鉴定生物标记物、治疗靶点或治疗试剂的高通量筛选方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种利用包括候选分子、示踪物和对所述分子具有特异性的唯一DNA 标签的纳米颗粒筛选感兴趣的分子的方法。本发明还涉及一种利用所述纳米颗粒筛选疾病 和/或表型性状，更具体是癌症或感染的疾病标记物的方法。本发明最后涉及这样的纳米 颗粒，以及所述纳米颗粒的库。
【背景技术】
[0002] 反向遗传工程（reversegeneticengineering)试图通过分析给定基因突变的表 型结果来确定该基因的功能。该途径与传统途径"相对"（相反），其中传统途径试图鉴定 造成给定表型突变体的基因。因此，反向遗传筛选已经例如允许鉴定酵母中的细胞周期的 关键调节因子（Hartwelletal.，1974,Science, 183:46-51)，或果绳中的多细胞生物体的 发育机制的基本原理（NussleinvolhardetWieschaus, 1980,Nature, 287:795-801)。
[0003] 反向遗传筛选可以基于功能获得（利用表达载体、微小RNA(microRNA)类似物等 等进行基因的过表达），或基于由蛋白的化学抑制剂或干扰RNA(iRNA)导致的功能丧失。化 学筛选（有时被命名为化学基因组（chemogenome)途径）已经允许经由蛋白抑制来发现现 今在临床试验中测试的或者甚至已经在市场上作为药物存在的很多分子。
[0004]RNA干扰（iRNA)是在进化过程中保留下来的天然过程，根据RNA干扰，将双链RNA 引入细胞中导致mRNA同源序列的特定的降解（Fireetal.，1998,Nature391:806-811)。 而且，微小RNA(miRNA)是存在于基因组中的小的内源性非编码RNA，它特异性调节少数靶 基因的表达。存在很多其它参与基因表达调节的小的非编码RNA(piRNA、natsiRNA等）。
[0005] 总而言之，应牢记，通过化学抑制剂特异性抑制蛋白，基因的"功能丧失"性突变， 或通过内源性iRNA(miRNA)或外源性RNA(siRNA)阻抑蛋白表达是功能等效的。
[0006] 因此，iRNA特别为传统遗传学在其中难以进行的生物体（如人类体 内）提供了极其强大的反向遗传方法。从人类基因组的序列开发出靶向全部基 因的iRNA集合，允许对人类细胞系或者甚至对人类原代细胞进行反向遗传筛选 (BoutrosandAhringer, 2008,NatureReviewsGenetics9:554-566)〇 最近的几 项研究已经示出了大规模iRNA筛选在用于表征特定基因与患者对治疗的个体响应 的临床相关性中的能力。进一步地，随着最近对诸如"锁核酸（LNA)"修饰的寡核苷 酸（Orometal.，2006,Gene, 372:137-141)、抗miRNA的寡核苷酸（AMO)(Weileret al.，2〇〇6,GeneTherapy,I3:4%-5。2)和"安塔勾妙（antagomirs)"（Krutzfeldtet al.，2005,Nature, 438:685-689)等的miRNA抑制剂的开发，还可以基于miRNA的功能丧失 进行遗传筛选。此外，miRNA、piRNA等的类似物的开发还允许使用这些分子进行功能获得， 来进行功能性高通量筛选。
[0007] 迄今，很大一部分的高通量细胞筛选使用96孔或384孔的微量滴定板或芯片，其 中使用自动化显微镜或分光光度计（UV、可见光、IR)读板器读出（捕获）该96孔或384孔 的微量滴定板或芯片。
