为ΔCB*=xΣi=1maiΣi=1m(ai+bi)θi=nBCA0CB0n---(3-4)]]>
从上式可以看出，在多靶点体系中，药物的吸收量不仅与靶点的分布密切相关，而且还与初始的药物用量密切相关。在高通量筛选过程中，由于筛选的化合物样品量大，用人工方法对其进行复杂的计算极为困难，当将以上关系编程后，采样参数经计算机处理后便可直接给出结果。
c.成分极为复杂药物与靶标作用的定量处理系统(附图16)中草药成为极为复杂，其大多数组分不为人们所了解，且取材地不同时组分可能不同。在与靶标作用时，它与靶标的结合与它的具体组成密切相关。当不同活性组分结合位点不同时，其定量与单活性化合物的筛选系统相同。当结合位点相同时，亲合能力强的将被靶标吸收，而亲合能力相对较弱的则不被吸收。假定在筛选条件下，某中草药中有m种组分能同靶标亲合。设筛选条件下，体系中组分与靶点的平均亲合能为 ，药物占据细胞的总靶点数为nB，不同组分的亲合能及占据的靶点数分别为E1、E2、E3、…、Ei、…、Em和n1、n2、n3、…、ni、…、nm。经统计力学处理可得ΔC=CA0nBRTexp(E‾RT)---(4)]]>式中ΔC为药物总浓度过变化；CA0及nB的物理意义同前；R为标准气体常数(8.314J/mol·K)；T为K氏温度。从上式可以看出，在中草药的筛选过程中，药物与靶点的相互作用不仅与靶标浓度密切相关，而且还与测试温度密切相关。当将不同参数输入计算机后，这类药物的吸收量取决于靶标的初始浓度。通过药物的吸收与靶标浓度的标准曲线又可推得药物对靶点的占据情况。当将以上关系编程后，采样参数经计算机处理后便可直接给出结果。
实施例7智能化数学物理模型构筑(三)在高通量筛选中，靶分子的固定化形态及分子间相互作用能对靶分子性质构成影响。高通量技术依据各种数学物理模型，如Langmuir、Freundlich、Temkin及Association模型等，能对靶分子间相互作用进行初步的判断，并给出相互作用对靶分子性质可能带来影响的相关信息。在筛选条件下，只有构象与生物体环境中真实构象相同或相似的固定化靶分子，才具有筛选合格药物的潜力。
筛选条件下，靶分子在载体表面的结合状态通常有以下三种形式a.分子间相互作用较弱体系(附图14)靶分子通过共价键或静电作用偶联于载体表面，靶分子与载体及靶分子间相互作用极弱或没有相互作用，对靶分子构象影响较小。
在当今吸附固定化理论中，Langmuir经典理论是各种理论发展的基础。大量实践证明，类似于理想气体状态方程，Langmuir理论只适用理想模型，即靶分子间相互作用极弱或无相互作用，且载体表面是均匀的情形。操作中，可按下式对吸附过程进行拟合
CQ=1KQm+1QmC]]>式中C为蛋白平衡浓度；Q与Qm分别为实际吸附量及最大吸附量；K为蛋白与载体的亲合常数。依据上式可知，在高通量筛选中，若C/Q对C图为一直线，则靶分子间没有相互作用或相互作极弱。此时，分子间相互相用对靶分子构象影响较小，所以筛选获得化合物具有发展为合格药物的潜力。
b.分子间相互作用较强体系(附图17)靶分子通过共价键或静电作偶联于载体表面，靶分子与载体或靶分子间存在着较强的相互作用，对靶分子构象有一定的影响。
尽管Freundlich及Temkin吸附理论最初仅是经验的，但后来证明它们仅适用于存在靶分子存在相互作用及靶分子与载体表面相互作用较强的情形。与Freundlich理论相比，Temkin吸附理论描述的是更强相互作用体系。在高通量筛选的实验中，可分别按下式对吸附过程进行拟合lnQ=1nlnC+lnKQm]]>(Freundlich理论定量表达式)Q＝A0lnC+A0lnf(Temkin理论定量表达式)式中C、Q及Qm的物理同上，分别为蛋白平衡浓度，实际吸附量与最大吸附量；K、A0和f为常数。显然，在高通量筛选中，若lnQ(或Q)对InC为一直线，则靶分子间存在着较强的相互作用。由于分子间相互相用能对靶分子构象构成影响，所以遵守Langmuir及Freundlich理论的体系筛选获得的化合物的有效性需进一步竞争实验的验证。
