一种一体化制备番红花酸、京尼平及栀子蓝等产品的方法
【专利摘要】本发明涉及生物技术及天然产物综合利用领域，具体涉及一种以栀子为原料，经粉碎醇提浓缩，不经过树脂、硅胶等复杂分离手段，直接通过简单的化学修饰和生物催化技术，通过一套生产工艺，一体化制备番红花酸、京尼平及栀子蓝等多种高技术附加值产品的方法。所制备的番红花酸和京尼平纯度均可达到95%以上，栀子蓝色素色价E590>110。
【专利说明】一种一体化制备番红花酸、京尼平及栀子蓝等产品的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物技术及天然产物综合利用领域，具体涉及一种以桅子为原料一体化制备番红花酸、京尼平及桅子蓝等多种高技术附加值产品的方法。该方法设备要求低，操作简便，不需要经过树脂、硅胶等复杂分离手段，即可在一套生产工艺流程中，同时生产多种深加工产品。
【背景技术】
[0002]桅子(Gardenia jasminoides Ellis),又名山桅子、黄桅子、红桅子、白蝶等,是菌草科桅子属的一种常绿灌木。桅子性苦寒、无毒，常用来清热泻火、解玉支毒、清胃脘血等。现代药理学研究表明，桅子具有解热镇静、保肝利胆等功效，临床上用于治疗急性黄疸性肝炎、止痛、扭挫伤、冠心病等。
[0003]桅子的化学成分较为复杂，达100多种。到目前为止，已从桅子属植物中分离鉴定的化合物有环烯醚萜类、黄酮类、有机酸酯类、长链烷烃类等。目前对桅子的利用主要是从桅子果中提取桅子黄色素和桅子苷，以及基于这两种原料的深加工产品，如番红花酸、京尼平和桅子蓝色素等。
[0004]番红花酸是番红花素水解后的产物，是番红花的有效成分之一，具有保护肝脏，抑制肿瘤，抗氧化等多种药理功能。但藏红花只是柱头入药，产量极低，又因为其资源极其有限，在中国很难大面积栽培，致使其价格昂贵被誉为“植物黄金”，具有极高的医疗价值。桅子中大量存在桅子黄色素为一系列类胡萝卜素衍生物，在结构上与番红花酸及其相似，因此人们尝试采用桅子为原料制备番红花酸来弥补市场的需求。
[0005]京尼平(Genipin)是桅子苷经β -葡萄糖苷酶水解后的产物，是一种优良的天然生物交联剂，可以与蛋白质、胶原、明胶和壳聚糖等交联制作生物材料，如人造骨骼、伤口包扎材料等，其毒性远低于戊二醛和其他常用化学交联剂。同时，药理学研究表明，其具有治疗肝脏疾病、缓解II型糖尿病的症状的功效。
[0006]桅子蓝色素具有着色力强、色泽鲜艳自然、无异味、耐热、耐光、稳定性好、色调不受PH值影响，对人体无毒副作用等优点，是目前国际流行的天然食品添加剂，还可以用于高档纺织品、化妆品等的染色。采用高纯度结晶桅子苷、合适的转色酶、精制氨基酸制备桅子蓝色素，其最大吸收峰可以达到600nm以上；这种高端桅子蓝的价格在国际上为普通品种2-3倍，可以说是一种高技术高附加值的产品。
【发明内容】
[0007]本发明提供直接利用桅子果实醇提取液同时制备番红花酸、京尼平及桅子蓝等多种产品的方法。该方法设备要求低，操作过程简便，可以同时生产多种高经济附加值的深加工产品，使资源得到合理的应用，将经济效益最大化。
[0008]本发明目的通过以下方法实现:包括桅子果实中主要成分的提取，番红花酸的制备及纯化，京尼平的制备及纯化和桅子蓝的制备及精制这几部分内容。[0009](I)桅子果实中主要成分的提取:桅子果实经粉碎20目后采用70-100%甲醇溶液进行提取，提取结束后去除药渣并浓缩提取液。
[0010](2)番红花酸的制备及纯化:在浓缩液中加入强碱，对其中的番红花苷类成分进行碱解，过滤并收集滤渣，滤液备用。滤渣经碱水充分溶解后加入强酸后再次产生沉淀。沉淀经大量清水洗涤后即为番红花酸粗品，纯度达70%以上；采用乙醇、乙酸乙酯、N, N-二甲基甲酰胺对番红花酸粗品进行重结晶即可将纯度提升至95%以上。
