专利名称：一种生物催化合成β-丙氨酸的方法
技术领域：
本发明涉及一种生物催化合成β -丙氨酸的方法，属酶工程领域。
背景技术：
β-丙氨酸(英文名beta-Alanine)又名β -氨基丙酸，它是一种非蛋白质氨基酸，是自然界中唯一的β型氨基酸，1972年由Ross和Monroe在尿嘧啶的降解产物中发现。β-丙氨酸是一种重要的生化原料，在医药、饲料和食品领域有着广泛的应用领域和市场前景。目前，β_丙氨酸的主要应用于合成泛酸和泛酸钙，泛酸又被称作维生素B5，是多种代谢所必需的辅酶A的组成部分。根据目前文献报道β -丙氨酸的合成方法主要有以下几种 I、化学合成法
(I)丙烯酸法(US 2376334 Α, 1945. 05. 22 ；US 3105092 A, 1963. 09. 24 ；US 3846489 A,1974. 11.05):丙烯酸、丙烯酸酯或丙烯酸盐与氨水，在较高的温度和压力下发生氨化反应，得到丙氨酸。丙烯酸法副产物多，需要高温高压，丙烯酸本身的腐蚀性很强，所以反应对设备的要求较高。(2)丙烯腈法(US 2335997 Α, 1943. 12. 07 ；US 2377401 A, 1947. 06. 14):丙烯腈与氨在高温高压下反应生成氨基丙腈，然后在酸性或碱性条件下水解反应生成丙氨酸。丙烯腈法使用剧毒的丙烯腈，对安全防护要求较高，反应需要高温高压，对设备要求也较高，反应收率低，由于水解过程中生成大量无机盐，产品提纯较为困难，产品纯度不高。(3) β -氨基丙腈法(US 2336067 Α, 1943. 12. 07 ；J. Am. Chem. Soc. 1945, 67, 876 ~877) : β-氨基丙腈在酸性或碱性条件下水解生成β-丙氨酸。氨基丙腈法的特点是反应产率高，缺点是β -氨基丙腈的价格较高，造成生产成本过高,另外中和过程中会产生大量的盐，造成提取困难。2、生物合成法
(I)丙烯酸加氨酶法(CN 1285730 C，2006. 11. 22):先培养微生物产生氨基化酶，然后将氨基化酶加入烯酸和氨的水溶液的反应液中，在酶的作用下合成β -丙氨酸，经脱氨、纯化后得β-丙氨酸产品。该方法反应效率高，成本低，但原料丙烯酸为强腐蚀性和刺激性液体，对人员安全和设备的要求较高，目前未见有产业化应用的报道。(2) L-天冬氨酸-α-脱羧酶法(CN 1242054 Α, 2006. 01. 19):以DL-天冬氨酸为原料，在L-天冬氨酸-α -脱羧酶法的作用下生成D-天冬氨酸和β -丙氨酸，然后调节pH值使D-天冬氨酸结晶析出，从而获得β-丙氨酸。该方法丙氨酸含有少量的D-天冬氨酸，产品的纯度不高；L-天冬氨酸-α -脱羧酶活力低，酶促反应的效率低，原料DL-天冬氨酸价格较高，造成丙氨酸成本较高。(3)腈水解酶法(JP特开平10-42886 Α，2006· 02. 17):利用产有机腈水解酶的微
生物催化β-氨基丙腈合成丙氨酸。该法底物氨基丙腈价格高，且反应浓度低，生产成本相对较高，经济效益差。
发明内容
本发明提供了一种安全、环保、高效、成本低、产品品质高的生物催化合成β_丙氨酸的方法，彻底杜绝了传统生产工艺中剧毒、强腐蚀性、强酸强碱和高价原料的使用。本发明达到发明目的所采用的技术方案是
