>[0295] 增溶脂质，
[0296] 可选的油，
[0297] 示踪物，
[0298] 化学分子，如果它是亲脂性的，
[0299] 冠包括：
[0300] 两亲性脂质，
[0301] 阳离子表面活性剂，
[0302]助表面活性剂（可选的枝接有感兴趣的分子），
[0303] 化学分子，如果它是两亲性的，
[0304]唯一DNA标签，
[0305] 可选的膜融合脂质，
[0306] 可选的式⑴的表面活性剂，
[0307] 可选的靶向生物配体。
[0308] 这些实施方式进一步具有以下额外的益处，当候选分子定位在每一个纳米颗粒的 表面处时：
[0309] 足以制备用于形成纳米颗粒的单一且相同的乳剂，然后该纳米颗粒枝接不同的候 选分子，以形成纳米颗粒的库；
[0310]当纳米颗粒是其中封装有荧光团（和/或DNA标签）的微滴时，可以限制荧光团 (和/或DNA标签）和候选分子之间相互作用的风险，后者定位在微滴的表面处。
[0311] 纳米颗粒的库
[0312] 在特定的实施方式中，纳米颗粒的库包括至少2、10、50、100、250、500、1000、2500、 5000、7500、10,000、12,500、15,000、20,000、30,000、50,000、75,000、100,000 或更多个 如上限定的纳米颗粒，或由至少 2、10、50、100、250、500、1000、2500、5000、7500、10,000、 12, 500、15, 000、20, 000、30, 000、50, 000、75, 000、100, 000 或更多个如上限定的纳米颗粒组 成。在特定的实施方式中，所述库包括数量在2个至100, 000个之间，优选500个至50, 000 个，仍然优选在1000个至15, 000个之间的纳米颗粒，或由数量在2个至100, 000个之间， 优选500个至50, 000个，仍然优选在1000个至15, 000个之间的纳米颗粒组成。
[0313] 在特定的实施方式中，所述库包括一定数量的纳米颗粒或由一定数量的纳米颗粒 组成，所述的一定数量至少等于在市场上可买到的分子集合中存在的候选分子的数量，或 至少等于功能相关的候选分子（例如具有相同靶点的候选分子，例如同一类酶、同一代谢 途径或同一基因的抑制剂，功能相关的候选分子对代谢途径或信号传导途径具有相同的作 用机制）的数量，即存在每一类型的纳米颗粒的至少一个拷贝，该类型通过候选分子、示踪 物和唯一DNA标签的组合来限定。
[0314] 在特定的实施方式中，所述纳米颗粒的库包括至少1、2、10、50、100、250、500、 1000、2500、5000、7500、10, 000、20, 000、50, 000、75, 000、100, 000 种类型的纳米颗粒，或由 1、2、10、50、100、250、500、1000、2500、5000、7500、10, 000、20, 000、50, 000、75, 000、100, 000 种类型的纳米颗粒组成，每一类型的纳米颗粒以至少等于10、50、100、500、1000、2000、 5000、7500、10, 000、15, 000、20, 000个纳米颗粒的拷贝数量存在。
[0315]候选分子的集合的非限制性实例尤其可以是来自Qiagen的革巴向646种激酶的 1292 种siRNA的集合（HumanKinasesiRNAsetVI. 0 ;Ref. 1027091)，或来自Qiagen的 靶向参与癌症的1183种基因的2375种siRNA的集合（HumanCancersiRNAsetV2.0)， 或革巴向参与癌症的139种基因的278种siRNA的集合（HumanCancersiRNAsetVI. 0 ;Ref. 1022171)，或来自Qiagen的靶向22, 950种人类基因的91，800种siRNA的集合（Human GenomeWidesiRNAset)，或来自Exiqon的革El向所有已知人类miRNA的982种LNA的集合 (miRCURYLNAHumanmicroRNAInhibitorLibrary；Ref.190102-2)〇
