用于产生(r)-3-奎宁环醇的生物催化方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种用于产生高光学纯度（R)-3-奎宁环醇（(3R)-1-氮杂双环 [2. 2. 2]辛-3-醇，CAS# :25333-42-0)或其盐（CAS# :42437-96-7)的方法，
[0002]
[0003] (R) -3-奎宁环醇[(3R) -1-氮杂双环[2. 2. 2]辛-3-醇]
[0004] 所述方法包括通过使用NADH作为辅因子，使奎宁环-3-酮与新氧化还原酶反应。
【背景技术】
[0005] (R)-3_奎宁环醇是合成一系列众多药物的宝贵中间体。在制药业中，它例如用 作认知增强药他沙利定、尿失禁药索利那辛或治疗哮喘用M3拮抗剂瑞伐托酯的手性合 成子。存在已知获得光学活性奎宁环醇的不同方法，如使用金属催化剂的化学还原反应 (参考JPH9-194480A)、通过酶促水解反应拆分（±)-3_奎宁环醇酯外消旋混合物（参考 US5215918B、JPH10-136995A、JPH10-210997A、JPH9-194480A)，和使用完整细胞生物催化 剂或分离的酶将奎宁环-3-酮酶促还原（参考JP10243795、JP11196890、JP2002153293、 JP2000245495)〇
[0006] 通过用金属催化剂还原制备光学纯（R)-3-奎宁环醇据报道提供不充分的工业应 用有效性，因为还原产物的光学纯度低并需要额外的纯化步骤以获得纯对映异构体。
[0007] 通过用蛋白酶拆分（±)_3_奎宁环醇酯的外消旋混合物制备光学纯（R)-3_奎宁 环醇也不适用于工业应用，原因在于必需从反应混合物除去剩余酯及与之相关的高成本。
[0008] 已经对如下属的细胞报道了通过借助完整生物转化以酶促方式还原奎宁 环-3-酮而制备光学纯（R)-3-奎宁环醇：Nakazaewaea、假丝酵母属（Candida)、 变形菌属（Proteus)、红酵母属（Rhodotorula)、Sporidiolobus、红冬抱酵母属 (Rhodosporidium)、裂殖酵母（Schizosaccharomyces)、隐球酵母属（Cryptococcus)、 丝孢酵母属（Trichisporon)、戈登氏菌属（Gordonia)、诺卡菌属（Nocardia)、产碱杆菌 属（Alcaligenes)、棒状杆菌属（Corynebacterium)、节杆菌属（Arthrobacter)、线黑粉 酵母属（Filobasisdium)、短梗霉属（Aureobasidium)、耶罗维亚酵母属（Yarrowia)、 地霉属（Geotrichum)、家村氏菌属（Tsukamurella)、库特氏菌属（Kurthia)、微杆菌属 (Microbacterium)、克鲁维酵母属（Kluyveromyces)、枝顶抱霉属（Acremonium)和毛霉属 (Mucor)(参考JP10243795、JP11196890、JP2002153293、JP2000245495)。因微生物细胞招 致的和或微生物中所含的其他酶引起的副反应招致的杂质降低光学纯度和产物产率。
[0009] 使用分离的酶通过氧化还原过程制备（R)-3-奎宁环醇也是本领域已知的并且 已经对来自曼陀罗属（Datura)和天仙子属（Hyoscyamus)(专利JP2003230398)植物的 酶以及来自红酵母属（Rhodotorula) (JP2007124922)、伯克霍尔德菌属（Burkholderia) (W02010123062)和微黄微杆菌（Microbacterium luteolum) (Int J Mol Sci. 20120ct 19 ; 13 (10): 13542-53)的酶进行报道。最近一种还原奎宁环-3-酮的醇脱氢酶已经从根癌农 杆菌（Agrobacterium tumerfacience)结晶（Acta crystallografica 10(2012)68(Pt 10):1237-1239)〇