本发明所采用的微生物为大肠杆菌属菌株，在培养基上纯培养，获得两种酶天冬氨酸酶和L-天冬氨酸-α -脱羧酶，富马酸溶解于氨水中配制成反应的底物一富马酸铵溶液，将含酶的大肠杆菌细胞加入底物中进行酶促反应，从而生成β -丙氨酸。本发明所用的种子培养基为富马酸I 10g/L，玉米浆干粉10 20g/L，多肽朊 5 15g/L,味精 5 10g/L, MgSO4 · 7H20 O. 2 O. 5g/L, K2HPO4 O. 15 O. 25g/L, NaClO. I O. 5g/L，用氨水调pH6. 8 7. 5 ;发酵培养基为富马酸5 15g/L，玉米浆干粉10 20g/L，多肽朊5 15g/L，L-天冬氨酸5 15g/L，甜菜碱盐酸盐O. I O. 5g/L，MgSO4 ·7Η20O. 2 O. 5g/L, K2HPO4 O. 15 O. 25g/L, NaCl O. I O. 5g/L，用氨水调 ρΗ6· 8 7. 5。本发明所述大肠杆菌的培养温度为28 45°C，转速150 300r/min，培养时间16 32h。本发明所述底物的pH为6. O 7. 5，底物中富马酸的浓度为50 150g/L。本发明所述酶促反应中大肠杆菌细胞的添加量为20 50g/L。本发明所述酶促反应的温度为32 50°C，pH为6. O 7. 5。本发明采用流加富马酸来控制反应过程中的pH。本发明所述的一种生物催化合成β -丙氨酸的方法，其有益效果主要体现在
(O反应过程中没有使用剧毒、强腐蚀性、强酸强碱原料，生产工艺安全环保；
(2)反应直接生成β-丙氨酸，工艺简单易行；
(3)反应过程中温度为32 50°C，pH为6.O 7. 5，反应条件温和；
(4)反应中无副产物和大量的盐产生，提取工艺简单，产品纯度高；
(5)原材料富马酸廉价易得，底物浓度高，产率高，生产成本低。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，但本发明的保护范围不仅限于此。实施例I :含量的测定
(O富马酸含量的测定(高效液相色谱法)
酶促反应液10000r/min离心沉淀细胞,取上清液并稀释10倍，同时准备富马酸标准样品(2mg/ml),进行高效液相色谱分析。柱型号Alltech有机酸色谱柱 No. 88645, 250mmX 4. 6mm 流动相25mmol/L KH2PO4, pH2. 5
进样量20 μ I 柱温35°C
梯度方式恒流I. 0ml/min 检测器紫外波长210nm 计算方式外标法(2)β-丙氨酸含量的测定(高效液相色谱法)
分别取提取烘干的β_丙氨酸样品和丙氨酸标准样品(2mg/ml)，进行高效液相色谱分析。衍生方法准确称取O. 3430g邻苯二甲醒溶于5ml无水乙醇中，然后加入O. 1472gN-乙酰-L-半胱氨酸，用O. lmol/L的硼砂缓冲液(pH=9. 5)定容到25ml，配制衍生剂避光备用。依次加入硼砂缓冲液(ρΗ=9· 5)300 μ I，样品溶液250 μ 1，衍生剂250 μ I。混匀后等待2min (严格控制时间和试剂添加量)，然后进样。柱型号XDB-C8中性柱，150mmX4. 6mm 流动相A 0. 05mol/L醋酸钠缓冲液，B :甲醇 进样量20μ I
柱温30°C
梯度方式流动相A :流动相B=65 :35，恒流I. Oml/min 检测器紫外波长334nm 计算方式外标法
实施例2 :生物催化合成β-丙氨酸