[0008] 但是，这种板或芯片途径有很多限制。首先，如芯片的板需要对候选分子（化学试 剂或核酸的集合）进行初级排序，这将在筛选和追踪该排序以在所研究的表型的来源处再 次发现这些分子的过程中使用。第二，在悬浮细胞（如血细胞）、3D培养细胞、混合细胞群、 共培养的细胞或需要营养层（滋养层）的细胞上难以进行这些筛选。第三，难以追踪已经 并入了候选分子的细胞，因为需要初级标记这些化学或遗传分子中的每一个，这种标记可 能改变它们的功效。第四，这些方式在算法水平，以及储存和保存数据时都需要复杂的图像 分析方法。第五，分析之后重获细胞非常困难或甚至是不可能的。第六，并且作为前述限制 的必然结果，板或芯片中可用的培养表面积限制了研究的表型（不超过72h)。在不能重获 细胞并将它们转移至另一培养形式中的情况下，不可能对需要更长时间的表型（诸如例如 特定细胞系中的分化）进行分析。
[0009] 为了回应这些限制中的少数几个，提出了由病毒载体携带的核条形码系统 (nucleicbarcodesystem)的应用，该应用用于在使用专用的DNA芯片下游鉴定造成所研 究的表型的核酸（Bernsetal.，2004,Nature, 428:431-7)。从那时起，已经提出了该观念 的几项开发（Verzijlbergenetal.，2011，PLoSGenet，10:el002284)。但是，这种途径自 身也具有几种限制。首先，它不能被考虑用于化学分子。第二，通过细胞机构转录和加工干 扰RNA的开发，它不能使用不是由细胞加工的其它类型的核酸（如LNA或miRNA的类似物、 piRNA的类似物等）运行。第三，它基于病毒的使用，因此需要至少L2型和理想地L3型的 实验室操作。第四，使用经条码（即DNA标签）修饰的序列具有干预干扰RNA加工的风险， 并且不确定iRNA的加工和消光效率受到这些病毒构建体系统性保护。第五，病毒感染自身 可能诱导独立于候选分子的表型改变。
[0010] 因此，需要开发可以克服这些限制的筛选方法。
[0011] 因此，发明人开发了一种无需候选分子初级排序（preliminaryordering)的途 径，该途径基于纳米颗粒的使用，与在单个细胞水平上读出表型并且与感兴趣的细胞的非 常高通量分选相关联，该纳米颗粒可以在细胞内同时"递送"候选分子，允许特异性追踪已 经并入了的候选分子的细胞的示踪物，及允许在读出表型之后通过唯一DNA标签的去卷积 后验（posteriori)鉴定出候选分子的对候选分子具有特异性的唯一DNA标签。纳米颗粒 同时递送候选分子、示踪物和DNA标签的能力尤其应归功于纳米颗粒的大小（小于1微米， 优选小于200nm)和电荷（优选正电荷），这给予纳米颗粒进入细胞的显著穿透效率。
【发明内容】
[0012] 为了这一目的，根据第一方面，本发明提供了一种筛选感兴趣的分子的方法，该方 法包括以下步骤：
[0013]a)在允许细胞整合至少一个纳米颗粒的条件下，使所述细胞与所述纳米颗粒的库 接触，每一个纳米颗粒都包括候选分子、示踪物和对所述候选分子具有特异性的唯一DNA 标签，
[0014]b)选择已经整合了所述示踪物并且具有感兴趣的表型的细胞，
[0015]c)通过鉴定所述唯一DNA标签的序列，鉴定作为感兴趣的分子的候选分子，该候 选分子已经被整合到在步骤b)选择的细胞中。
[0016] 本发明还涉及一种筛选疾病或表型性状的生物标记物的方法，该方法包括以下步 骤：
[0017]a)在允许细胞整合至少一个纳米颗粒的条件下，使所述细胞与所述纳米颗粒的库 接触，每一个纳米颗粒都包括候选分子、示踪物和对所述候选分子具有特异性的唯一DNA 标签，
[0018]b)选择已经整合了所述示踪物并且具有感兴趣的表型的细胞，
[0019]c)通过鉴定所述唯一DNA标签的序列，鉴定已经被整合到在步骤b)选择的细胞中 的候选分子，
[0020]d)鉴定作为疾病和/或表型特征的生物标记物的，在步骤c)鉴定的所述分子的靶 点。
[0021] 可选地，所述筛选感兴趣的分子的方法，或筛选疾病或表型特征的生物标记物的 方法，在步骤a)之前包括用于制备纳米颗粒库的步骤a0)，每一个纳米颗粒都包括候选分 子、示踪物和对所述候选分子具有特异性的唯一DNA标签。