[0011](3)京尼平的制备及纯化:将碱解反应结束所得的滤液蒸干后采用纯水复溶，并与有机溶剂构建稳定有机溶剂/水两相系统。在两相系统中加入能够水解β (1-4)糖苷键的酶，并控制反应过程的温度及pH等因素对桅子苷进行水解。水解过程结束后，分离有机相溶液并浓缩蒸干，即得京尼平粗品，纯度达60%以上。对粗品采用乙醇、丙酮等有机进行重结晶可将纯度提升至95%以上。 [0012](4)桅子蓝色素的制备及精制:制备的京尼平粗品经水复溶后，加入的氨基酸在超声波辅助下络合形成桅子蓝色素粗品溶液；采用膜分离技术对桅子蓝色素的粗品溶液进行精制即可得到高色价桅子蓝色素，色价>110。
[0013]本发明实施时包括如下步骤:(1)桅子果实经粉碎后过20目筛，采用溶剂进行提取3遍，去除药渣并合并提取液进行浓缩至固形物含量为10-30%。所述溶剂为醇含量为70-100%的甲醇/水混合溶剂。
[0014](2)在浓缩后的提取物中加入NaOH、KOH或Na2CO3等，调节提取物溶液pH在9_11范围内，采用超声波发生装置对碱解反应进行催化加速。反应过程的温度控制在10-40°C，超声波频率为40kHz，功率为50-100W，反应时间为10-30分钟。
[0015](3)反应结束后，通过抽滤收集溶液中产生的黄褐色沉淀，滤液备用。
[0016](4)取黄褐色沉淀加入pH为9-11的碱水直至不再溶解，再加入酸水调节pH到3_4之间，直至不再产生砖红色沉淀。所用碱水可由NaOH、KOH或Na2CO3等溶于水进行配置，所用酸水为HCl或H2S04。所得砖红色沉淀经大量清水洗涤后即为番红花酸粗品，纯度达70%以上。
[0017](5)对番红花酸粗品进行重结晶即可将纯度提升至95%以上。采用溶剂为乙醇、乙酸乙酯或N，N-二甲基甲酰胺。
[0018](6)将碱解反应结束所得的滤液蒸干后采用纯水复溶，并与有机溶剂构建稳定有机溶剂/水两相系统。所述有机溶剂可以为乙酸乙酯，石油醚或二氯甲烷中的一种。
[0019](7)在两相系统中加入能够水解β (1-4)糖苷键的酶，并采用超声波加速酶解反应的发生，反应过程的温度控制在40-55°C，采用乙酸调节pH为4.5-5.5，超声波频率为40kHz，功率为50-100W，反应时间为4至12小时，最终转化率可达85%以上。所述能够水解β (1-4)糖苷键的酶可以为β葡萄糖苷酶(酶活2 wU，酶用量为0.5%)、纤维素酶(酶活20wU，酶用量为5%)或半纤维素酶(酶活20 wU，酶用量为5%)。
[0020](8)取反应结束后的有机相层，采用等体积纯水洗涤3遍后，浓缩蒸干溶剂，即得京尼平粗品，纯度达75%以上。
[0021](9)采用有机溶剂系统对京尼平粗品进行重结晶可将纯度提高至95%以上。所述有机溶剂系统为石油醚-乙酸乙酯、石油醚-丙酮、乙醇-水系统中的一种。
[0022](10)取京尼平粗品采用纯水复溶，加入能够与京尼平络合的α-氨基酸，如谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸中的一种或多种混合氨基酸。采用超声波加速桅子蓝色素的络合反应过程，反应过程的温度控制在40-55°C，超声波频率为40kHz，功率为50-100W，反应时间为12至24小时，所得桅子蓝溶液，色价E590>60。
[0023](11)反应结束后的桅子蓝溶液通过膜分离技术，采用截留孔径在3000-5000的中空纤维素膜或有机膜除去其中的小分子杂质并同时对桅子蓝溶液进行浓缩，直至固形物含量超过15 %。处理后的桅子蓝溶液经喷雾干燥得到桅子蓝粉末，色价E590>110。
[0024]本发明的优点及积极效果:本发明采用超声波催化手段，通过碱解、酶解等方法直接从桅子果实中同时制备番红花酸、京尼平及桅子蓝等多种高附加值产品。
