专利名称：离子通道的高通量筛选的制作方法
离子通道的高通量筛选
背景技术：
离子通道是存在于每个生物体的每个细胞中的膜蛋白。该通道控制离子流入和流出细胞，从而在细胞机能中起到关键作用。毫不惊奇地是，离子通道构成一类非常重要的药物靶标。为了有效研发新药物，研究人员需要可容许通过化合物(候选药物)对离子通道的作用来进行高通量筛选化合物(候选药物)的方法和设备。该药物筛选方法和设备需要用于测量离子通道活性的装置和向离子通道施用化合物的装置。通常使用所谓的膜片钳技术研究离子通道。该技术包括测量单个细胞的电信号(电流和/或电压)。将所述细胞布置在装置中，使得电信号的大小与离子通道的状态直接相关，特别是它们允许通过的电流量。因此，该技术允许对活细胞、细胞膜和人造膜中的离子通道事件进行直接的电测量。 被广泛认可的是，膜片钳的全细胞和穿孔膜片配置提供了用于药物筛选的测量离子通道活性的最佳方法。在这些方法中，通过感应电流放大器直接且高分辨率地测量出流过离子通道的离子电流。遗憾的是，目前的膜片钳设备存在许多缺点，特别是对于高通量离子通道筛选，尤其是对于配体门控离子通道而言更是如此。
发明内容
本文中公开的一些实施方案涉及仪器、多孔板(multi-well plate)以及相关的孔设计，从而允许对离子通道和离子转运体进行高通量平行检验。多孔板的每个孔包括底部区域，所述底部区域的大小和形状被制成能够同时容纳传感电极和移液器，所述移液器用于输送例如测试化合物、洗涤液、以及任选的配体(用于配体门控离子通道检验)。所述多孔板可与具有移液器头部和电极板的仪器相连，从而提供各种优点。首先，该布置允许在通过移液器施加配体之后立刻测量电流，从而有利于分析配体门控离子通道。其次，允许相对复杂的检测方案，其中单细胞(及其相关细胞)可用于对离子通道(包括配体门控离子通道)既进行对照实验又进行检测实验。此外，某些孔设计具有特定的轮廓特征，从而有利于细胞和移液器提供的液体之间的液态接触。这改善了用缓冲液或其它洗涤液洗涤孔和细胞的操作，从而允许测试细胞顺次暴露于各种试剂或其它刺激。通常，该设计允许对单个孔中的同一细胞(或多个细胞)进行对照和检测实验。这对于配体门控离子通道而言是特别有益的。在各种实施方案中，组装的设备包括在每个孔的底部的一个或多个孔眼、孔下方的气室(plenum)、被封接至所述孔眼的具有多离子通道的细胞、在孔内位于细胞旁边的传感电极、以及细胞上方的移液器，最后是与传感电极相连的电子设备。在某些实施方案中，本发明涉及包括多个孔的多孔板，其中所述多孔板的至少一个孔具有这样的底部，所述底部的特征在于(a)细胞腔室，所述细胞腔室的大小和形状被制成能够容纳移液器吸嘴(tip)，以及(b)电极袋，所述电极袋的大小和形状被制成能够容纳传感电极。在某些情况下，细胞腔室和电极袋被布置为允许同时容纳所述移液器吸嘴和所述传感电极。另外，孔的底部可提供有位于电极袋和细胞腔室之间的液体连接部。通常，所述细胞腔室在该细胞腔室的底部表面中包括一个或多个细胞封接孔眼(cell sealingaperture)ο在各种实施方案中，所述细胞腔室包括移液器导流件，移液器导流件可具有与所述移液器吸嘴配合的形状和大小。例如，所述移液器导流件可在垂直方向上为锥形。在更具体的方案中，移液器导流件的形状和大小防止当移液器插入导流件时，从移液器吸嘴分配出的液体的大部分向上流动而流出移液器导流件。在该设计中，以及当所述孔包括位于所述细胞腔室和所述电极袋之间的液体连接部时，从移液器吸嘴分配出的液体首先流入所述细胞腔室，然后在流出而进入所述孔的上部区域之前穿过所述电极袋。在采用电极板的实施方案中(将在下文中进行更详细的描述)，移液器导流件可与电极板中的通孔大体上同轴。电极袋的尺寸可依赖于各种随应用而定的特征，包括孔的大小、多孔板中孔的数目、电极的大小、细胞腔室与电极之间期望的液体相连、等等。在具体实施方案中，电极袋在垂直方向上的高度介于约O. 2和2mm之间。在另一具体实施方案中，电极袋和细胞腔室之间的中心至中心的距离介于约I和5mm之间。 类似地，细胞腔室的尺寸可依赖于随应用而定的特征，包括针对电极袋所列出的那些特征；以及某些随移液器而定的特征，例如移液器吸嘴(例如，移液器的锥形部分)的大小和形状以及与移液器头部相关的倾斜度。在某些具体实施方案中，细胞腔室在垂直方向上的高度介于约O. 2和2mm之间。另外，细胞腔室的直径或宽度可介于约O. 5和2mm之间。在某些具体实施方案中，细胞腔室的大小和形状使得当移液器吸嘴与细胞腔室接合时，移液器吸嘴距离细胞腔室底部在约O. 5mm或更近的范围内。本发明的另一方面涉及膜片钳装置，其特征可在于(a)电极板，该电极板包括多个传感电极、以及多个相关联的通孔，该通孔的大小和位置被制成能容纳从移液器头部伸出的移液器吸嘴；以及(b)多孔板，该多孔板包括多个孔，每个孔被布置成与所述电极板的一个电极和一个通孔对准。另外，所述多孔板的至少一个孔包括大小和形状被制成能够容纳其移液器吸嘴的细胞腔室。通常，多孔板的每个孔还包括用于封接该孔中的膜片的孔眼。另外，电极板的传感电极通常被布置为在SBS柔性板的每个孔中提供一个电极，所述SB S柔性板具有96、384或1536个孔。通常，电极板包括多个触点，所述触点用于在传感电极和所连的传感和记录电子设备之间提供电连接。在各种实施方案中，所述多孔板的所述至少一个孔包括电极袋，所述电极袋的大小和形状被制成能容纳电极板的传感电极。如同上述的第一方面那样，所述细胞腔室和所述电极袋可以被布置为允许同时容纳所述移液器吸嘴和所述传感电极。另外，如上所述，所述细胞腔室可包括移液器导流件，该移液器导流件具有与伸入所述至少一个孔中的移液器吸嘴配合的形状和大小。从而，在某些实施方案中，移液器导流件可与电极板中的对应通孔大体上同轴。本发明的另一方面涉及实施膜片钳检验的方法，所述方法的特征在于以下操作(a)提供细胞，该细胞被封接至孔的底部上的孔眼；(b)将所述细胞暴露于第一溶液；(C)在所述细胞暴露于所述第一溶液的同时或之后，测量所述细胞的第一电信号；(d)从插入所述孔中的移液器向所述孔的底部输送新鲜的溶液；(e)在所述孔内升高而不移除所述移液器，并且从所述孔的上部区域将液体吸入该移液器中；以及(f)将吸入所述移液器的所述液体从所述孔中移除。