c.等电点附近筛选体系(附图18)在等电点附近，蛋白质分子几乎不带电，其空间结构处于折叠或缔合状态。如前所述，筛选所获药物的疗效取决于筛选时靶分子的结构及构象。由于等电点附近靶分子的构象已远离生物环境中靶分子的真实构象，所以此时筛选获得的化合物不具有发展为有效药物的潜力。在高通量筛选的实验中，可按下式对靶分子固定化过程进行拟合CmQ=1KQm+1QmCm]]>(弱互相作用体系)lnQ=(mn)lnC+lnKQm]]>(强互相作用体系)式中C、Q和Qm的物理同步骤1，分别为靶分子平衡浓度、实际固定化量和最大固定量；K为亲合常数；m为靶分子缔合度；n为常数。显然，在高通量筛选中，若Cm/Q对Cm图为一直线，则靶分子固定化是以缔合状态进行了。缔合状态分子构橡已不同于游离态靶分子的真实构象，此时由筛选获得的化合物基本不具备发展为合格药物的潜力。
由以上说明可看出，本发明合成载体生物相容性较强、表面疏水性相对较弱，合成方法简单，操作便利，一步便可合成目标载体。本发明评估系统应用经典吸附理论，可以从侧面了解分子可能存在的相互作用，有利于对筛选质量作初步的评估；本发明智能化模型设计时，应用了化学热力学、动力学及统计学考等理论，考虑了药物与靶标的相互作用的几种形式及靶分子存在的几种状态，具有系统性，更具有实用性。在技术层次及概括的全面性看，本发明是一种真正意义上的多学科的交叉技术，目前，在国际国内并无相同或相类似的专利或报道。
权利要求
1.一种高通量药物筛选用荧光载体，其特征在于所述荧光载体材料具有光学透明性，并在其表面通过活性氢位点，将稳定剂的疏水端接枝于载体粒子的表面，亲水端位于载体粒子的外侧。
2.根据权利要求1所述的高通量药物筛选用荧光载体，其特征在于它是由下列重量配比的原料制备而成A主单体10～12％w/w；B功能单体0.2～0.8％w/w；C稳定剂1～2％w/w；D引发剂0.1～0.2％w/w；E荧光闪烁剂0.1～0.2％w/w；F分散介质100％；其中，所述主单体A为甲基丙烯酸酯或苯乙烯；功能单体B为含有醛基或磺酸基的不饱和有机物；稳定剂C为聚乙烯基吡咯烷酮或聚乙烯醇；引发剂D为过氧化物类引发剂；荧光闪烁剂E为高度共轭的有机化合物；分散介质F为小分子一元醇或醇-水混合物。
3.根据权利要求2所述的高通量药物筛选用荧光载体，其特征在于所述主单体A为甲基丙烯酸甲酯或苯乙烯；所述功能单体B为丙烯醛或丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸；所述稳定剂C为聚乙烯吡咯烷酮；所述引发剂D为过氧化苯甲酰，所述荧光闪烁剂E为DPO或BPOB，所述分散介质F为甲醇或甲醇与水。
4.一种制备权利要求1所述的高通量药物筛选用荧光载体方法，其特征在于它包括如下步骤a.主单体、闪烁剂、稳定剂、引发剂和部分分散介质一次性加入到反应瓶中，室温下在氮气分中搅拌使体系混合均匀并排除氧气，功能单体溶于另一部分分散介质中，连接于反应器上；b.在氮气保护下搅拌，升温至60-80℃，反应8-15h；将溶于分散介质的功能单体缓慢地滴加到反应体系中，继续反应10-20h后分离、洗涤，即得最终目标载体。
5.根据权利要求4所述的制备药物筛选用荧光载体的方法，其特征在于所述原料配比为A主单体10～12％w/w；B功能单体0.2～0.8％w/w；C稳定剂1～2％w/w；D引发剂0.1～0.2％w/w；E荧光闪烁剂0.1～0.2％w/w；F分散介质100％；其中，所述主单体A为甲基丙烯酸酯或苯乙烯；功能单体B为含有醛基或磺酸基的不饱和有机物；C为聚乙烯吡咯烷酮或聚乙烯醇，引发剂D为过氧化物类引发剂；荧光闪烁剂E为高度共轭的有机化合物；分散介质F为小分子一元醇或醇-水混合物。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述A主单体为甲基丙烯酸甲酯或苯乙烯；所述B功能单体为丙烯醛或丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸；所述C稳定剂为聚乙烯吡咯烷酮；所述D引发剂为过氧化苯甲酰，所述E荧光闪烁剂为DPO〔2，5-diphenyloxazole〕或BPOB〔1，4-Bis(5-phonyloxazol-2-yl)benzene〕，所述F分散介质为甲醇或甲醇与水。
7.一种高通量药物筛选筛选质量的评估体系，它包括以下步骤(1)以共价键或静电作用的方式在载体上偶联生物靶分子，其中所述载体为权利要求1所述的荧光载体；(2)选择载体与靶分子适当的外部环境，包括pH和离子强度；(3)考查固定化对靶分子构像的影响，即考察靶分子构像是否发生变化；(4)动态条件下研究靶分子的吸附等温线，测定吸附-脱附过程中载体材料对靶分子构象的影响程度；(5)以经典理论Langmuir，Freundlich，Temkin和Association等温模型为手段，探讨靶分子间相互作用，及靶分子在表面存在的状态及分子间相互作用形式对筛选质量的影响，从而建立了本发明所述的筛选质量的评估模型。