[0316] 作为非限制性实例，所述纳米颗粒的库包括1292种纳米颗粒或由1292种纳米颗 粒组成，每一种纳米颗粒都包括来自Qiagen的革E1向646种激酶的1292种siRNA的集合中 的一种siRNA、示踪物和对所述siRNA具有特异性的唯一DNA标签；或，所述纳米颗粒的库 包括2375种纳米颗粒或由2375种纳米颗粒组成，每一种纳米颗粒都包括来自Qiagen的革巴 向参与癌症的1183种基因的2375种siRNA的集合中的一种siRNA、示踪物和对所述siRNA 具有特异性的唯一DNA标签；或，所述纳米颗粒的库包括278种纳米颗粒或由278种纳米颗 粒组成，每一种纳米颗粒都包括靶向参与癌症的139种基因的278种siRNA的集合中的一 种siRNA、示踪物和对所述siRNA具有特异性的唯一DNA标签；或，所述纳米颗粒的库包括 91，800种纳米颗粒或由91，800种纳米颗粒组成，每一种纳米颗粒都包括来自Qiagen的革巴 向22, 950种人类基因的91，800种siRNA的集合中的一种siRNA、示踪物和对所述siRNA具 有特异性的唯一DNA标签；或，所述纳米颗粒的库包括982种纳米颗粒或由982种纳米颗粒 组成，每一种纳米颗粒都包括来自Exiqon的靶向所有已知人类miRNA的982种LNA的集合 中的一种LNA、示踪物和对所述LNA具有特异性的唯一DNA标签。
[0317] 所述纳米颗粒的库还可以包括至少1、2、3、4、5、10、15、20、50、100、500、1000、 2500、5000 个纳米颗粒族或由至少 1、2、3、4、5、10、15、20、50、100、500、1000、2500、5000 个 纳米颗粒族组成，每一族都包括至少2、3、4、5、10、15、20、25、50、100、200种类型的包括相 同示踪物和功能相关的候选分子（例如具有相同靶点的候选分子，例如同一类酶、同一代 谢途径或同一基因的抑制剂，功能相关的候选分子对代谢途径或信号传导途径具有相同的 作用机制）或存在于市场上可买到的分子的集合中，诸如例如上面提到的集合中的一种的 候选分子的纳米颗粒。
[0318] 例如，所述纳米颗粒的库可以包括两个纳米颗粒族或由两个纳米颗粒族组成，第 一纳米颗粒族包括1292种类型的纳米颗粒或由1292种类型的纳米颗粒组成，每一类型的 纳米颗粒都包括来自Qiagen的靶向646种激酶的1292种siRNA的集合中的一种siRNA、示 踪物和对所述siRNA具有特异性的唯一DNA标签；并且，第二纳米颗粒族包括2375种类型 的纳米颗粒，每一种类型的纳米颗粒都包括来自Qiagen的靶向参与癌症的1183种基因的 2375种siRNA的集合中的一种siRNA、示踪物和对所述siRNA具有特异性的唯一DNA标签， 应理解的是，第一纳米颗粒族和第二纳米颗粒族的示踪物是不同的。
[0319] 根据另一实例，所述纳米颗粒的库包括五个纳米颗粒族或由五个纳米颗粒族组 成，第一纳米颗粒族包括1292种类型的纳米颗粒或由1292种类型的纳米颗粒组成，每一 种类型的纳米颗粒都包括来自Qiagen的靶向646种激酶的1292种siRNA的集合中的一 种siRNA、示踪物和对所述siRNA具有特异性的唯一DNA标签；第二纳米颗粒族包括2375 种类型的纳米颗粒或由2375种类型的纳米颗粒组成，每一种类型的纳米颗粒都包括来自 Qiagen的靶向参与癌症的1183种基因的2375种siRNA的集合中的一种siRNA、示踪物和 对所述siRNA具有特异性的唯一DNA标签；第三纳米颗粒族包括278种类型的纳米颗粒或 由278种类型的纳米颗粒组成，每一种类型的纳米颗粒都包括来自Qiagen的靶向参与癌症 的139种基因的278种siRNA的集合中的一种siRNA、示踪物和对所述siRNA具有特异性的 