在各种实施方案中，该方法还包括在(f)中移除所述液体后，将所述细胞暴露于第二溶液，并且在所述细胞暴露于所述第二溶液的同时或之后，测量该细胞的第二电信号。在各种实施方案中，所述第一电信号提供对照测量，并且所述第二电信号提供检测测量。在进一步的实施方案中，(C)中测量第一电信号是在将所述第一溶液引入所述孔中之后立刻进行的。另外，测量所述第一电信号可包括检测来自于所述孔中的传感电极的电流。上述方法的实施方案可采用上述的板和装置来实施。例如，该方法中所用的孔可具有上述的限定细胞腔室的底部结构。在进一步的实施方案中，细胞腔室的大小和形状包括上述的一种或多种特征，包括涉及移液器导流件的特征。该方法的实施方案也可任选地采用如上所述的具有电极袋的孔。在实施本文所述的方法时，如上所述的尺寸、液体连接布置和其他特征都是可用的。在另一方面，本发明涉及在配体门控离子通道上进行膜片钳检验的方法。该方法的特征可在于以下操作(a)将含有至少一个配体门控离子通道的膜片封接至检验孔的孔 眼中；(b)将配体输送至所述孔，并且测量由所述配体门控离子通道暴露于所述配体而导致的电信号；(C)从插入该孔中的移液器向该孔的底部移入新鲜的溶液，从而将膜片浸入所述新鲜的溶液中；(d)将移液器移至该孔中的不同位置，并从该孔中移除含有配体的旧溶液；(e)向所述膜片施加刺激；以及(f)将所述配体输送至所述孔中，并在施加刺激后测量由所述配体门控离子通道暴露于所述配体而导致的电信号。在多孔板的通常操作中，该方法包括在多孔板的多个孔中对多个膜片重复进行(a)中的封接膜片的操作。在各种实施方案中，(b)包括在向孔中输送配体后立刻测量电信号。另外，在(C)和(d)完成后并且在进行其它操作之前，可容许配体门控离子通道再次敏感化。通常，(a)中的刺激包括施用药学活性化合物或生物材料。可采用上述的板和装置实施所披露的LGIC检验。如同其它方法的实施方案那样，孔可具有上述的限定细胞腔室和/或电极袋的底部结构。另外，细胞腔室、电极袋和/或移液器导流件的大小和形状(包括所述的尺寸)也可以如上文所详述的那样。以下将结合附图，对本发明的这些特征和其它特征及优点进行更详细的描述。
图IA和IB为示出了平行进行多个膜片钳实验的多孔装置的示意图。图2示出了典型的配体门控离子通道的反应曲线。图3示出了用于进行所要保护的高通量膜片检验的仪器，该仪器包括移液器头部和多孔区站。图4A示出了多孔膜片钳区的分解图，其包括气室、膜片板、电极板和移液器头部。图4B为根据某些实施方案的膜片板401的顶视图。图4C至4E示出了适用于图4B所示膜片板的电极板的实施方案。图5A示出了膜片板中的单个孔的对角线横截面。图5B示出了图5A中的孔，但是移液器升高至该孔的中间高度，以从该孔的上部区域吸出溶液。图5C为具有细胞腔室和电极袋的孔的顶视图。
图6A为平行膜片钳方法的高级流程图。图6B为示出了采用电压门控离子通道实施检验的流程图。图6C为示出了采用配体门控离子通道实施检验的流程图。图6D为示出了实施孔洗涤过程的流程图。
具体实施例方式离子通道通常包括两个部分孔道(通道)以及调节所述孔道的电导的开关。离子通道是被动元件，其一旦被打开，离子便沿着当前的电化学梯度的方向流动。离子转运体的相似之处在于它们参与到运输离子穿过细胞膜的过程中，然而它们不同于离子通道之处 在于其发挥功能需要能量，并且它们倾向于对抗已建立的电化学梯度而主动泵送。为了方便起见，本文中使用术语“离子通道”既表示离子转运体，也表示离子通道。存在两种主要类型的离子通道电压门控离子通道(VGIC)和配体门控离子通道(LGIC)0 VGIC是通过改变跨细胞膜的电压而活化的，而LGIC是通过化学化合物(配体)对通道蛋白的作用而活化的。研究LGIC需要位于膜片细胞附近的细胞外液迅速地交换。以下将结合主要部件来描述研究离子通道所用的、处于操作性配置状态的仪器的例子。这些部件包括多个孔(即，不止一个孔)，每个孔具有被封接至孔眼的细胞；为所述的孔输送和移除液体的移液器；以及用于传感所述孔中的电信号的电极。在下面更具体的实施方案中，将从以下方面来描述该仪器移液器头部、包括多个孔的膜片板、分开的电极板(包括多个电极，所述电极被布置为允许在膜片板的每个孔中独立地传感)。本发明的膜片板和电极板不局限于图中所示的具体结构。美国专利No. 6，488，829和PCT公开PCT/US2005/032044中示出了所披露的实施方案的某些相关特征，通过引用的方式将其描述膜片钳仪器的内容全部并入本文。图IA示意性示出了多孔膜片钳装置的各种特征，该多孔膜片钳装置允许对多个细胞同时进行膜片钳实验。在所示装置中，示出了孔7a，以及邻近的孔7b和7c的一部分。每个孔由垂直结构元件19和底部水平结构元件20限定。底部水平元件20包括许多孔眼，包括孔7a中的孔眼9a和孔7c中的孔眼9c。在膜片钳实验中，将细胞封接至各个孔眼，所示孔眼允许与细胞内部离子耦联。在示出的例子中，细胞Ia被封接至孔眼9a，细胞Ic被封接至孔眼9c。在底部水平元件20的下方具有气室11，气室11被设计为在膜片钳实验过程中保留液体(例如细胞内液)。气室11在顶部以水平元件20为界，在底部以平行水平元件32为界，该平行水平元件32包括一个或多个电接地15的参比电极(例如参比电极13)。细胞Ia和Ic各自包括多个离子通道17，在该装置的各个孔中评价离子通道对刺激的反应。典型的膜片钳检验包括感测与流过孔中的不同细胞的电流(更具体而言为流过细胞中的离子通道的电流)相关的信号，以及使膜片接触气室。在某些实施方案中，膜片钳实验为穿孔膜片实验。在全细胞膜片钳实验的这种变型中，封接至细胞孔眼的膜片被穿孔，或是使其具有可透性，从而降低孔眼中细胞膜片的电阻。当然，该透化作用不影响离子通道的传导性，但是降低了孔眼中膜的脂质部分的电阻。可以以多种方式来诱导该膜片的电透化作用。在一些实施方案中，可通过使膜片接触穿孔剂来实现。