种子培养基富马酸5g，玉米浆干粉10g，多肽朊10g，味精10g，MgSO4 · 7H20 0. 2g，K2HPO4 O. 15g，NaCl 0. 4g，加水配制成IL的溶液并用氨水调ρΗ7· 0,121°C蒸汽灭菌20min。发酵培养基富马酸20g，玉米浆干粉40g，多肽朊40g，L-天冬氨酸20g，甜菜碱盐酸盐O. 8g，MgSO4 · 7H20 O. 8g，K2HPO4 O. 6g，NaCl 0. 4g，加水配制成4L的溶液并用氨水调pH7. 0,121°C蒸汽灭菌 20min。底物溶液富马酸100g，用氨水调节pH7. 5，定容至1L。大肠杆菌斜面菌种接入种子培养基，200r/min，37°C摇床培养24h。以10%的接种量转入发酵培养基，200r/min, 37°C摇床培养18h得到发酵液，用离心机在4000r/min转速下，离心收集126g大肠杆菌湿细胞。取35g大肠杆菌的湿细胞加入底物溶液，进行酶促反应，不断流加富马酸来控制反应的PH7. 5，反应18h后pH保持稳定，流加富马酸64g，再继续反应，每间隔Ih取样一次，用HPLC检测富马酸含量，4h后检测反应液中富马酸含量<0. 1%，反应完成。反应液在4000r/min离心去除大肠杆菌细胞，加活性炭脱色，过滤，减压浓缩至原体积的1/4，在缓慢搅拌条件下，滴加3倍体积无水乙醇，有大量白色结晶析出，抽滤出晶体并用少量无水乙醇洗涤，烘干后称量得白色固体101. 8g，收率为80. 9%，用HPLC检测β -丙氨酸的含量为99. 2%。实施例3 :生物催化合成丙氨酸
种子培养基富马酸10g，玉米浆干粉15g，多肽朊5g，味精8g，MgS04*7H20 0. 3g, K2HPO4
O.20g, NaCl O. 25g，加水配制成IL的溶液并用氨水调ρΗ7· 2，121°C蒸汽灭菌20min。发酵培养基富马酸40g，玉米浆干粉60g，多肽朊20g，L-天冬氨酸40g，甜菜碱盐酸盐I. 0g, MgSO4 · 7H20 I. 0g, K2HPO4 O. 8g，NaCl I. 0g，加水配制成4L的溶液并用氨水调pH7. 2,121°C蒸汽灭菌 20min。底物溶液富马酸80g，用氨水调节pH7.0，定容至1L。大肠杆菌斜面菌种接入种子培养基，250r/min，32°C摇床培养20h。以10%的接种量转入发酵培养基，250r/min, 32°C摇床培养24h得到发酵液，用离心机在4000r/min转速下，离心收集142g大肠杆菌湿细胞。取25g大肠杆菌的湿细胞加入底物溶液，进行酶促反应，不断流加富马酸来控制反应的PH7. O,反应16h后pH保持稳定，流加富马酸68g，再继续反应，每间隔Ih取样一次，用HPLC检测富马酸含量，4h后检测反应液中富马酸含量<0. 1%，反应完成。反应液在4000r/min离心去除大肠杆菌细胞，加活性炭脱色，过滤，减压浓缩至原体积的1/4，在缓慢搅拌条件下，滴加3倍体积无水乙醇，有大量白色结晶析出，抽滤出晶体并用少量无水乙醇洗涤，烘干后称量得白色固体85. 6g，收率为75. 4%，用HPLC检测β -丙氨酸的含量为98. 9%。实施例4 :生物催化合成丙氨酸
种子培养基富马酸8g，玉米浆干粉20g，多肽朊15g，味精5g，MgS04*7H20 O. 5g, K2HPO4O. 25g, NaCl O. 5g,加水配制成IL的溶液并用氨水调pH7. 5,121°C蒸汽灭菌20min。 发酵培养基富马酸60g，玉米浆干粉80g，多肽朊60g，L-天冬氨酸60g，甜菜碱盐酸盐2. 0g, MgSO4 · 7H20 2. 0g, K2HPO4 I. 0g, NaCl 2. 0g，加水配制成4L的溶液并用氨水调 pH7. 5,121°C蒸汽灭菌 20min。