唯一DNA标签；第四纳米颗粒族包括91，800种类型的纳米颗粒或由91，800种类型的纳米 颗粒组成，每一种类型的纳米颗粒都包括来自Qiagen的靶向22, 950种人类基因的91，800 种siRNA的集合中的一种siRNA、示踪物和对所述siRNA具有特异性的唯一DNA标签；第五 纳米颗粒族包括982种类型的纳米颗粒或由982种类型的纳米颗粒组成，每一种类型的纳 米颗粒都包括来自Exiqon的靶向所有已知人类miRNA的982种LNA的集合中的一种LNA、 示踪物和对所述LNA具有特异性的唯一DNA标签，应理解的是，第一纳米颗粒族、第二纳米 颗粒族、第三纳米颗粒族、第四纳米颗粒族和第五纳米颗粒族的示踪物是不同的。
[0320] 细胞
[0321] 在根据本发明的筛选方法中使用的细胞可以是真核细胞或原核细胞。细胞可以是 原代细胞或永生化细胞。可以在本发明中使用的真核细胞的实例是哺乳动物细胞（优选 人类细胞），或植物细胞。哺乳动物细胞例如可以是淋巴细胞，胚胎细胞，胎儿细胞，上皮细 胞，骨髓细胞，肿瘤细胞，成人或胚胎干细胞，被病毒、细菌、真菌或寄生虫感染的细胞。优选 地，所述细胞是人类细胞，包括来自健康供体的那些细胞。仍然优选地，所述细胞是肿瘤细 胞或被病毒感染的细胞。所述肿瘤细胞可以起源于处于各发展阶段的肿瘤和/或对抗癌疗 法具有不同敏感性的肿瘤。作为非限制性实例，肿瘤细胞可以是来自乳腺癌，前列腺癌，脑 癌（神经母细胞瘤、星形细胞瘤、少突神经胶质瘤），肾癌，肝癌（肝细胞癌），胰腺癌，肾上 腺癌，结肠癌，结肠直肠癌，卵巢癌，睾丸癌，子宫癌，肺癌，上皮癌（carcinoma)，肉瘤，淋巴 瘤，骨髓瘤，造血癌，白血病，黑素瘤的细胞。
[0322] 植物细胞可以是来自单子叶植物或双子叶植物的细胞。例如，植物细胞可以起源 于叶子、茎、根、胚、芽的细胞。
[0323] 在根据本发明的筛选方法中使用的细胞可以是在二维培养或在三维培养中的悬 浮细胞、贴壁细胞。
[0324] 纳米颗粒的库的制备
[0325] 步骤a0)可以根据如下步骤进行：（i)制备和合成包括连续的水相和至少一种分 散相的纳米乳剂形式的制剂，（ii)封装或复合示踪物，（iii)复合DNA标签，（iv)封装或复 合候选分子。步骤（i)至（iv)尤其可以根据分别在实施例1的段落1. 1、1. 5、1. 4和1. 2 中描述的方法进行。
[0326] 使细胞与纳米颗粒的库接触
[0327] 将细胞与如上所述的纳米颗粒的库接触的目的是允许至少一种纳米颗粒被整合 到细胞中。它可以通过本领域技术人员已知的方法进行。它还基于如下事实：细胞与纳米 颗粒的库接触而无需对候选分子进行任何初步排序。因此，细胞例如被培养在适当的培养 基中，然后使用纳米颗粒的库，例如以1/1 (1个纳米颗粒/I个细胞）的比率进行共转染。根 据另一实例，库的每一个纳米颗粒都沉积在例如在培养板的孔中的支撑物上，并且细胞被 添加到所述支撑物上。
[0328] 优选地，所述接触由使用如上所述的纳米颗粒的库转染细胞的步骤组成。
[0329] 使细胞与纳米颗粒的库接触的步骤a)例如可以进行至少30min、lh、2h、3h、4h、 5h、6h、7h、8h、9h、10h、12h、18h、24h、36h、48h、3d、4d、5d、6d、7d、8d、9d或 10d，和 / 或至多 10d、9d、8d、7d、6d、5d、4d、3d、48h、36h、24h、18h、12h、10h、8h、7h、6h、5h、4h、3h、2h、lh或 30min〇
[0330] 使细胞与纳米颗粒的库接触的步骤a)例如可以在至少20、21、22、23、24、25、26、 27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39 或 4(TC，和 / 或至多 40、39、38、37、36、35、34、 33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21 或 20°C的温度下进行。