例如，可通过向气室中的溶液提供这样的试剂来实现。合适的穿孔剂的例子包括某些亲脂性化合物或抗生素，例如两性霉素B、制霉菌素或短杆菌肽。该类化学品是通过在细胞膜中形成一价离子(例如氯离子)可透过的化学孔道而起作用的。由于氯离子是针对常用的Ag/AgCl电极的带电离子，所以这些化合物产生了通向细胞内部的低电阻电通路。在一些实施方案中，施加相对较高的电压将细胞膜穿孔并且产生类似的结果。在这样的情况下，通过施加足够强度和持续时间的电压脉冲来实现透化作用，使得孔眼内封接的膜发生物理性破裂。这通常被称为电压脉冲刺激(zapping)。应该理解，本发明不限于穿孔膜片实施方案。也可使用其它类型的膜片钳检验，例如使膜片破裂的全细胞型。在许多检验中，评价每种刺激对离子通道17的离子电流通过能力的影响。该电流被传感电极(例如孔7a中的传感电极2a，孔7b中的传感电极2b)感应到。这些电极通常为银/氯化银电极，该电极响应于检验溶液中的氯离子的可逆交换，为传感电路提供电连接。借助于参比电极13 (可为第二 Ag/AgCl电极)，使测量电路完整。尽管不是必需的，但是每个传感电极通常具有与其自己关联的传感电子元件。然而，在一些情况下，多个电极(通常在多个孔中)共用传感电子元件。如图所示，传感电子元件可包括统一由附图标记21表示的各种元件。这些元件包括高阻抗运算放大器23和数据记录系统25，其中高阻抗运算放大器23被配置为用于感测电路中的电流，数据记录系统25与放大器连接，用于记录和任选地分析来自于孔的电信号。孔眼9和细胞膜之间的高电阻封接可以使放大器记录的电流以流过细胞膜的离子为主，而不是以围绕孔眼直接流入孔溶液中的离子为主。设计或配置电压控制器27用于在孔电极2和参比电极13之间施加外部电压，从而对细胞的跨膜电压电位提供控制。如图IA所示，每个孔包括单独的移液器，例如孔7a中布置的移液器3a和孔7c中布置的移液器3c。在膜片钳实验过程中的任意给定时间，移液器可容纳适用于当前检验阶段的特定液体。在某些阶段，移液器用于向其对应的孔输送液体，而在检验的其它阶段，移液器用于从其对应的孔移除液体。在图IA中，用附图标记5表示移液器中的液体移液器3a中为5a,移液器3c中为5c。每个孔的底部包括内部结构元件，例如孔7a中示出的元件31，其用于至少部分地将所述孔的移液器部分与所述孔的电极部分分开。如下文中更详细解释的那样，这种结构可用于在孔的不同部分中限定出分离的腔室或袋。各个孔中的移液器与其相关的细胞和电极之间良好的液体交换允许在检验期间的任何时间点在给定孔中同时插入移液器和电极。该设计也有利于在研究配体门控离子通道时获取数据。图IB示出了类似于图IA所示的实施方案，不同之处在于每个孔包括多个孔眼例如孔7a中的孔眼9a、9a’和9a”。如图所示，每个孔眼被定位成能够用独立的细胞形成密封。由于该设计同时考虑到了单项刺激对平行实验中多个不同细胞的作用，所以采用该设计的实施方案被称为“群体膜片钳”或“平行膜片钳”(PPC)。在该实施方案中，单个孔支持着多个细胞，它们对信号的贡献被统一感测。该设计可以提供改善的数据，这是由于其将多个细胞的贡献加以平均，而其中任意一个细胞可能与正常细胞表现大不相同。细胞与细胞之间的差异通常很显著；各个细胞对特定刺激的反应通常会表现出极大的不同。2005年9月9日提交的美国专利申请No. 11/222，576 (也可参见PCT公开PCT/US2005/032044)提供了 PPC检验设计的更多细节，通过引用的方式将其对PPC技术的讨论部分全部并入本文中。 应当理解，本发明不限于研究细胞膜中的离子通道。相反，可供考虑的膜例如可选自以下种类中的任意一种或多种细胞、囊泡、细胞器、细胞膜碎片和合成膜，其中的任意一者包括一个或多个离子通道。在某些实施方案中，膜样品可为大体球形的。膜样品的位于隔板孔眼外的部分可大体上为原样的。应当理解，在单一一个孔中同时存在传感电极和移液器，这为检验方案提供了不同的选择，特别是对于适用于测量药物对配体门控离子通道的效果的方案来说更是如此。图2示出了典型的LGIC的反应曲线。在该图中，以相同的时间轴(横坐标)绘制出配体浓度和通过离子通道的瞬时离子电流。配体门控离子通道通常在非常短的时间段内对施加的配体作出反应，该时间段通常小于I秒。非常慢地起作用的配体门控离子通道的反应时间大约为I至2秒。在该反应达到最大值(是由电流变化最大而测定的)之后，通道变得脱敏化。配体对离子通道产生最大的影响和脱敏现象之间的时间段通常也非常短，大约为若干秒或更短。因此，为了测量与配体门控离子通道的开放或闭合相关的电流变化，电极(传感电极)和配体源应当同时都存在于孔中。注意，某些通道具有低的脱敏现象或没有脱敏现象。在一些现有设计中，在任意一个时间，传感电极和移液器中仅有一者能够被容纳于孔中。在这些设计中，电极和移液器不能一起同时地在指定孔中接触溶液。为了进行 LGIC检验，该系统首先将配体移入孔中(这时传感电极不在孔中)，只有在稍后，在移除移液器后，才向孔中插入电极。因此，该系统可能缺少有关该离子通道操作的关键的早期信息。在本发明中，电极和移液器分开并且独立地、但是同时地接触孔中的溶液。在本文所述的各种实施方案中，一个孔可同时包括电极和移液器这二者，但它们处于不同的位置。该移液器在典型LGIC检验中具有包括输送配体在内的多种功能。在所披露的设计中，传感电极可以持续监测电流并提供用于产生电流示踪的信号，同时，移液器向孔中输送立即对配体门控离子通道产生影响的配体。图3为用于进行高通量膜片钳检验的特定装置的顶视图。如图所示，不同的区站可用于为多孔板提供试剂、细胞、洗涤液等。所示装置包括装有多个移液器303的移液器头部313，该移液器头部可以在测试区315和位于该测试区两侧的其它区站之间移动，在测试区315中布置有多孔膜片板和关联的电极板317，所述其它区站包括细胞储池319、洗涤液储池321、移液器清洗站323、配体储池325、以及测试化合物或药物站327。另外，该装置可包括缓冲液站329，其中包含用于输送至孔的新鲜的细胞外液。