三羧酸(tca)中间体用于控制细胞培养中的氨产生的用图
【专利说明】三羧酸（TCA)中间体用于控制细胞培养中的氨产生的用途 发明领域
[0001] 本发明涉及细胞培养基领域和培养工程改造成表达治疗性蛋白的哺乳动物细胞 的方法。
[0002] 发明背景 三羧酸（TCA)循环被视作细胞产生能量的必需途径。该途径是从燃料分子得到能量的 最终共同途径。将糖、氨基酸和脂肪酸氧化以得到ATP形式的能量。
[0003] 与此同时，TCA给细胞供应基本结构单元以在细胞中产生其它分子。在细胞生长 和分裂过程中和在蛋白合成过程中，可以从TCA循环的几个点抽离脂肪酸、氨基酸、嘌呤、 嘧啶以及其它物质的中间体。
[0004]在没有足够中间体来补充TCA循环的情况下，细胞可以使用氨基酸来补充那些中 间体。那些氨基酸向中间体的转化需要脱酰胺化作为第一步，铵离子（NH4+)是氨基酸向TCA 中间体的转化的副产物。取决于细胞对中间体的要求，铵离子可以在培养基中积累至有害 效应。那些铵离子当以抑制浓度存在时可以影响抗体糖基化模式、细胞生产力和细胞生长。
[0005]为了避免有害水平的铵离子浓度，目前，将具有抑制水平的氨的水性细胞生长培 养基简单地抛弃和用新鲜培养基替换。这是无效的，因为它需要额外设备进行新鲜培养基 的灭菌和贮存以及对新鲜培养基中的昂贵血清的伴随替换。因此，需要从哺乳动物细胞培 养物除去氨和铵离子的方法，其免除了培养基的替换，且其可以与已知的多种现有细胞系 一起使用。
[0006] 发明概述 在一个方面，本发明涉及减少哺乳动物细胞培养物中的铵离子浓度的方法，所述方法 包括以下步骤： 在细胞培养基中培养所述细胞，和 给所述细胞培养基施用有效量的三羧酸（"TCA)中间体组合物或与其接触。
[0007]在另一个方面，本发明涉及维持或增加哺乳动物细胞培养物中的细胞生产力的方 法，其中所述铵离子产生减少，所述方法包括以下步骤： 在细胞培养基中培养所述细胞，和 给所述细胞培养基施用有效量的TCA中间体组合物或与其接触。
[0008]在另一个方面，本发明涉及维持或增加哺乳动物细胞培养物中的细胞生长的方 法，其中铵离子产生减少，所述方法包括以下步骤： 在细胞培养基中培养所述细胞，和 给所述细胞培养基施用有效量的TCA中间体组合物或与其接触。
[0009]在另一个方面，本发明涉及减少细胞培养物中铵离子积累对抗体糖基化模式的影 响的方法，其中铵离子产生减少，所述方法包括以下步骤： 在细胞培养基中培养所述细胞，和 给所述细胞培养基施用有效量的TCA中间体组合物或与其接触。
[0010] 在另一个方面，本发明涉及包含TCA中间体组合物的细胞培养基。
[0011] 附图简述 图1描绘了TCA循环中间体的剂量应答研究的实验设计。
[0012] 图2描绘了TCA循环中间体相互作用研究的区组# 1的实验设计。
[0013] 图3描绘了TCA循环中间体相互作用研究的区组# 2的实验设计。
[0014] 图4描绘了多种条件的活细胞浓度，线显示了一式两份摇瓶的平均值。
[0015] 图5描绘了摇瓶研究中的乳酸盐积累。线显示了一式两份条件的平均值。
[0016] 图6描绘了测试的所有条件的铵积累。线显示了测试的每种条件的一式两份摇瓶 的平均值。
[0017] 图7描绘了向培养物添加a-酮戊二酸盐和草酰乙酸的铵积累。线显示了测试的 每种条件的一式两份摇瓶的平均值。
[0018] 图8描绘了用不同水平的TCA中间体处理过的培养物的细胞比生产率。误差棒显 示了值范围。
[0019] 图9描绘了在D0E的区组1和区组2中测试的所有条件的活细胞浓度。
[0020] 图10描绘了在D0E的区组1和区组2中测试的所有条件的氨积累特性。
[0021] 图11描绘了在D0E的区组1和区组2中测试的所有条件的最大氨积累。
[0022] 图12描绘了在D0E的区组1和区组2中测试的所有条件的最终细胞比生产率。
[0023] 图12a、12b和12c描绘了与对照培养物相比的丙酮酸盐剂量应答。NH4+的浓度依 赖于剂量，但是效应仅持续几天。一旦丙酮酸盐耗尽，NH4+产生继续（图12b)。图的次序 显示了（a)活细胞浓度，（b)随培养时间变化的NH4+积累，和（c)细胞特异性的NH4+产生。 在图（c)中，曲线的斜率指示细胞特异性的产生或消耗速率。
[0024] 图13a、13b和13c描绘了与对照培养物相比a-酮戊二酸盐剂量应答。
[0025] 图14a、14b和14c描绘了与对照培养物相比苹果酸盐剂量应答。
[0026] 图15a、15b和15c描绘了与对照培养物相比的草酰乙酸盐剂量应答。
[0027] 图16a、16b和16c描绘了与对照培养物相比的富马酸盐剂量应答。