[0331] 在一种实施方式中，当细胞是贴壁细胞时，步骤a)之后进行细胞的胰蛋白酶消化 或刮取的步骤。
[0332] 细胞的选择
[0333] 在根据本发明的方法中，根据如下两种标准选择细胞：（i)如上所述的示踪物的 整合，和（ii)感兴趣的表型的显现。
[0334] 鉴定已经整合了示踪物的细胞可以利用本领域技术人员已知的方法进行。
[0335] 在一种实施方式中，当所述示踪物是磁性示踪物时，选择已经整合了所述磁性示 踪物的细胞通过磁性细胞分选（用于"磁性活化细胞分选"macs? )进行。
[0336] 在一种实施方式中，当所述示踪物是荧光团时，选择已经整合了所述荧光团的细 胞通过流式细胞术进行。
[0337] 鉴定具有感兴趣的表型的细胞可以利用本领域技术人员已知的方法进行。优选 地，鉴定具有感兴趣的表型的细胞通过流式细胞术进行。
[0338] 在一种实施方式中，鉴定已经整合了示踪物的细胞在鉴定具有感兴趣的表型的细 胞之前进行。在另一种实施方式中，鉴定已经整合了示踪物的细胞和鉴定具有感兴趣的表 型的细胞同时进行。
[0339] 感兴趣的表型的非限制性实例尤其是凋亡，细胞增殖，分化，癌症标记物的表达 (诸如例如前列腺特异性抗原（PSA)的表达），对治疗试剂（例如化疗剂）的抗性或敏感性， 对感染性试剂（优选对病毒）的抗性或敏感性，对环境压力的抗性或敏感性（诸如例如对 干旱或昆虫的抗性或敏感性）。
[0340] 可不需任何初始标记，或使用荧光报告基因进行标记或在使用荧光抗体进行标记 之后进一步进行其它标记的情况下，对感兴趣的表型进行研究。细胞增殖的鉴定尤其可以 通过使用碘化丙啶、EdU或赫斯特（Hoechst) 33342进行标记来实现。细胞凋亡的鉴定尤其 可以通过膜联蛋白（Annexine)V-FITC标记或所谓的TUNEL( "末端脱氧核苷酸转移酶介导 的dUTP缺口末端标记"）标记或通过半胱天冬酶（caspase)活化分析来实现。
[0341] 候选物/感兴趣的分子的鉴定
[0342] 在根据本发明的方法中，通过鉴定唯一DNA标签序列，实现在步骤c)中鉴定已经 在步骤b)中整合的候选分子。事实上，因为每一种候选分子都与唯一DNA标签相关联，因 此通过鉴定所述唯一DNA标签，可以确定哪一种候选分子被整合到细胞中。
[0343] 在如下步骤之后实现DNA标签的鉴定：⑴从在步骤b)中选择的细胞提取DNA; (ii)使用与如上所述的所述唯一DNA标签的至少20个核苷酸的第一和第二序列互补的通 用引物，扩增在步骤（i)中提取的DNA，并且对扩增的DNA进行测序；或（iib)对在步骤（i) 中提取的DNA进行测序。
[0344]DNA提取步骤⑴可以使用本领域技术人员已知的方法实现。
[0345] 在步骤（ii)中，扩增可以通过使用聚合酶链反应的传统技术（PCR)实现。
[0346] 在特定的实施方式中，步骤（ii)中的扩增包括初始变性步骤，然后为变性-杂 交-延长循环和最终的延伸步骤。
[0347] 初始变性步骤可以在90°C至105°C，优选92°C至102°C，仍然优选95°C至100°C范 围内的温度条件下保持15s至15min来实现。优选地，初始变性步骤进行lmin至15min，仍 然优选2min至12min，仍然优选5min至lOmin。
[0348] 每一个变性-杂交-延长循环都包括在加热条件下的变性阶段，然后在允许引物 与要扩增的唯一DNA标签杂交的条件下产生引物杂交的阶段，以及在允许聚合酶从已经与 要扩增的DNA标签杂交的每一引物合成延伸产物的条件下产生的延长阶段。
[0349] 变性阶段可以在90°C至105°C，优选92°C至100°C，仍然优选94°C至98°C之间保 持10s至4min，优选保持10s至2min，仍然优选保持15s至lmin来实现。