在装有底架或桌子的平台305上提供所有这些不同的区站，在平台305的上方，移液器头部可在合适的运算逻辑的控制下水平和垂直地移动，该运算逻辑可由适当编程的计算机和/或硬编码逻辑提供。具体而言，移液器头部可为自动化的多通道移液器头部，其具有抛弃型或非抛弃型吸嘴，例如标准多通道移液器(该移液器的例子为可得自加利佛尼亚州的MolecularDevices of Sunnyvale公司的FLIPR 仪器中所用的移液器)。通常使用抛弃型的塑料或玻璃移液器。该移液装置头部(fluidics head)可被安装在X-Y-Z移动执行装置上。该执行装置以这样的方式移动该移液装置头部，该方式允许移液器与孔上方的开口排成直线、并且穿过这些开口进入安装在测试区中的膜片板的孔中。该移液装置头部优选既能从孔中吸出液体，也能向孔中分配液体。通常，本文所述的高通量实施方式采用自动化器械、数据处理和控制软件、液体处理设备和检测器。高通量筛选允许研究人员对离子通道快速进行成百上千或上百万种生物化学、遗传或药学检测。高级系统允许对高密度多孔板平行地自动施加试剂和洗涤液。
图4A示出了测试区的分解图(例如图3所示的测试区315)。该分解图示出了气室433、气室上方的膜片板401、膜片板上方的电极板411，以及最后是位于电极板411上方的移液器头部313。注意，气室433包括多个圆盘状参比电极421，例如接地并安装在气室腔413底部表面的Ag/AgCl电极。以下将更详细地分别描述该测试区的各个部件。图4B为根据某些实施方案的膜片板401的顶视图。图中示出的膜片板包括以阵列形式排列的384个分开的孔403。当然，可使用具有不同孔数的板，例如具有1536个或96个不同的孔的膜片板。通过使用具有大量孔的膜片板，可同时并行且独立地测量多个细胞的电流，这允许对施加于细胞的化合物或其它刺激进行快速地表征。通过将每个细胞(或多个细胞)放入膜片板的一个单独的孔中，使得该细胞(或多个细胞)与其它被研究的细胞分开。在某些实施方案中，膜片板的外部尺寸和形状符合SBS (生物分子筛选学会)针对多孔板制定的标准，从而有利于通过标准自动化仪器进行操作。如图4B所示，每个孔403包括位于所示孔的左下区域的细胞腔室405、以及布置在细胞腔室右边的电极袋407。下文 中将提供有关孔405的合适设计的进一步细节。在某些实施方案中，膜片板由两部分组成。其中一部分是由惰性、生物相容性且电绝缘性的塑料注射模塑而成的，所述塑料例如为聚碳酸酯、聚苯乙烯或任何其它合适的材料。该部分限定了孔的顶壁和侧壁。如下所述，其也可限定移液器和电极袋或腔室。在具体的例子中，每个孔的底部包括一个或两个相对较大的孔眼(例如直径为约O. 25至5_或约I至2mm,或在具体情况下为约I. 5mm) 这些孔眼中的一个的大小和形状应该被制成能够容纳移液器吸嘴。如果使用两个孔眼，则第二个的大小和形状应当被制成能够容纳传感电极。在某些实施方案中，电极直径为约O. 5至2mm (例如约1mm)。膜片板的第二部分为电绝缘材料薄膜，例如玻璃或塑料膜，所述塑料膜例如为聚酰亚胺膜，例如Kapton (聚(4，4’-氧联二亚苯基-均苯四甲酰亚胺))膜。其他合适的聚合物包括聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET,例如Dupont Mylar )、聚碳酸酯、聚丙烯和聚乙烯。该膜结合在模制部分的底部并覆盖该孔眼。该膜包含许多更小的孔眼，每个孔包含一个或多个。在一个实施方案中，膜片板的每个孔的底部包括单一一个通孔孔眼，该孔眼的至少一个尺寸(通常为该通孔的直径)小于细胞的尺寸(例如约I至10微米)。通常，该通孔的最小直径接近2微米。在另一实施方案中，膜片板的每个孔包括多个通孔孔眼(每个孔中，孔眼的典型数目为64个)。这是PPC配置，即图IB所示的实施方案。在某些情况下，膜片板被密封连接或以其它方式安装至气室，使得每个孔底部的孔眼将孔和气室腔连通。可由弹性垫圈和将膜片板压到垫圈上的框架(例如金属框架)来提供密封。安装电极板后，用细胞内缓冲液填充气室。在孔中装入细胞外缓冲液。如上所述，气室还包括一个或多个连接至电气零基准(例如电接地)的银/氯化银(Ag/AgCl)电极。图4C至4E示出了适用于图4B所示膜片板401的电极板的实施方案。如图4C所示，电极板411包括基板419 (例如印刷电路板基板)、电极417阵列、以及相关联的移液器通孔413阵列。对于对应的膜片板中的每个独立的孔，存在相关联的电极417、以及相关联的通孔413。因此，电极417和通孔413的大小和间隔针对膜片板而定。在具体实施方案中，电极间隔排列，从而为384孔配置的SBS柔性板的每个孔提供一个电极。在其它实施方案中，电极间隔排列，从而为类似的96孔或1536孔柔性板的每个孔提供一个电极。
将通孔413布置为允许单独的移液器进入膜片板401的每个孔。另外，在图示的例子中，通孔413相对于电极417定位，使得每个孔中同时存在一个移液器吸嘴和一个电极417。在一些实施方案中，基板419为印刷电路板(PCB)，其上附接(例如焊接)有电极阵列。在具体实施方案中，每个电极被成形为例如圆柱状，其直径大致为1mm，并且由银或某种镀银的其它金属(例如钢)制备而成。每个电极由电绝缘涂料(例如Teflon )覆盖，除了该电极的最近端部分(底部)以外，该部分在涂敷过程中通过遮掩而保持未被覆盖。电极的顶部被焊接至基板中，未被Teflon覆盖的底部(大致Imm长)用氯化银涂敷。如上所述，基板还包括移液器开口 413的阵列，每个洞与每个电极之间有一定距离(例如，大约2_)。某些适用于本发明的电极板的实施方案的例子在美国专利申请No. 11/222, 576 (也可参见PCT公开PCT/US2005/032044)中有进一步的描述，前面已经通过引用的方式将其内容并入本文中。在图4D所示的实施方案中，电极板411是具有外部区域451的较大结构的一部 分，该外部区域可以是电极阵列占据的区域之外的框架、并且包括电连接453，例如用于连接各个电极和底座中的监测控制电路的镀金垫。图4D是电极板和框架结构的底视图，其示出了通孔413和电极417。