[0010] 因为源于植物，衍生自曼陀罗属和天仙子属的酶难以工业制造。源自红酵母属和 伯克霍尔德菌属的酶需要昂贵的NADPH作为辅因子并需要葡萄糖脱氢酶用于NADPH再生， 因此造成生产过程非常昂贵。
[0011]迄今，Isotani等人，（IntJMolSci. 20120ct19 ;13 (10) : 13542-53)报道了使 用来自微黄微杆菌的酶的还原过程产生（R)-3-奎宁环醇的最高效方法。衍生自微黄微杆 菌的酶需要NADH作为辅因子并需要仲醇脱氢酶用于辅因子再生，连同需要2-丙醇作为共 底物。然而，在这种酶促还原过程中，底物载量有限，这推测地归因于奎宁环-3-酮对酶活 性的抑制作用。可以通过以下方式实现最大底物载量10% (w/v):向反应混合物连续添加 底物，因此维持反应容器中的奎宁环-3-酮浓度并同时以足够水平抑制酶。使用固定酶，在 15% (w/v)底物载量实现100%转化产率。但是，酶的固定费力且昂贵，并对反应体积造成 限制，这与工业生产过程的要求不相称。
[0012] 还原奎宁环-3-酮的已知酶数目有限。另外，这些酶并未市售并且相应的还原过 程具有重大缺陷。因此，需要用还原反应中作为生物催化剂使用的新重组氧化还原酶产生 (R) -3-奎宁环醇的高效和工业可应用的方法。
[0013] 适于3-奎宁环酮工业还原方法的氧化还原酶必须满足以下要求：
[0014] 1)在重组菌株中（例如在大肠杆菌（Escherichiacoli)中）相应表达；
[0015] 2)在有机溶剂、尤其在水可溶混性有机溶剂如2-丙醇和2- 丁醇中稳定性高；
[0016] 3)在底物3-奎宁环酮高浓度时有酶活性，没有不利地受底物或产物抑制作用影 响；
[0017] 4)与酶偶联的辅因子再生、尤其与使用仲醇作为共底物借助醇脱氢酶的辅因子再 生相容。
[0018] 本发明的目的是提供一种通过使用辅因子和分离的氧化还原酶、表达所述氧化还 原酶的重组生物、或表达所述氧化还原酶的生物的制品（如其透化、裂解或冻干细胞）还原 奎宁环-3-酮或其盐，制备（R)-3-奎宁环醇的方法。该氧化还原酶选自
[0019]a)多肽，其具有序列表的氨基酸序列SEQIDNO: 1或SEQIDN0:3或SEQIDN0:5 或SEQIDN0:7 或SEQIDN0:9 ;或
[0020]b)多肽，其具有通过置换、缺失或添加1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、 16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39至40 个或更多个氨基酸残基从3￡〇10勵：1或3￡〇10勵:3或3￡〇10勵:5或3￡〇10勵:7或 SEQIDN0:9衍生的氨基酸序列，并能够与辅因子联合还原奎宁环-3-酮；或
