抑制性寡核苷酸及其在治疗中的用图
【专利说明】抑制性寡核苷酸及其在治疗中的用途 I.技术领域
[0001] 本发明总体上涉及免疫学和免疫治疗领域，并且更具体地涉及免疫调节性寡核苷 酸（IR0)组合物及其用于抑制和/或阻抑Toll样受体介导的免疫应答的用途。 N.【背景技术】
[0002] Toll样受体（TLR)存在于免疫系统的某些细胞上，并且已表明其参与先天性免疫 应答。在脊椎动物中，该家族由称为TLR1至TLR10的蛋白质组成，已知这些蛋白质识别来 自细菌、真菌、寄生虫和病毒的病原体相关分子模式。TLR是哺乳动物识别外来分子并产生 针对外来分子的免疫应答的关键手段，并且其还提供了将先天性免疫应答和适应性免疫应 答联系在一起的手段。还已表明，TLR在很多疾病的发病机制和TLR介导的活化的调节中 发挥作用，所述疾病包括自身免疫、感染性疾病和炎症。通过使用合适的试剂，这可提供用 于干扰疾病的手段。
[0003] -些TLR位于细胞表面上以检测胞外病原体并引发针对胞外病原体的应答。另一 些TLR位于细胞内以检测胞内病原体并引发针对胞内病原体的应答。
[0004] 已表明，细菌和合成DNA中存在的某些未甲基化CpG基序激活免疫系统并诱导抗 肿瘤活性。使用包含未甲基化CpG二核苷酸的反义寡核苷酸的另一些研究已表现出刺激免 疫应答。后续研究证明TLR9识别细菌和合成DNA中存在的未甲基化CpG基序。包含CpG之 硫代磷酸寡核苷酸的另一些修饰还可影响其用作通过TLR9之免疫应答的调节物的能力。 此外，结构活性关系研究已允许鉴定这样的合成基序和新型基于DNA的化合物，它们诱导 不同于由未甲基化CpG二核苷酸引起的那些的特异性免疫应答模式。
[0005] TLR的选择性定位以及由其产生的信号传导对它们在免疫应答中的作用提供一些 了解。基于参与应答的细胞子集，免疫应答包括先天性应答和适应性应答两者。例如，参 与经典的细胞介导功能（例如迟发型超敏反应和激活细胞毒T淋巴细胞（CTL))的T辅助 (Th)细胞是Thl细胞。这种应答是分别针对病原体或其抗原（例如病毒感染、胞内病原体 和肿瘤细胞）的机体先天性应答，并且导致分泌IFN-y和同时激活CTL。或者，作为用于激 活B细胞的辅助细胞参与的Th细胞是Th2细胞。已表明，Th2细胞响应于细菌和寄生虫而 被激活并且可通过分泌IL-4、IL-5和IL-10来介导机体的适应性免疫应答（例如IgE产生 和嗜酸粒细胞活化）。免疫应答的类型受响应于抗原暴露而产生的细胞因子的影响，并且 Thl和Th2细胞分泌之细胞因子的差异可能是这两个子集的不同生物功能的结果。在某些 疾病（例如哮喘和变态反应）中，机体Thl/Th2平衡向Th2环境移动。
[0006] 尽管TLR的活化涉及发生免疫应答，但是TLR使免疫系统的刺激不受控制可恶化 免疫受损对象中的某些疾病。若干组已显示出合成寡脱氧寡核苷酸（0DN)作为炎性细胞因 子抑制剂的用途。这些抑制性0DN需要2个三联体序列，即1个近端"CCT"三联体和1个 远端"GGG"三联体。除包含这些三联体的抑制性0DN之外，若干组已报道了可通过包含CpG 之0DN来抑制TLR-9介导的活化的另一些特异性DNA序列。这些"抑制性"或"阻抑性"基 序富含poly"G"序列（例如"GGGG"）或"GC"序列，易于被甲基化并且存在于哺乳动物和 某些病毒的DNA中。
[0007] 另一些研究已对包含polyG之0DN用作TLR的拮抗剂的观点提出质疑。已证明，施 用包含GGGG串的CpG寡核苷酸具有有效的抗病毒和抗癌活性，并且还证明这些化合物的施 用将引起血清IL-12浓度升高。此外，已知包含polyG序列的CpG寡核苷酸通过激活TLR9 来诱导免疫应答。
[0008] 此外，已表明包含鸟苷串的寡核苷酸形成四链结构（四联体）、用作适配体并抑制 凝血酶活性。因此，不清楚单链或多链结构在后期形成不同质的高分子聚集体时是否在抑 制TLR9活化方面有效。然而，G-四联体的存在使得其免疫学和药理学特性不可预测。寡 核苷酸中polyG序列的存在还可改变其胞内浓度和定位。
[0009] 对细菌DNA中的某些基序发生反应是脊椎动物的天然免疫的一项重要功能。长久 以来，已知细菌DNA对哺乳动物B淋巴细胞（B细胞）具有促有丝分裂作用，而哺乳动物DNA 则一般无此作用。以下发现开启了分子免疫学方法领域：这种免疫识别针对以包含未甲基 化CpG二核苷酸的基序为中心的特异性DNA序列。
[0010] CpG位点或CG位点是其中在碱基的线性序列中沿其长度一个胞嘧啶核苷酸紧邻 一个鸟嘌呤核苷酸存在的DNA区域。"CpG"是"-C-磷酸-G-"的简写，S卩，胞嘧啶和鸟嘌呤 仅被一个磷酸隔开；磷酸将DNA中的任意两个核苷连接在一起。"CpG"标记用于使该线性 序列与胞嘧啶和鸟嘌呤的CG碱基配对区分开来。