在一些情况下，电连接453是销或弹簧，例如弹簧负载的弹簧探针式电子连接器。在这种情况下，当安装在装置中时，弹簧负载的弹簧探针式电子连接器与测试区附近的平台上的触点接合，从而在放大器和/或电压控制电路(安装到装置的底座)以及电极板的传感电极之间提供电连接。在可供替代的实施方案中，弹簧探针式电子连接器被设置在仪器的底座上，并且适配垫被设置在电极板上。不管电极板上的触点的结构如何，每个触点453均通过基板上的示踪线(未示出)连接至其对应的传感电极。在所示实施方案中，该组件的外部区域451为框架(例如金属框架)的基底部分，其为所得组件提供刚性。另外，该框架可包括便于仪器夹住该电极板的特征。图4E显示出这样的框架和电极板组件461 (从上方观察)，其包括框架463，该框架又包括手柄465，从而便于手动安装和拆卸该电极板。将电极板与框架一起安装(例如夹持)到仪器上，使得电极与膜片板接合。例如，当框架和电极板组件被放置在测试表面的配合面上时，所述电极板的电极插入膜片板的相应孔中，从而在孔中的液体和电极(通常为每个孔一个电极)之间提供电连接。该框架下侧的外部区域上的触点阵列同时与底座上对应的触点对齐并形成电连接。可在配合部件上提供这些对应的触点(例如平台或底座上位于测试区两侧的区域)。如所指出的那样，所述仪器还包括电流传感放大器，优选的是，膜片板的每个孔配有一个放大器。该仪器的触点被连接至电流放大器的输入端，使得当该电极板被安装在仪器上时，该电极板的电极将每个孔中的液体与放大器输入端连接。图5A示出了膜片板401中的单个孔501的对角线横截面。它还示出了电极板，其具有布置在孔501中的相关电极417。另外，它示出了移液器503，其延伸穿过电极板411上的通孔413并进入孔501中。孔501包括开口或顶部513和底部515。靠近孔底部515有一个具有特定轮廓的区域，该区域包括细胞腔室509和电极袋511。在示出的实施方案中，细胞腔室509延伸到孔501的最底部，而电极袋511没有延伸至最底部。细胞腔室509和电极袋511在它们各自的底部附近通过液体彼此连接。
细胞腔室509以所述孔的底部片材或薄膜515作为自己的底部。在细胞腔室509内且通过底部薄膜515，存在有孔眼510，在检验期间所研究的细胞被封接至该孔眼。在平行膜片钳设计中，在细胞腔室509的底部中存在多个孔眼510。如图所示，在由相对平坦的大体水平的区域521所限定的中部架子处，细胞腔室509向着孔501的上部打开。在区域521的正下方，细胞腔室509由移液器导流件519限定，在所述实施方案中，移液器导流件是大体圆锥形或漏斗形的移液器联接特征件，其被设计成用于将移液器吸嘴505引导或定位于靠近孔眼510的位置中。通过将伸进来的移液器的吸嘴定位于细胞腔室中，移液器导流件可保证移 液器吸嘴和孔眼510上的细胞之间形成一致和直接的液体连通。通常，移液器导流件519与电极板基板中的对应开口(移液器通孔)基本上同轴。如上所述，该仪器可以包括具有多个移液器(诸如抛弃型塑料移液器)的自动化移液器头部。该移液装置头部使移液器与电极板中的开口对齐，从而允许移液器通过这些开口并进入膜片板的孔内。当使用该自动化移液装置将移液器插入孔中时，移液器导流件接住该移液器，将移液器的吸嘴对准。多通道移液器通常表现出移液器(特别是抛弃型塑料移液器)吸嘴具有某种程度的位置误差(倾斜)，这至少是由于移液器吸嘴的尺寸不精确而导致的。在移液器导流件不存在时，该倾斜会导致移液器的吸嘴口和位于不同孔内的细胞之间的距离是可变的，这会导致不期望的液体交换的可变性。移液器导流件将移液器吸嘴定位在孔中间，从而降低了该可变性。如所指出的那样，孔501的底部包括朝着该孔上部区域的两个开口，一个用作移液器导流件，而另一个用作电极袋(图5A中右侧)。细胞腔室和电极袋在该孔的最底部(膜片细胞所在的位置)促进液体交换。在某些实施方案中，移液器导流件519与移液器吸嘴505形成紧密的(或基本上紧密的)密封。这为移液器排出的液体提供了清楚限定的流动路径。具体而言，当将流体从移液器吸嘴分配到孔中时，流体流过细胞腔室509，由此直接施加于细胞。然后，该流体流入电极袋511中并离开而进入孔的上部。在膜片钳实验从一个阶段转换到下一个阶段时，这种设计便于置换孔中用过的或旧的液体。例如，当在检验过程中的对照阶段和测试阶段之间转换时，该设计允许用新鲜的不含配体的细胞外缓冲液或洗涤液置换含配体的溶液。通常，穿过移液器导流件进入细胞腔室的液体置换细胞(或多个细胞)周围的液体。从移液器输送液体至细胞腔室的过程会冲去旧的液体、以及可能还有一些过量的新液体，其流过电极袋然后流入孔的上部。因此，移液器导流件、细胞腔室和电极袋在孔中产生流动通道。液体流过该通道导致细胞(或多个细胞)附近发生高效且快速的液体交换。在某些实施方案中，细胞腔室、电极袋和它们之间的液体连接部的大小和形状限定了微流体流动通道。在各种实施方案中，移液装置头部可将液体分配到孔中和/或从膜片板的孔中吸出液体(例如，通过当使移液器在孔501内部升高时产生真空的方式)。如图5A那样，图5B也示出了孔501以及电极板电极417和移液器503。然而，在此图中，移液器503已经被升高至孔501的中部。在升高移液器503的同时或紧随其后，开启一个装置，以从孔501的上部区域抽取或以其他方式吸取一些液体，从而允许进一步清洗该检验中所考虑的细胞(或多个细胞)。在某些实施方案中，该装置为传统的液体抽吸装置，例如与移液器相联的一组移动的注射器柱塞。注意，将移液器吸嘴升高至其从该孔的顶部吸取液体的位置处，即，积累了过量的或“脏的”液体的位置处，由此在细胞腔室底部留下“干净”的液体。该升高/抽吸过程与之前的将洗涤液或新的试剂溶液输送到孔中的操作相结合时，提供了特别有效和高效的用新鲜溶液置换已用过溶液的方式。图5C是孔501的顶视图，取自与图4B的整个膜片板相似的视角。如图5C所示，孔501包括细胞腔室509和位于孔501的左下区域的孔眼510，并且还包括位于细胞腔室右上方的电极袋511。此外，如所指出的那样，细胞腔室509和电极袋511相交，并且液体连通。