[0022] 本发明还涉及包括候选分子、示踪物和对所述候选分子具有特异性的唯一DNA标 签的纳米颗粒在筛选感兴趣的分子，和/或疾病和/或表型的生物标记物中的应用。
[0023] 根据另一目标，本发明涉及一种纳米颗粒，包括候选分子、示踪物和对所述候选分 子具有特异性的唯一DNA标签。
[0024] 本发明还涉及一种纳米颗粒库，每一个所述纳米颗粒都包括候选分子、示踪物和 对所述候选分子具有特异性的唯一DNA标签。
[0025] 包括候选分子、示踪物和对所述候选分子具有特异性的唯一DNA标签的纳米颗粒
[0026] 本发明涉及一种包括候选分子、示踪物和对所述候选分子具有特异性的唯一DNA 标签的纳米颗粒。
[0027] 纳米颗粒可以是中性、阴离子或阳离子纳米颗粒。优选地，所述纳米颗粒是阳离 子纳米颗粒。纳米颗粒尤其是合成的纳米颗粒。与应用微生物或病毒的操作相比，使用合 成的纳米颗粒可以进行限制性不是非常高的操作。在特定实施方式中，所述纳米颗粒是无 机纳米颗粒，诸如例如金纳米颗粒、磁性纳米颗粒（氧化铁纳米颗粒）或半导体材料的纳米 晶体（"量子点"）。在特定实施方式中，所述纳米颗粒是有机纳米颗粒，诸如例如阳离子载 体。可以在本发明中使用的纳米颗粒的实例尤其描述在Morilleetal.，2008，Biomateri als, 29:3477-3496,Bruno, 2011,AdvancedDrugDeliveryReviews, 63:1210-1226,Zhang etal. , 2012,BioorganicChemistry, 40:10-18中。在特定实施方式中，所述纳米颗粒是混 杂纳米颗粒，即包含由聚合物层覆盖的无机核的纳米颗粒。
[0028] 在一种实施方式中，所述阳离子载体由至少一种聚合物配制。聚合物的实例是 聚乙烯亚胺（PEI)，聚（L-赖氨酸）（PLL)，聚（a- [4-氨基-丁基]-L-乙醇酸），壳聚糖， 诸如半乳糖基化壳聚糖、半乳糖基化壳聚糖-接枝-聚（乙烯吡咯烷酮）（PVP)、三甲基壳 聚糖低聚物、N-十二烷基壳聚糖、经修饰的壳聚糖脱氧胆酸，聚酰胺-胺（PAMAM)，聚（乳 酸）（PLA)，聚（乳酸-共-乙醇酸）（PLGA)，聚氰基丙烯酸烷酯（PACA)，氰基丙烯酸盐衍 生物，诸如聚氰基丙烯酸丁酯（PBCA)、聚氰基丙烯酸异丁酯（PIBCA)、聚氰基丙烯酸异己酯 (PIHCA)、聚氰基丙烯酸己酯（PHCA)或氰基丙烯酸异丁酯（IBCA)。可选地，所述载体可以进 一步包括至少一种聚乙二醇（PEG)。
[0029] 在一种实施方式中，所述阳离子载体是阳离子脂质载体，即能够经由静电效应与 带负电荷的候选分子相互作用的脂质性质的阳离子或多聚阳离子衍生物。优选地，所述阳 离子脂质载体是脂质体，或以包括连续的水相和至少一种分散相的纳米乳剂形式的制剂微 滴。
[0030] 优选地，所述脂质体包括以下物质或由以下物质组成：至少一种单价脂肪族 月旨、多价脂肪族类脂或者胆固醇的阳离子衍生物，其中所述单价脂肪族脂诸如1，2-二油 酰-3-三甲胺-丙烷（D0TAP)、N[l-(2,3-二油酰氧）丙基]-N，N，N-三甲胺（D0TMA)或 1(2-羟乙基）4，^二甲基-2,3-双（十四烷氧基-1-丙胺）（01?此）；所述多价脂肪 族类脂诸如双十八烷基酰胺基甘氨酰基精胺（DOGS);所述胆固醇的阳离子衍生物，诸如 3 0-[N-(N'，N' -二甲基-氨基乙烷）-氨甲酰]胆固醇（DC-Chol)或双-胍-tren-胆固 醇（bis-guanidium-tren-cholesterol，BGTC)。可选地，所述脂质体可以进一步包括可以 通过破坏内涵体膜的稳定来促使细胞内释放的膜融合脂质（fusogeniclipid)(-种所谓 的辅助脂质（helperlipid))，诸如二油酰磷脂酰乙醇胺（DOPE)或胆固醇。所述脂质体 可以包括如上所述的至少2、3、4、5种脂质。因此作为非限制性的实例，所述脂质体可以是 D0TMA/D0PE或D0TAP/胆固醇脂质体。