[0025](I)由于桅子中成分复杂，传统工艺制备番红花酸是通过首先从桅子中提取纯化桅子黄色素(即番红花苷类化合物)，再经碱解等方法制备番红花酸。该生产工艺过程复杂，操作繁琐，生产成本较高。本专利提供了一种通过直接以桅子的醇提物为原料，通过酯交换反应有效的将番红花苷类化合物形成不溶于醇的沉淀产物，再通过过滤及水解等极其简单的操作即可得到番红花酸粗品；整套生产工艺具有操作简便，生产周期短，降低成本等多方面的优势。
[0026](2)本发明还提出了对生产番红花酸而产生的废液进行综合利用的途径。通过采用有机溶剂/水两相催化方法可以利用含有桅子苷的废液制备重要的生物医药材料京尼平。该方法利用桅子苷与京尼平在不同溶剂中的溶解度的差异，可以有效的将酶促反应的产物京尼平富集于有机相中，从而使得水相中京尼平的含量长期处于较低水平，起到促进反应发生、提高转化率的作用。不仅如 此，由于京尼平会与液体环境中存在的氨基酸、蛋白质等发生络合反应形成色素；因此，本发明采用有机溶剂/水两相催化的手段来进行该水解过程，可以有效的避免反应产物京尼平与水相中氨基酸和蛋白质接触，从而保证了产物京尼平的稳定存在，提高了反应的得率。与传统通过固定化酶等技术生产京尼平相比，具有得率高，设备要求低，操作简便等优势。
[0027](3)本发明首次将超声波催化应用到桅子深加工产品的生产工艺中，有效实现了其中的多步重要反应过程的快速完成。例如，传统番红花苷类化合物的碱解采用热回流方法往往需要数小时才能反应完全，而在常温下通过超声波辅助催化手段仅需I小时即可终止反应；再如，现有工艺中采用β葡萄糖苷酶对桅子苷的酶解过程往往需要持续24至48小时，而通过超声波辅助可以将反应过程缩短在6至12小时之内完成。因此，本发明将超声波催化应用到桅子深加工产品的生产工艺中，具有缩短生产周期，减少能耗，缩小成本等多方面优势。
[0028]【专利附图】
【附图说明】:
图1是番红花酸标准品液相色谱图。
[0029]图2是经精致重结晶后的番红花酸液相色谱图。
[0030]图3是点尼平标准品液相色谱图。
[0031]图4是经精致重结晶后的京尼平液相色谱图。
[0032]【具体实施方式】:
本发明可以通过
【发明内容】
中说明的技术具体实施，通过下面的实例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。
[0033]实施例1:番红花酸的制备。[0034](I)桅子果实200g经粉碎后采用1000 ml甲醇提取2遍，经过滤除去药渣后，将两次提取液合并浓缩至200ml。
[0035](2)在浓缩液中加入NaOH调节pH为10.0，置于超声波发生装置中进行反应。反应过程的温度控制在28°C，超声波频率为40kHz，功率为100W，反应时间为10分钟。
[0036](3)反应结束后，通过抽滤收集溶液中产生的黄褐色沉淀。
[0037](4)取黄褐色沉淀加入pH为10的碱水100 ml，待全部溶解后，再加入2mol/L的HCl水溶液调节pH到3，此时溶液中产生大量砖红色沉淀。所得砖红色沉淀经大量清水洗涤后即为番红花酸粗品1.7g。
[0038](5)取番红花酸粗品lOOmg，在65°C下采用20ml N, N- 二甲基甲酰胺溶解，并浓缩至原体积1/3后，在4°C下进行重结晶，得结晶番红花酸36mg。
[0039](6)采用HPLC对重结晶后的番红花酸进行纯度检测，纯度95%以上。
[0040]检测结果如附图1、2所示。
[0041]实施例2:京尼平的制备。
[0042](I)取200 ml碱解反应结束所得的甲醇滤液，蒸干甲醇后采用200ml纯水复溶，按体积比1:1加入乙酸乙酯构建两相系统。
[0043](2)在两相系统中加入酶活为20wU的中温纤维素酶(用量5%)，并置于超声波发生器中反应，反应过程的温度控制在50°C，采用乙酸调节pH为4.5，超声波频率为40kHz，功率为100W，反应时间为8小时。
`[0044](3)取反应结束后的有机相层，采用等体积纯水洗涤3遍后，浓缩蒸干溶剂，即得京尼平粗品6.3 g，纯度达75%以上。