也就是说，从上面观察时，电极袋和细胞腔室接触或重叠。电极袋511和细胞腔室509之间的中心至中心的距离为线段561所示。在某些实施方案中，该距离在约I和4毫米之间，更具体地在约I. 5和3毫米之间，通常为约2毫米。该电极袋和细胞腔室之间的液体连接部的横截面面积可以是例如约O. I至10平方毫米，或更具体地为约I至2平方毫米。在某些具体实施方案中，该孔具有开放的上部区域，也就是说，孔的上部区域不含腔室、挡板或其它内部特征。然而，孔的下部区域具有特定的轮廓以包括某些特征，通常至少为细胞腔室。通常，该孔中具有特定轮廓的下部区域还包括电极袋、以及位于电极袋与细 胞腔室之间的液体连接部，该连接部被设置在靠近电极袋和细胞腔室的底部的位置处。虽然本文提供的附图示出了由孔的外壁所限定的形状(从上方观察时)大体为正方形，但并非必须如此。在某些实施方案中，该形状大体上为矩形、圆形、椭圆形等。总体而言，电极袋的大小和形状被制成能够容纳传感电极，并具有相对于容纳该电极所需的容积而言略有过剩的容积。在某些实施方案中，所述的袋大体上是圆筒形的形状，但也可以是多边形、椭圆形、卵形等。该形状总体上与传感电极的形状相匹配。在各种实施方案中，所述袋的高度(在垂直方向上)可以至多为约5_，通常在约I和3mm之间。在某些情况下，所述袋的主宽度或直径可在约O. 25和5mm之间，并且通常在约I和3mm之间。如上所述，细胞腔室可经由移液器导流件而向着孔的上部打开。细胞腔室的总垂直深度，包括移液器导流件(如果存在的话)在内，通常至少约为2_，在具体的实施方案中介于约O. 5和5mm之间。在典型例子中，细胞腔室的主直径或宽度在约O. 5和5mm之间，更具体地在约I和2mm之间。细胞腔室的形状可以是例如圆形、正方形、矩形、椭圆形、三角形、或其它多边形。在某些实施方案中，细胞腔室的宽度或直径由图5C中箭头563表示。除了移液器导流件之外，细胞腔室的形状和尺寸沿其纵向通常不会有明显变化。不管是否使用移液器导流件，都可以这样构建细胞腔室，使得当移液器吸嘴与所述的腔室接合时，该吸嘴与该腔室底部的孔眼之间的距离在约O. 5_或更近的范围内。这有助于用移液器排出的洗涤液或缓冲溶液清洗细胞。在某些情况下，细胞腔室占据的垂直距离在所述孔的总高度的约10%和50%之间。另外，细胞腔室占据的体积可在所述孔的总体积的约O. 5%和5%之间。在具体的例子中，细胞腔室的总体积在约500至2000纳升之间。当存在移液器导流件时，通常其具有与移液器吸嘴配合的形状和大小；即，当移液器位于最终的低位时，导流件的大小和形状使得其与移液器吸嘴周向接合。因此，导流件通常具有锥形部分，例如圆锥形或棱锥形。然而，在某些实施方案中，它也可以具有平直的形状，例如，没有逐渐变细的圆筒形或矩形。就功能而言，由于移液器导流件的形状和大小，因此在正常操作过程中，其可防止从移液器吸嘴分配出的液体的大部分向上流动而流出移液器导流件。当所述的孔在细胞腔室和电极袋之间还具有液体连接部时，位于移液器导流件中的移液器吸嘴分配出的液体首先流入细胞腔室，然后在离开并进入所述孔的上部区域之前通过电极袋。在某些实施方案中，该移液器导流件的长度在约O. I和5_之间，并且在更具体的实施方案中其长度在约I和2毫米之间。在某些设计中，移液器导流件的直径或宽度的较低范围可在约O. I和3毫米之间。更具体地，该直径或宽度可在约O. 5和2_之间。根据本发明的某些实施方案，提供了使用多孔系统进行平行膜片钳实验的各种方法和方案。这些方案中的某些对配体门控离子通道和电压门控离子通道使用不同的工艺序列。一些工艺序列允许在单个孔中对该孔所容纳的同一细胞或是细胞群既进行对照实验又进行检测实验。以下将结合图6A至6D来描述一些非限制性的工艺序列。有时，将结合膜片板或上述其它装置对这些方法进行说明。然而，应当理解，除非另外指明，否则这些方法所代表的本发明并不限于上述特定的装置。供参考，图6A示出了对如下过程的概括性高级描述，该过程将通过使用上述的任意装置或本文中未具体描述的其它装置来完成。如图6A所示，该过程开始为操作603，其中，系统向多孔板(例如本文所述的膜片板)的各个孔中弓I入缓冲液。该缓冲液可以为例如 细胞外缓冲液。可通过以下方式引入缓冲液，例如移动移液器头部(例如图3所示的移液器头部313)至缓冲液储池，将缓冲液吸入到位于移液器头部中的各个移液器中，将装有缓冲液的头部移至膜片板上方，降低移液器头部从而使各个移液器进入膜片板的孔中，最后，将所述缓冲液从各个移液器输送至膜片板的各孔中。在使用电极板或类似的具有移液器通孔的模板的实施方案中，降低移液器头部的步骤使移液器通过通孔进入孔中。一旦进入孔中，移液器可接触移液器导流件，如图5A所示的那样。在缓冲液被加入到各个孔后，该过程继续进行操作605，其中，向位于各个孔下方的气室施加吸力，以清除可能被夹带在膜片板的孔底部的孔眼边缘处的任何空气。操作605是可选的，并且在某些设备设计中可能不是必须的。在该工艺序列中的下一个步骤中，将膜片板下方的气室用其自己的缓冲液填充。参见操作607。注意，气室通常完全充满缓冲液，从而使缓冲液接触膜片板的底部表面。例如，向气室提供的缓冲液可以是细胞内缓冲液，其应该与通常在操作603中引入孔内的那类细胞外缓冲液相反。尽管不是必须，但是通常选择细胞外缓冲液的组成以模拟细胞在体内时的细胞外环境。选择细胞内缓冲液的组成以模拟细胞内部的情况。例如，细胞外缓冲液可包含钠离子、氯离子和钙离子。细胞内缓冲液可以具有类似的组成，但具有相对较高浓度的钾离子和相对较低浓度的钠离子和钙离子。在气室完全充满缓冲液后，该过程接下来包括将细胞输送到各个孔中。该操作如操作609所示，并且可以通过如下方式来进行例如，借助于移液器头部将细胞从细胞储池自动输送到各个孔中。在细胞被输送到膜片板的各个孔后，细胞被封接到它们对应的孔的底部上的孔眼。这可以通过在孔和气室之间建立压力差来完成。该操作如流程图的方框611中所述。接着，在该工艺序列中，通过合适的装置将孔眼中的细胞膜片穿孔。