可选地，所述载体可以进一步包括至少一种聚乙二醇 (PEG)。进一步包括至少一种PEG的脂质体的实例是由N，N-二油酰-N，N-二甲基氯化胺组 成、由DOPE组成和由共辄的神经酰胺组成、由PEG组成的脂质体，由以摩尔比为2:40:10:48 的3-N-[甲氧基聚（乙二醇）2。。。）氨甲酰基]-1，2-二肉显蔻酰氧基-丙胺（PEG-C-DMA)、 1，2-二亚油醇氧基-N-N-二甲基-3-氨基丙烷（DLinDMA)、1，2-二硬脂酰-sn-甘油 基-3-磷酸胆碱（DSPC)和胆固醇组成的脂质体，由0-L-精氨酰基-2, 3-L-二氨基丙 酸-N-棕榈基-N-油基-酰胺三盐酸盐、1，2-二植烷酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（DphyPE) 和PEG化的N-(羰基甲氧基聚乙二醇-2000)-1，2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸-乙醇 胺钠盐（DSPE-PEG)组成的脂质体，由氢化大豆磷脂酰胆碱、DSPE-PEG2000和D0TAP组成的 脂质体。
[0031] 优选地，包括连续的水相和至少一种分散相的纳米乳剂形式的所述制剂微滴如申 请FR12 58115中所限定的。根据这一实施方式，包括连续的水相和至少一种分散相的纳 米乳剂形式的所述制剂微滴包括：
[0032]a)至少5%摩尔的两亲性脂质，
[0033]b) 15%摩尔至70%摩尔的至少一种阳离子表面活性剂，包括：
[0034]i)至少一种选自以下基团的亲脂性基团：
[0035] 基团R或R_(C= 0)-，其中，R代表含11至23个碳原子的直链烃链，含12至24 个碳原子的脂肪酸和磷脂酰乙醇胺的酯或酰胺，以及聚（环氧丙烷），以及
[0036] ii)至少一种选自以下基团的包括至少一种阳离子基团的亲水性基团：
[0037] 含1至12个碳原子的、并且经至少一种阳离子基团间断和/或取代的直链或支链 烷基，以及
[0038] 包括至少一种阳离子基团的亲水性聚合基团，以及
[0039]c) 10%摩尔至55%摩尔的包括至少一种聚（环氧乙烷）链的助表面活性剂，该聚 (环氧乙烷）链包括至少25个乙撑氧单元，
[0040]d)包括至少一种脂肪酸甘油酯的增溶脂质，
[0041]e)可选地，膜融合脂质，
[0042] 其中，两亲性脂质、阳离子表面活性剂和助表面活性剂的摩尔百分比是相对于 (两亲性脂质/阳离子表面活性剂/助表面活性剂/可选的膜融合脂质）的集合。
[0043] 如下面所解释的，物质：两亲性脂质/阳离子表面活性剂/助表面活性剂/可选 的膜融合脂质是所述制剂微滴的冠部的主要成分。
[0044] 因此，乳剂是水包油型乳剂。它可以是简单的，或者尤其通过在分散相中包含第二 水相而是复合型的。优选，它是简单的。
[0045] 进一步地，所述制剂有利地是稳定的：它可以被储存几个小时或几个星期，且不会 观察到任何降解。
[0046] 所述制剂特别适于与带负电荷的分子（诸如例如可以调节干扰RNA内源性机制的 核苷酸序列）复合。
[0047] ?阳离子表面活性剂
[0048] 在本发明中使用的制剂包括阳离子表面活性剂，该阳离子表面活性剂包括：
[0049] a)至少一种选自以下基团的亲脂性基团：
[0050] i)基团R代表含11至23个碳原子的直链烃链，
[0051] ii)含12至24个碳原子和磷脂酰乙醇胺的酯或酰胺，诸如二硬酯酰磷脂酰乙醇胺 (DSPE)，以及
[0052]iii)聚（环氧丙烷），以及
[0053] b)至少一种选自以下基团的包括至少一种阳离子基团的亲水性基团：
[0054] i)含1至12个碳原子的、并且经至少一种阳离子基团间断和/或取代的直链或支 链烷基，以及
[0055] ii)包括至少一种阳离子基团的亲水性聚合基团，所述聚合基团尤其选自：
[0056] 典型地包括3至500个乙撑氧单元，优选20至200个乙撑氧单元，并且包括至少 一种阳离子基团的聚（环氧乙烷），