[0350] 杂交阶段，即引物的杂交阶段可以在35°C至70°C，优选40°C至65°C，仍然优选 45°C至60°C之间保持10s至2min，优选保持20s至1. 5min，仍然优选保持25sec至45sec 来实现。
[0351]延长阶段可以在40°C至80°C，优选50°C至75°C，仍然优选60°C至72°C之间保持 10s至5min，优选保持20s至3min，仍然优选保持25s至lmin来实现。
[0352] 变性-杂交-延长步骤可以重复30至60个循环，优选重复35至45个循环。
[0353]最终延伸阶段可以在40 °C至80°C，优选50 °C至75°C，仍然优选60 °C至72 °C之间 保持lmin至lOmin，优选保持3min至8min，仍然优选保持4min至6min来实现。
[0354] 步骤（ii)和（iib)中的测序可以通过使用传统的测序技术进行。
[0355] 优选地，测序步骤（iib)在第三代测序仪上进行，该第三代测序仪允许例如通过 使用PacificBkm丨encc?法、i〇n丨orrcrtl3財去、Oxford加加:poreC?法，所谓的"optipore"法 (NoblegenBioSciences)，对单一的DNA分子进行测序。因此，步骤（ii)和（iib)中的测 序能够鉴定每一个DNA标签的至少10个核苷酸的单一序列。
[0356] 候选分子的个体筛选
[0357] 在根据本发明的筛选方法中，细胞可能整合几种纳米颗粒，这导致在步骤c)中要 鉴定几种造成感兴趣的表型的候选分子。因此，为了确保所有鉴定的候选分子都真正造成 感兴趣的表型，根据本发明的筛选方法可以在步骤c)之后，进一步包括对在步骤c)中鉴定 的候选分子进行个体筛选的步骤。
[0358] 该个体筛选的步骤通过实现步骤a)至c)的第二循环来进行，应理解的是，步骤a) 中的细胞的接触使用包括示踪物、荧光团和在步骤c)中鉴定的候选分子的纳米颗粒来实 现。
[0359] 在药物组合物中的制剂
[0360] 在步骤c)之后或在个体筛选步骤之后（当存在后者时），根据本发明的用于感兴 趣的分子的筛选方法可以进一步包括一个或几个由将所述感兴趣的分子配制在具有药学 上可接受的载体的药物组合物中所组成的额外步骤。
[0361] "药学上可接受的载体"指适于与人类或动物细胞接触使用的载体，且不引起毒 性、刺激或过度的过敏反应。药学上可接受的载体的非限制性实例尤其包括生理溶液或脂 质体、微粒、微胶囊或基于脂质的运输系统。脂质体、微粒、微胶囊或基于脂质的运输系统是 特别适于与核酸配制的药学上可接受的载体。
[0362] 疾病/表型特征
[0363] 在特定的实施方式中，疾病是癌症、感染或心血管疾病。
[0364] 优选地，癌症选自乳腺癌，前列腺癌，脑癌（神经母细胞瘤、星形细胞瘤、少突神经 胶质瘤），肾癌、肝癌（肝细胞癌），胰腺癌，肾上腺癌，结肠癌，结肠直肠癌，卵巢癌，睾丸癌， 子宫癌，肺癌，上皮癌，肉瘤，淋巴瘤，骨髓瘤，造血癌，白血病，或黑素瘤。优选地，疾病是前 列腺癌。
[0365] 优选地，感染选自细菌感染、寄生虫感染或病毒感染。优选地，感染是病毒感染。
[0366] 心血管疾病选自高血压、急性冠脉综合征、动脉粥样硬化、血管钙化或脑血管中 风。
[0367] 术语"表型特征"指由生物体的基因组与环境相互作用造成的所述生物体的外表 或另一特征。在特定的实施方式中，表型特征选自凋亡，细胞增殖，对治疗试剂（例如化疗 剂）的抗性或敏感性，对感染性试剂（优选对病毒）的抗性或敏感性，对环境压力（诸如例 如对干旱、寒冷、霜冻、高温）的抗性或敏感性，对昆虫的抗性或敏感性，对除草剂的抗性或 敏感性，产量，大小。
[0368] 疾病或表型特征的生物标记物的鉴定
[0369] 在根据本发明的用于疾病或表型特征的生物标记物的筛选方法中，疾病或表型特 征的生物标记物在步骤d)中的鉴定通过鉴定在步骤c)中鉴定的候选分子的靶点来实现。
[0370] "靶点"指其表达受到候选分子的调节的基因、RNA或蛋白。
[0371]