在某些实施方案中，这是通过采用相对较高的电压对细胞进行“电压脉冲刺激”而实现的。在其它实施方案中，如上所述，通过将穿孔化合物引入气室来实现细胞膜片的穿孔。穿孔化合物在孔眼中的膜片上引入了一定程度的穿孔。典型的穿孔化合物是亲脂性化合物，包括某些抗生素例如两性霉素。当穿孔结束时，该装置即可用于进行膜片钳检验。图6B和6C的流程图描述了使用该装置及其配置进行各种检验的细节。在图6A中，这些检验概括性地由方框615表示。在检验完成后，该过程可任选地包括丢弃所述移液器和/或膜片板，这两者都有可能被检验中所使用的特定细胞或化合物污染。参见方框617。可供选择的是，也可以将移液器洗涤并重复使用，有时候这是优选的，原因是移液器可能价格昂贵。如所指出的那样，某些操作可以通过移液器头部的自动移动来进行。因此，根据某些实施方案，图6A所示过程中的操作603、609、615和617通过自动移动或移液器来进行。在具体的实施方案中，操作603包括移液器头部313在区站329和测试区315之间的移动。参见图4A。类似地，操作609包括在区站319和315之间的移动，操作617包括在区站323和315之间的移动。操作615(在下文中将更详细地描述该操作)可以包括在缓冲液站329、化合物站325、化合物站327、洗涤站321中的两个或更多个与测试区315之间的移动。图6B为示出了当检验615采用电压门控离子通道时，执行图6A所示检验615的流程图。如图所示，图6B的过程开始于操作621，其中，仪器控制系统在传感电极和参比电极之间施加第一电压，以激活电压门控离子通道。在不施加测试化合物或待研究的其它刺激的条件下进行本实验。其目的在于获得所关注的电压门控离子通道工作时的对照读数。当仪器在操作621中施加第一电压时，该系统同时测量传感电极的电流，如操作623所示。该电流为该检验提供了对照读数的测量结果。接着，在操作624中，可任选地除去所施加的电压。此后，将测试化合物或待研究的其它刺激施加于膜片板的各个孔中。参见方框625。可以通过使用移液器头部进行的自动输送来实施该操作。在许多检验中，不同的化合物被施加到膜片板的不同孔中。在操作625中所用的化合物可被孵育一段时间，以确保在所述检验中它们的影响被细胞表现出来。无论是否提供这样的孵育期，并且如果提供的话，提供多久，该过程均继续跨电极再次施加电压，以再次引发电压门控离子通道的打开。参见方框627。该电压可以与操作621中施加的电压相同，但并非必须相同。向电极施加电压后，与该设备相联的电路再次测量传感电极的电流。此时，电流值提供检测值，可以将其与各个孔中细胞的对照值进行比较。这时，操作615 (图6A)完成，并且该过程继续进行可选的如上所述的丢弃膜片板和移液器的操作。图6C描述了执行检验615的不同方式，其中检验配体门控离子通道。如图6C所示，该检验开始于操作641，其中，对设备中的电极施加第一电压。此步骤是可选的，这是由 于大多数配体门控离子通道不是通过电压激活，而是通过配体激活的。如果施加电压，它的值可以不同于激活电压门控离子通道(例如在图6B所示的过程中)所施加的值。可选步骤641完成后，该过程继续向膜片板的各个孔中施加所需的配体。参见方框643。该操作可以用如上所述的自动移液器头部来进行。注意，膜片板中的每个孔将被施予相同的配体，因为它们中的每一个均采用具有相同配体门控离子通道的细胞。向孔中施加配体后，该设备立刻测量传感电极的电流，从而为每个孔提供对照测量值。如图6C中的方框645所示。重要的是立即测量电流，这是由于如在图2的讨论中指出的那样，配体门控离子通道对配体迅速变得脱敏化并且“关闭”，甚至在配体持续存在的情况下也是这样。注意，上述类型的装置在单个孔中同时使用移液器吸嘴和电极，因而允许立即测量电流。在操作645中进行对照测量后，该过程继续进行操作647，其中，使用缓冲液或其它洗涤液清洗膜片板的各个孔。该工艺步骤也可以通过移液器自动输送洗涤液来完成。洗涤过程的一个具体例子如图6D所示。在洗涤完成后，该过程可能包括等待规定的时间，使细胞再次敏感化，这样，接下来引入的配体将再次引发离子通道的活化。对于某些配体门控离子通道，这需要等待几分钟。在此等待的过程中或之后，该仪器向膜片板的各个孔中施加测试化合物或其它刺激。同样，所述化合物或其它刺激可以通过移液器自动输送来提供。参见方框651。通常，向膜片板的不同孔施加不同的刺激。任选地，在进行检测测量之前，将细胞用所述化合物或其它刺激孵育一段时间。当细胞可用于检测测量时，该过程继续进行操作653，其中，配体被施加到膜片板的每个孔中。如前所述，可通过各移液器的自动输送来提供配体。并且，如前所述，在配体被输送到大多数或所有的孔后，该过程继续进行的操作是立即测量传感电极的电流。参见操作655。该电流测量提供了与操作645中获得的对照数据进行比较的检测数据。在获得检测数据并且经过合适的处理(如果必要的话)之后，图6A流程图的操作615完成，并且整个过程如上所述继续进行。应当明确，药物筛选，特别是筛选对LGIC的影响，往往需要重复进行化合物添加 和洗脱的循环。按照某些实施方案，如图6D所示完成洗脱。最初，用缓冲液填充移液器(操作661)，然后将其引入孔内并定位于细胞腔室中。参见操作663。然后将该溶液分配到腔室底部，用洗涤液置换腔室中的旧液体(操作665)。过量的溶液溢流进入孔的电极袋以上的部分中。移液器可将其携带到孔中的缓冲液的大部分或全部都分配出来。在移液器清空其内容物后，移液装置头部被升高几毫米(例如约2至10_)，从而使移液器的吸嘴离开移液器导流件，并处于孔内导流件以上(参见图5B)但低于孔内液体的上部高度的位置处。参见操作667。此时，所述移液装置头部的动作相反，移液器从孔的顶部抽吸液体，从而在含有细胞膜片的腔室底部中留下干净的缓冲液。也就是说，移液器的位置允许它从孔的上部区域吸取液体到该移液器中。通常，分配缓冲液或其他溶液后约O至10秒内，将移液器吸嘴从细胞腔室中抬起。注意，在某些情况下，根本不需要等待。抽取的液体是旧液体和洗涤液的混合物。然后，将来自移液器的液体倒入废料中，任选地洗涤/置换移液器，并重复进行洗脱循环(通过移液器导流件将洗涤液分配到细胞腔室中，随后升高所述移液器，并从孔内移液器导流件以上的部分吸取混合液体)，重复的次数使得足以达到所需的洗涤程度。为了说明和描述的目的，已经提供了以上对本发明具体实施方案的描述。它们并非旨在穷举或将本发明限定到所披露的精确形式，显然，根据上述教导，许多修改和变化都是可能的。实施方案的选择和描述是为了最好地解释本发明的原理及其实际应用，从而使本领域其他技术人员能够最好地利用本发明、以及结合了适于预期特定用途的各种修改的各种实施方案。本发明的范围旨在由随附的权利要求书和它们的等价方式所限定。