[0057] 多糖，诸如葡聚糖、纤维素或壳聚糖，尤其具有在0.5至20kDa之间，例如在1至 12kDa之间的分子量，
[0058] 聚胺，诸如壳聚糖或聚赖氨酸，尤其具有在0. 5至20kDa之间，例如在1至12kDa 之间的分子量。
[0059] "含12至24个碳原子的脂肪酸和磷脂酰乙醇胺的酯或酰胺"指以下化学式的基 团：
[0060]
[0061]其中，
[0062] 私和R4独立地代表含11至23个碳原子的直链烃链，
[0063]A#PA4代表0或NH，以及
[0064]M代表H或阳离子。
[0065] 所述阳离子表面活性剂的阳离子基团典型地是：
[0066] 选自钱、味唑鐵、吡陡鐵、吡略烧鐵、呢陡鐵、憐鐵或疏基团的络合阳尚子，或者
[0067] 单-或多-元螯合有机基团的原子团之间的金属络合物，例如与无机阳离子， 诸如Ca2+、Al3+、Ni+、Zn2+、Fe2+、Fe3+或Cu2+络合的菲咯啉（phenantroline)、吡啶、乙二 胺四乙酸（EDTA)、二乙三胺五乙酸（DTPA)、卟啉、酞菁（phtalocyanins)、氯、菌绿素 (bacteriochlorines)，
[0068]铵基，尤其为_+NMe3、_+NHMe2、_+NH2Me和_+NH3，特别是_+NH3，是特别优选的。
[0069] 当然，阴离子可以与阳离子相关联，这样制剂是电中性的。阴离子的性质不受到限 制，为例证，可以是卤化物，尤其是氯化物或溴化物，或三氟乙酸盐。
[0070] 在阳离子表面活性剂中，使亲脂性基团与包括至少一种阳离子基团的亲水性基团 结合的合基团的性质不受到限制。下面提供键合基团的实例（基团L)。
[0071] 在一种实施方式中，阳离子表面活性剂具有下式（A):
[0072][ (Lipo)「L_ (Hydro)Jn+，（n/m) [A]m (A)
[0073]其中：
[0074]I和h代表1至4之间的独立的整数，
[0075]n是大于或等于1的整数，通常在1至50之间，
[0076]Lipo代表如上限定的亲脂性基团，
[0077]Hydro代表如上限定的包括至少一种阳离子基团的亲水性基团，
[0078]L代表键合基团，
[0079]A代表阴离子，
[0080] m是代表阴离子的电荷的整数，
[0081]n是代表阳离子[(Lipo)fL-(Hydro)J的电荷的整数。
[0082] 在上述式⑷中，优选L为：
[0083]a)当I和h代表1时，L是选自如下基团的二价键合基团：
[0084]单键，
[0085]基团Z，选自-0-、-NH-、-0 (0C) -、- (C0) 0-、- (CO)NH-、-NH(C0) -、-0- (C0) -0-、-NH- (C0) (CO) -NH-和-NH- (CO) -NH、-0-P0 (0H) -0-或 5 至 6 个原子的环状二价原子团，
[0086]Aik基团，为包括1至6个碳原子的亚烷基，以及
[0087]Z-Alk、Alk-Z、Alk-Z-Alk或Z-Alk-Z基团，其中Aik和Z如上所述，并且，其中基 团Z-Alk-Z中的两个基团Z是相同或不同的，
[0088]b)当基团I或h中的一个代表1，并且另一个代表2时，L是选自如下基团的三价 基团：磷酸基团0P- (〇-) 3，衍生自甘油的式-0-CH2-CH- (0-)CH2-0-基团和5至6个原子的 环状三价原子团，
[0089] 对于I和h为其它值的，L是5至6个原子的环状多价原子团。
[0090] 更优选地，L为：
[0091]a)当I和h代表1时，L是选自如下基团的二价键合基团：
[0092]单键，
[0093] Z基团，选自-0-、-NH-、-0 (0C) -、- (CO) 0-、- (CO)NH-、-NH(CO) -、-0- (CO) -0-、-NH-(CO) -0-、-o- (CO)-NH-和-NH-(CO)-NH或-O-PO(