底物溶液富马酸140g，用氨水调节pH6. 5，定容至1L。大肠杆菌斜面菌种接入种子培养基，300r/min，4rC摇床培养18h。以10%的接种量转入发酵培养基，300r/min，4rC摇床培养27h得到发酵液，用离心机在4000r/min转速下，离心收集161g大肠杆菌湿细胞。取45g大肠杆菌的湿细胞加入底物溶液，进行酶促反应，不断流加富马酸来控制反应的PH6. 5，反应25h后pH保持稳定，流加富马酸97g，再继续反应，每间隔Ih取样一次，用HPLC检测富马酸含量，6h后检测反应液中富马酸含量<0. 1%，反应完成。反应液在4000r/min离心去除大肠杆菌细胞，加活性炭脱色，过滤，减压浓缩至原体积的1/3，在缓慢搅拌条件下，滴加3倍体积无水乙醇，有大量白色结晶析出，抽滤出晶体并用少量无水乙醇洗涤，烘干后称量得白色固体155. 3g，收率为85. 4%，用HPLC检测β -丙氨酸的含量为99. 0%。
权利要求
1.一种生物催化合成β-丙氨酸的方法，其特征在于本发明采用的微生物为大肠杆菌属菌株，在培养基上纯培养，获得两种酶天冬氨酸酶和L-天冬氨酸-α -脱羧酶，富马酸溶解于氨水中配制成反应的底物一富马酸铵溶液，将含酶的大肠杆菌细胞加入底物中进行酶促反应，从而生成β_丙氨酸。
2.根据权利要求I所述的一种生物催化合成丙氨酸的方法，其特征在于种子培养基为富马酸I 10g/L，玉米浆干粉10 20g/L，多肽朊5 15g/L，味精5 10g/L，MgSO4 ·7Η20 O. 2 O. 5g/L, K2HPO4 O. 15 O. 25g/L，NaCl O. I O. 5g/L，用氨水调 ρΗ6· 8 7.5 ;发酵培养基为富马酸5 15g/L，玉米浆干粉10 20g/L，多肽朊5 15g/L，L-天冬氨酸 5 15g/L，甜菜碱盐酸盐 O. I O. 5g/L，MgSO4 · 7H20 O. 2 O. 5g/L，K2HPO4 O. 15 O.25g/L, NaCl O. I O. 5g/L，用氨水调 ρΗ6· 8 7. 5。
3.根据权利要求I所述的一种生物催化合成丙氨酸的方法，其特征在于大肠杆菌的培养温度为28 45°C，转速150 300r/min，培养时间16 32h。
4.根据权利要求I所述的一种生物催化合成β-丙氨酸的方法，其特征在于底物的pH为6. O 7. 5，底物中富马酸的浓度为50 150g/L。
5.根据权利要求I所述的一种生物催化合成丙氨酸的方法，其特征在于酶促反应中大肠杆菌细胞的添加量为20 50g/L。
6.根据权利要求I所述的一种生物催化合成丙氨酸的方法，其特征在于酶促反应的温度为32 50°C，pH为6· O 7· 5。
7.根据权利要求I或5所述的一种生物催化合成β-丙氨酸的方法，其特征在于利用流加富马酸来控制反应过程中的pH。
全文摘要
本发明提供了一种生物催化合成β-丙氨酸的方法，属于酶工程领域。该方法是培养大肠杆菌属微生物，获得天冬氨酸酶和L-天冬氨酸-α-脱羧酶，将含酶的大肠杆菌细胞和富马酸铵水溶液混合，进行酶反应生成β-丙氨酸。该方法原料廉价易得，生产工艺简单、安全、环保，反应条件温和、效率高，生产成本低，产品品质高，与传统方法相比，具有显著的经济效益和环保效益。
文档编号C12P13/06GK102851333SQ20121007513
公开日2013年1月2日 申请日期2012年3月21日 优先权日2012年3月21日
发明者不公告发明人 申请人:蒋光玉