[0021] c)多肽，其具有下述氨基酸序列，其中至少51%的氨基酸与SEQIDN0:1或SEQID NO:3或SEQIDNO:5或SEQIDNO:9的氨基酸相同、优选地其中至少55%的氨基酸与SEQ IDN0:1或SEQIDN0:3或SEQIDN0:5或SEQIDN0:9的氨基酸相同、或其中至少60% 的氨基酸与3￡〇10勵：1或5￡〇10勵:3或5￡〇10勵:5或5￡〇10勵:9的氨基酸相同、 或其中至少65%的氨基酸与SEQIDNO:l或SEQIDNO:3或SEQIDNO:5或SEQIDNO:9 的氨基酸相同、或其中至少70%的氨基酸与SEQIDNO: 1或SEQIDNO:3或SEQIDNO:5 或SEQIDN0:9的氨基酸相同、或优选地其中至少75%的氨基酸与SEQIDN0:1或SEQID N0:3或SEQIDN0:5或SEQIDN0:9的氨基酸相同、更优选地其中至少85%的氨基酸与 3￡〇10勵：1或3￡〇10勵 :3或3￡〇10勵:5或3￡〇10勵:9的氨基酸相同、最优选地其中 至少90%的氨基酸与5￡〇10勵：1或5￡〇10勵:3或5￡〇10勵:5或5￡〇10勵:9的氨基 酸相同，并且能够与辅因子一起还原奎宁环-3-酮；或
[0022] d)多肽，其具有下述氨基酸序列，其中至少65%、优选地至少70%或至少75%或 至少80 %、更优选地至少85 %、最优选地至少90 %的氨基酸与SEQIDN0:7的氨基酸相同， 并且能够与辅因子一起还原奎宁环-3-酮；或
[0023]e)多肽，其由具有序列表的核苷酸序列SEQIDN0:2或SEQIDN0:4或SEQID NO:6或SEQIDNO:8或SEQIDNO: 10的多核苷酸编码；或
[0024]f)多肽，所述多肽由具有下述核苷酸序列的多核苷酸编码，所述核苷酸序列在严 格条件下与核苷酸序列3￡〇10勵:2或3￡〇10勵:4或3￡〇10勵:6或3￡〇10勵:8或 SEQIDN0:10的全长互补序列杂交，并且能够与辅因子一起还原奎宁环-3-酮；或
[0025]g)根据a)或b)或c)或d)或e)或f)的多肽，所述多肽还包含氨基酸序列基序 MQXiREXAWEA，其中Xi、X2、X3每一者是以下氨基酸残基的任一者：A(Ala)、R(Arg)、N(Asn)、 D(Asp)、C(Cys)、Q(Gln)、E(Glu)、G(Gly)、H(His)、I(Ile)、L(Leu)、K(Lys)、M(Met)、F(Phe)、 P(Pro)、S(Ser)、T(Thr)、W(Trp)、Y(Tyr)或V(Val)。
[0026] 优选地，氧化还原酶与辅因子NADH或NADPH联合使用。
[0027] 已经发现根据a)或b)或c)或d)或e)或f)或g)的本发明多肽能够将奎宁 环-3-酮高效还原成其相应的（R)_醇。令人惊讶地，本发明多肽之间的序列同源性（同一 性）（参见表1)从48%变动至72%。然而，本发明的多肽具有共同的特定氨基酸序列基序 MQXiREXJWEA，所述基序是这些蛋白质的酶活性在还原奎宁环-3-酮中特有的。
[0028]
L0029」序列.序MW^KeWWEA位t蛍日质的C禾爾附进。这一友现与匕知羝链醉貺氨_ 的晶体结构和基于其的同源性建模相匹配，这揭示这个基序形成该脱氢酶的底物结合口袋 的尾部，其中氨基残基1〇、1?4^和4与底物相互作用。因此推定包含基序1?乂11?乂2乂 3￥￡八 的短链醇脱氢酶适于还原奎宁环-3-酮。
[0030] 适于还原奎宁环-3-酮、优选地还原成相应R-醇的氧化还原酶理解为这样的多 肽，所述多肽在优化的反应条件下产生至少50%对映异构过量的R-醇。本文中，优化的反 应条件理解为多肽产生最大对映异构过量的R-醇的反应条件。
[0031] 已经发现本发明的多肽提供足够的氧化还原酶活性并且可以用于还原奎宁 环-3-酮，优选地还原成（R)-3-奎宁环醇。可实现的对映异构过量的R-醇总计大于或等 于50%、优选地大于或等于80%和特别优选地大于或等于95%。当使用SEQIDNO: 1时， 可以实现大于或等于99%的对映异构过量。
[0032] 能够将奎宁环-3-酮还原成相应（R)-3-奎宁环醇的氧化还原酶可以从分枝杆 菌属