[0011] 可使CpG二核苷酸中的胞嘧啶甲基化以形成例如5-甲基胞嘧啶。在哺乳动物中， 使基因内的胞嘧啶甲基化可关闭该基因。在哺乳动物中，70 %至80 %的CpG胞嘧啶是甲基 化的。
[0012] 在某些优选的侧翼序列（CpG基序）的背景下，所谓的CpGDNA的免疫刺激作用可 通过使用包含CpG二核苷酸的合成寡脱氧核苷酸（0DN)来重现。已发现，最佳的序列背景 分别是针对人TLR9的六核苷酸GTCpGTT和针对鼠TLR9的GACpGTT。已报道，包含CpG的 ODN(CpG-ODN)可对免疫系统中的多种细胞类型产生很多作用，包括保护原代B细胞免受凋 亡、促进进入细胞周期和使免疫应答向Thl型免疫应答转移，例如白细胞介素6 (IL-6)、白 细胞介素12(IL-12)、y干扰素（IFN-y)的诱导、抗原特异性细胞裂解性T淋巴细胞（CTL) 的活化和小鼠中IgG2a的诱导。
[0013] 已报道，CpGDNA的免疫调节作用涉及通过Toll样受体9(TLR9)的信号传导。认 为CpGDNA经由序列非特异性途径被内化到细胞中并运输至内体隔室，在此其以序列特异 性方式与TLR9相互作用。TLR9信号传导途径导致多个免疫功能相关基因的诱导，特别包括 细胞因子和趋化因子分泌的NF-KB介导的诱导等。
[0014]TLR是一个大的受体家族，其识别病原体中存在的特定分子结构（病原体相关分 子模式或PAMP)，并也被称为模式识别受体（PRR)。表达PRR的免疫细胞在识别PAMP时被激 活并触发最佳适应性免疫应答的产生。已经描述了由10个不同的TLR亚型（TLR1至TLR10) 组成的PRR。已经描述，这样的TLR参与识别双链RNA(TLR3)、脂多糖（LPS) (TLR4)、细菌鞭 毛蛋白（TLR5)、小抗病毒化合物以及单链RNA(TLR7和TLR8)和细菌DNA或CpGODN(TLR9)。 综述于Uhlmann等（2003)CurrOpinDrugDiscovDevel6 :204_17 中。
[0015] US2005/0239733描述了具有免疫抑制活性的寡核苷酸，其包含序列XaCC NiNAYAGGGZ。。这些序列包含基序5'CC-Li-GGG，其中接头（Li)具有含义其中 NpN2、队和~4各自独立地是任意核苷酸并且Yb可以是任意核苷酸序列，其中b是8至21 的整数。
[0016]W0 2011/005942公开了包含经修饰免疫刺激性基序的基于寡核苷酸的TLR拮抗 剂，其具有结构'，其中CG是所述经修饰的免疫刺激性基序，C是 胞嘧啶或嘧啶核苷酸衍生物并且G是鸟苷或嘌呤核苷酸衍生物。
[0017]W0 2011/005942公开了以亲本寡核苷酸形式具有免疫刺激性但以衍生的寡核苷 酸形式无免疫刺激性的寡核苷酸基序，其中所述衍生的寡核苷酸以亲本寡核苷酸为基础， 但对该寡核苷酸基序具有一个或更多个降低或消除免疫刺激性的修饰。
[0018]III?发明概述
[0019] 已发现，某些核酸分子选择性地抑制由Toll样受体TLR9、TLR8和TLR7介导的信 号传导。这些核酸分子是长度为2至约50,优选4至30,更优选5至20并且尤其优选6至 15个核苷酸的抑制性寡脱氧核苷酸（INH0DN)。尽管某些抑制性0DN仅对TLR9、TLR8、TLR7 或TLR3中的一个选择性抑制，而某些抑制性0DN对TLR9、TLR8、TLR7和TLR3中的两个或更 多个选择性抑制。抑制性0DN可单独使用、彼此组合使用或与另一试剂（例如，小分子TLR 抑制剂；免疫抑制分子（例如糖皮质激素、细胞抑制剂或抗体））组合使用，或者甚至与免疫 刺激性CpG核酸分子或TLR激动剂组合使用，以在体内或体外形成免疫应答。
[0020] 需要具有优良且优选较高生物活性的替代抑制性寡核苷酸。
[0021] 本发明公开了具有以下通式的抑制性寡核苷酸：
[0022] XiCCNiN2N3X2N4N5GGGN6X3N7(I)
[0023] 其中
[0024] C是胞苷或其衍生物，其中所述胞苷衍生物选自5-甲基胞苷，具有涉及胞嘧啶碱 基、胞苷核苷的糖或胞嘧啶碱基和胞苷核苷的糖两者的化学修饰的胞苷样核苷酸，2'-0_甲 基胞苷，5-取代胞苷，5-溴胞苷，5-羟基胞苷，核糖胞苷以及0 -D-阿拉伯呋喃糖苷-胞苷 和2' -氟-0 -D-阿拉伯呋喃糖苷-胞苷。
[0025]G是鸟苷或其衍生物，其中所述鸟苷衍生物选自7-脱氮鸟苷，2'-脱氧-7-脱氮鸟 苷，2' -0-甲基-7-脱氮鸟苷，肌苷，2' -脱氧肌苷，7-脱氮-2' -脱氧肌苷，具有涉及鸟嘌 呤碱基、鸟苷核苷的糖或鸟嘌呤碱基和鸟苷核苷的糖两者的化学修饰的鸟苷样核苷酸，
[0026] &和X3是具有0至12个碱基的任意核苷酸序列并且每个核苷酸独立于任何其他 的核苷酸，X2是具有0至3