[0045](4)取京尼平粗品2.0 g，采用甲醇-水系统在50°C下溶解后，放入4°C冰箱进行重结晶，得结晶京尼平1.3 g。
[0046](5)采用HPLC对重结晶后的京尼平进行纯度检测，纯度在95~98%。
[0047]检测结果如附图3、4所示。
[0048]实施例3:桅子蓝色素的制备。
[0049](I)取京尼平粗品100.0g,(含量75%)采用IOL蒸馏水溶解。
[0050](2)在水溶液中加入200.0g纯度为99%以上的谷氨酸钠，并置于超声波发生器中反应，反应过程的温度控制在50°C，超声波频率为40kHz，功率为100W，反应时间为24小时。反应结束后，所得溶液即为桅子蓝粗品水溶液溶液，色价E590>60。
[0051](3)反应结束后的桅子蓝粗品水溶液，采用截留孔径在3000-5000的中空纤维素膜进行截留浓缩，直至截留液中固形物含量超过15%时停止。
[0052](4)截留液经喷雾干燥得到桅子蓝粉末164.7 g，色价E590>110。(色价测定按照GB 28311— 2012中方法进行)。
【权利要求】
1.一种利用桅子醇提液一体化制备番红花酸、京尼平及桅子蓝等产品的方法，其特征是:将桅子粉碎后经醇提取、浓缩后，浓缩液直接通过两次碱解法达到制备藏花酸并同时与桅子苷分离的目的，而后进一步通过水-有机溶剂两相酶催化手段水解桅子苷，制备京尼平和桅子蓝色素。
2.权利要求1中制备藏花酸的两次碱解法中，第一次碱解法如下:(I)桅子果实经粉碎后过20目筛，采用醇含量为70-100%的甲醇/水混合溶剂常温下提取3遍，去除药渣，合并提取液，并浓缩至固形物含量为10-30% ;(2)在浓缩后的提取物中加入NaOH、KOH或Na2C03，调节提取物溶液pH在9-13范围内，温度控制在20_60°C，时间为10-30分钟，超声波频率为40kHz，功率为20-100W抽滤的黄褐色沉淀。
3.权利要求1中制备藏花酸的两次碱解法中，第二次碱解法如下:取黄褐色沉淀加入pH为9-11的碱水直至不再溶解，再加入酸水调节pH到3-4之间，直至不再产生砖红色沉淀，即为纯度达70%以上的番红花酸粗品，所用碱水可由Na0H、K0H或Na2C03等溶于水进行配置，所用酸水为HCl或H2S04水溶液。
4.权利要求1中水-有机溶剂两相催化体系水解桅子苷制备京尼平方法如下:将分离出藏花酸后所得的滤液蒸干，采用纯水复溶，并与乙酸乙酯，石油醚或二氯甲烷等有机溶剂中的一种构建稳定有机溶剂/水两相系统，中加入能够水解β (1_4)糖昔键的酶，并米用超声波加速酶解反应的发生，反应过程的温度控制在40-55°C，采用乙酸调节pH为4.5-5.5，反应时间为4至12小时，最终转化率可达85%以上。
5.权利要求1中桅子蓝色素的制备方法为:取分离出藏花酸后所得的滤液，加入能够水解β (1-4)糖苷键的酶和谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸中的一种或多种混合氨基酸，反应时间为12至24小时，所得桅子蓝溶液采用截留孔径在3000-5000的中空纤维素膜或有机膜除去其中的小分子杂质并同时对桅子蓝溶液进行浓缩，直至固形物含量超过15 %，经喷雾干燥得到桅子蓝粉末，色价Ε590>110。
6.权利要求4和5中所述能够水解β(1-4)糖苷键的酶可以为β葡萄糖苷酶(酶活2wU，酶用量为0.5-5%)、纤维素酶(酶活20 wU，酶用量为5-20%)或半纤维素酶(酶活20 wU，酶用量为5-20%)。
【文档编号】C07C57/13GK103695494SQ201310666965
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年12月11日 优先权日:2013年12月11日
【发明者】赵伯涛, 朱羽尧, 钱骅, 黄晓德, 陈斌 申请人:中华全国供销合作总社南京野生植物综合利用研究所