[0028] 图17描绘了与对照培养物相比的柠檬酸盐剂量应答。
[0029] 图18a、18b和18c描绘了与对照培养物相比的苹果酸盐、丙酮酸盐、a-酮戊二酸 盐、富马酸盐和草酰乙酸盐剂量应答。
[0030] 图19a、19b和19c描绘了向培养物中添加两种TCA中间体的影响。
[0031] 图20a、20b和20c描绘了向培养物中添加3种TCA中间体的影响。
[0032] 图21-24描绘了添加一种TCA中间体（图21和22)、两种TCA中间体（图23)和 三种TCA中间体（图24)的组合的平均细胞比生产率。
[0033] 发明详述 除非另外定义，否则在本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普 通技术人员通常所理解的相同的含义。与本文描述的那些类似或等同的任何方法和材料可 以用于实践本发明的测试。在描述和要求保护本发明时，将使用以下术语。
[0034] 应当理解，本发明不限于特别的方法、试剂、化合物、组合物或生物系统，其当然可 以变化。还应该理解，本文中使用的术语仅用于描述特别的实施方案的目的，且无意进行限 制。在本说明书和所附权利要求中使用的单数形式"一个（a、an)"和"所述"包括复数指示 物，除非上下文另外清楚地指示。因此，例如，对"糖"的提及包括两种或更多种糖的组合等。
[0035] 当提及可测量的值诸如量、持续时间等时，本文中使用的"约"意在包括从指定的 值变化±20%或± 10%(包括±5%、± 1%和±0. 1%)，因为这样的变化适于执行所公开的方 法。
[0036]在一个方面，本发明涉及减少哺乳动物细胞培养物中的铵离子浓度的方法，所述 方法包括以下步骤： 在细胞培养基中培养所述细胞，和 给所述细胞培养基施用有效量的三羧酸（"TCA)中间体组合物或与其接触。
[0037]在另一个方面，本发明涉及维持或增加哺乳动物细胞培养物中的细胞生产力的方 法，其中所述铵离子产生减少，所述方法包括以下步骤： 在细胞培养基中培养所述细胞，和 给所述细胞培养基施用有效量的TCA中间体组合物或与其接触。
[0038]在另一个方面，本发明涉及维持或增加哺乳动物细胞培养物中的细胞生长的方 法，其中铵离子产生减少，所述方法包括以下步骤： 在细胞培养基中培养所述细胞，和 给所述细胞培养基施用有效量的TCA中间体组合物或与其接触。
[0039]在另一个方面，本发明涉及减少细胞培养物中铵离子积累对抗体糖基化模式的影 响的方法，其中铵离子产生减少，所述方法包括以下步骤： 在细胞培养基中培养所述细胞，和 给所述细胞培养基施用有效量的TCA中间体组合物或与其接触。
[0040]在另一个方面，本发明涉及包含TCA中间体组合物的细胞培养基。
[0041] 在某些实施方案中，所述TCA中间体是丙酮酸、a-酮戊二酸、富马酸、苹果酸和草 酰乙酸。在某些实施方案中，所述TCA中间体是丙酮酸、a-酮戊二酸、富马酸、苹果酸和草 酰乙酸的钾或钠盐。
[0042] 在一个实施方案中，所述TCA中间体组合物包含约0. 1mM至约100mM草酰乙酸 (或其盐）。在另一个实施方案中，所述TCA中间体组合物包含约3mM至约45mM草酰乙 酸（或其盐）。在某些实施方案中，将草酰乙酸（或其盐）加入所述培养物中达到约5mM、 约10mM或约15mM的终浓度。
[0043] 在一个实施方案中，所述TCA中间体组合物包含约0. 1mM至约100mM苹果酸（或 其盐）。在另一个实施方案中，所述TCA中间体组合物包含约3mM至约45mM苹果酸（或 其盐）。在一个实施方案中，将苹果酸（或其盐）加入所述培养物中达到约5mM、约10mM 或约15mM的终浓度。
[0044] 在一个实施方案中，所述TCA中间体组合物包含约0. 1mM至约100mM丙酮酸（或 其盐）。在另一个实施方案中，所述TCA中间体组合物包含约3mM至约45mM丙酮酸（或 其盐）。在某些实施方案中，将丙酮酸（或其盐）加入所述培养物中达到约15mM、约30mM 或约45mM的终浓度。
[0045]在一个实施方案中，所述TCA中间体组合物包含约0. 1mM至约100mMa-酮戊二 酸（或其盐）。在另一个实施方案中，所述TCA中间体组合物包含约3mM至约45mMa-酮 戊二酸（或其盐）。在某些实施方案中，将a-酮戊二酸（或其盐）加入所述培养物中达到 约15mM、约30mM或约45mM的终浓度。
[0046] 在一个实施方案中，所述TCA中间体组合物包含约0. 1mM至约100mM富马酸（或 其盐）。在另一个实施方案中，所述TCA中间体组合物包含约3mM至约45mM富马酸（或 其盐）。在某些实施方案中，将富马酸（或其盐）加入所述培养物中达到约15