8.根据权利要求7所述高通量药物筛的质量评估体系，其特征在于(3)所述的考察固定化对靶分子构像的影响是通过紫外光谱法、红外或核磁分析法实现。
9.根据权利要求7所述高通量药物筛选质量评估体系，其特征在于(5)所述的靶分子间相互作用包括靶分子自身、靶分子与载体、体相与表面相、表面与表面间存在的相互作用。
10.根据权利要求7所述的高通量药物筛选质量评估体系，其特征在于(5)所述的筛选质量的评估模型包括(a)Langmuir模型CQ=1KQm+1QmC]]>式中C为靶分子平衡浓度；Q与Qm分别为实际吸附量及最大吸附量；K为靶分子与载体的亲合常数；在高通量筛选中，靶分子在载体表面的吸附满足此方程时，用靶分子与载体构建的筛选模型进行筛选所获得的化合物，可直接应用于生物体环境中；(b)Freundlich模型和Temkin模型Freundlich模型lnQ=1nlnC+lnKQm]]>Temkin模型Q＝A0lnC+A0lnf在靶分子存在相互作用及靶分子与载体表面相互作用较强时适用Freundlich及Temkin模型；式中C为靶分子平衡浓度；Q与Qm分别为实际吸附量及最大吸附量；K、A0和f为常数；在高通量筛选中，满足此二方程时，筛选获得的配体化合物的有效性有待于进一步竞争实验的证实；(c)Association缔合模型等电点附近的筛选体系，靶分子结构已处于折叠状态，判别时，可按下式对吸附过程进行拟合CmQ=1KQm+1QmCm]]>(相互作用弱的体系)lnQ=(mn)lnC+lnKQm]]>(相互作用强的体系)式中C、Q和Qm的物理意义同上，分别为靶分子平衡浓度、实际固定化量和最大固定量；K为亲合常数；m为靶分子缔合度；n为常数；在高通量筛选中，若Cm/Q对Cm作图为一直线，则靶分子固定化是以缔合状态进行的；满足此方程时由筛选获得的化合物基本不具备发展为合格药物的潜力。
11.权利要求1所述荧光载体用于高通量药物筛的选智能化定量判定系统，包括①确定药物与靶分子的亲合常数KA，与计算机库中的标记配基亲合常数比较，考察是否有必要对该配体化合物继续研究；②依据筛选条件下药物与靶标的相互作用模式，建立高通量药物筛选的定量判定系统，即给出药物发挥最佳疗效的最适浓度。
12.根据权利要求11所述的高通量药物筛智能化判定系统，其特征在于步骤①确定药物与靶分子的亲合常数KA基于Langmuir理论获得Cm=1KAmm+1mmC]]>
13.根据权利要求11所述的高通量药物筛智能化判定系统，其特征在于步骤②建立的高通量药物筛选的定量判定系统包括a.单一组分小分子化合物的筛选定量判定系统ΔCB*=ama-b=nBCA0CB02nB-n]]>b.多组分药物的筛选定量判定系统ΔCB*=xΣi=1maiΣi=1m(ai+bi)θi=nBCA0CB0n]]>c.中草药的筛选定量判定系统ΔCB*=CA0nBRTexp(E‾RT)]]>其中，ΔCB*为最佳药物作用量(ΔCB=CB0-CB,]]>指反应前后体系中药物浓度的变化)，a、b、m为常数(m=CA0CB0,]]>a＝nB，b＝n-nB)，n为可结合位点数，nB为被药物分子占据的位点数，CA0和CB0分别为靶分子和药物分子的初始浓度；R为标准气体常数8.314J·mol·K-1，T为热力学绝对温度K， 为体系中组分与靶分子的平均亲合能。
全文摘要
本发明涉及一种高通量药物筛选用荧光载体及其制备方法，高通量药物筛选的定量处理系统及筛选质量的智能化判别系统。所述荧光载体材料既具有光学透明性，又具有弱的疏水性表面，适宜作为高通量药物筛选的靶点载体。其制备方法采用一步合成，简单易行。本发明中的对筛选质量的智能化判定系统，应用了化学热力学、动力学及统计学等理论，充分考虑了药物与靶标相互作用的几种形式及靶分子存在的几种状态，具有系统性，更具有实用性。
文档编号C09K11/00GK101017163SQ200510096930
公开日2007年8月15日 申请日期2005年8月26日 优先权日2005年2月6日
发明者刘白玲, 李松军, 胡杰, 汪地强, 廖险峰, 林晓琴, 张敏 申请人:中国科学院成都有机化学有限公司