权利要求
1.一种包括多个孔的多孔板，其中所述多孔板的至少一个孔包括这样的底部，所述底部包括 (a)细胞腔室，所述细胞腔室的大小和形状被制成能够容纳移液器吸嘴，以及 (b)电极袋，所述电极袋的大小和形状被制成能够容纳传感电极， 其中所述细胞腔室和所述电极袋被布置为允许同时容纳所述移液器吸嘴和所述传感电极。
2.权利要求I所述的多孔板，其中所述细胞腔室在该细胞腔室的底部表面中包括至少一个细胞封接孔眼。
3.权利要求I所述的多孔板，其中所述细胞腔室包括移液器导流件，该移液器导流件具有与所述移液器吸嘴配合的形状和大小，以免从该移液器吸嘴分配出的液体的大部分向上流动而流出所述移液器导流件。
4.权利要求3所述的多孔板，进一步包括位于所述细胞腔室和所述电极袋之间的液体连接部，由此，从所述移液器吸嘴分配出的液体首先流入该细胞腔室，然后在流出而进入所述孔的上部区域之前穿过所述电极袋。
5.一种膜片钳装置，该膜片钳装置包括 (a)电极板，该电极板包括多个传感电极以及多个相关联的通孔，该通孔的大小和位置被制成能容纳由移液器头部伸出的移液器吸嘴；以及 (b)多孔板，该多孔板包括多个孔，每个孔被布置成与所述电极板的一个电极和一个通孔对准，其中所述多孔板的至少一个孔包括大小和形状被制成能够容纳其移液器吸嘴的细胞腔室。
6.权利要求5所述的膜片钳装置，其中所述电极板包括多个触点，所述触点用于在所述传感电极和所连的传感和记录电子设备之间提供电连接。
7.权利要求5所述的膜片钳装置，其中所述多孔板的每个孔包括用于封接该孔中的膜片的孔眼，并且所述的至少一个孔还包括大小和形状被制成能够容纳一个传感电极的电极袋，以及其中所述细胞腔室和所述电极袋被布置为允许同时容纳所述移液器吸嘴和所述传感电极。
8.权利要求5所述的膜片钳装置，其中所述细胞腔室包括移液器导流件，该移液器导流件具有与伸入所述至少一个孔中的移液器吸嘴配合的形状和大小。
9.权利要求5所述的膜片钳装置，其中至少一个孔还包括电极袋、以及位于所述细胞腔室和所述电极袋之间的液体连接部，由此，从所述移液器吸嘴分配出的液体首先流入该细胞腔室，然后在流出而进入所述孔的上部区域之前穿过所述电极袋。
10.一种实施膜片钳检验的方法，所述方法包括 (a)提供细胞，该细胞被封接至孔的底部上的孔眼； (b)将所述细胞暴露于第一溶液； (c)在所述细胞暴露于所述第一溶液的同时或之后，测量所述细胞的第一电信号； (d)从插入所述孔中的移液器向所述孔的底部输送新鲜的溶液； (e)在所述孔内升高而不移除所述移液器，并且从所述孔的上部区域将液体吸入该移液器中；以及 (f)将吸入所述移液器的所述液体从所述孔中移除。
11.权利要求10所述的方法，还包括在(f)中移除所述液体后，将所述细胞暴露于第二溶液，并且在所述细胞暴露于所述第二溶液的同时或之后，测量该细胞的第二电信号，其中所述第一电信号提供对照测量，并且所述第二电信号提供检测测量。
12.权利要求10所述的方法，其中(c)中测量第一电信号是在将所述第一溶液引入所述孔中之后立刻进行的。
13.权利要求10所述的方法，其中测量所述第一电信号包括检测来自于所述孔中的传感电极的电流。
14.权利要求10所述的方法，其中所述孔包括同时容纳移液器吸嘴和传感电极的开口顶部，以及具有容纳移液器吸嘴的细胞腔室的底部，传感电极，以及具有与所述细胞腔室相连的液体连接部的电极袋，由此，在(b)过程中，所述第一溶液自所述移液器吸嘴分配出来，并且首先流入所述细胞腔室，然后在流出而进入所述孔的上部区域之前穿过所述电极袋。
15.权利要求10所述的方法，其中所述细胞腔室包括移液器导流件，该移液器导流件具有与伸入所述至少一个孔中的移液器吸嘴配合的形状和大小，并且该移液器导流件与设置在所述孔之上的电极板中的相应通孔大体上同轴。
16.权利要求10所述的方法，其中(a)进一步包括封接含有至少一个配体门控离子通道的细胞，以及将配体输送至所述孔；并且 其中(b)进一步包括测量由所述配体门控离子通道暴露于所述配体而导致的第一电信号。
17.权利要求10所述的方法，在(e)和(f)之间进一步包括向所述膜片施加刺激；以及将所述配体输送至所述孔中，并在施加所述刺激后测量由所述配体门控离子通道暴露于所述配体而导致的电信号。
18.权利要求17所述的方法，进一步包括允许所述配体门控离子通道再次敏感化。
19.权利要求17所述的方法，其中施加所述刺激包括施用药学活性化合物或生物材料。
20.权利要求17所述的方法，进一步包括在将所述配体输送至所述孔之后立刻测量所述电信号。
全文摘要
具有特定轮廓的孔设计的多孔板可容许对离子通道或离子转运体进行多阶段高通量的平行测定。多孔板的孔具有底部区域，该底部区域的大小和形状被制成能同时容纳传感电极和移液器，所述移液器用于输送例如测试化合物、洗涤液、以及任选的配体。该多孔板可与具有移液器头部和电极板的仪器相连。该布置方式有助于细胞和通过移液器提供的液体之间的液态接触。也有助于用缓冲液或其它洗涤液洗涤所述孔，从而允许待测细胞顺次暴露于各种试剂或其它刺激。通常，该设计允许对单个孔中的同一细胞(或多个细胞)进行对照和测试实验。
文档编号G01N27/26GK102884427SQ201180018243
公开日2013年1月16日 申请日期2011年4月5日 优先权日2010年4月9日
发明者尤里·弗拉基米罗维奇·奥西普丘克, 詹姆斯·理查德·瓦森, 爱德华·D·韦尔东克 申请人:分子装置有限公司