转氨酶生物催化剂的制作方法
【技术领域】
[0001 ]本申请涉及转氨酶以及使用所述转氨酶作为生物催化剂的方法。
【背景技术】
[0002] 由于其以优良的区域选择性、立体选择性和对映选择性催化其反应的能力，转氨 酶越来越多地用于化学制品、药物和聚合物的商业规模制造。作为蛋白质，它们通常在水性 系统中工作，去除挥发性有害溶剂的需要，并且它们避免通常与竞争重金属催化剂相关的 有害副产物的产生。此外，生物催化剂可以容易地与反应混合物分开，并且常规在环境友好 的温度和压力下操作。大体上，它们视为常规催化化学的"绿色"替代物。
[0003] 然而，生物催化工艺开发通常受酶的可用性的挑战，所述酶满足给定靶化合物的 底物特异性要求。例如，尼龙制造所需的长链氨基酸(例如C9-12)在自然界中并不丰富，没 有这些分子的明确生理学作用。
[0004] 因为转氨酶通常具有有限的底物范围，所以需要另外的转氨酶。
【发明内容】
[0005] 本发明人拥有经分离的新型转氨酶（例如来自新近分离的假单胞菌属物种 (Pseudomonas sp.)的p6和p7)，其可以用作工业相关物包括但不限于胺、二胺和氨基酸生 产中的生物催化剂，所有这些工业相关物在例如聚酰胺或多肽生产中具有显著应用。
[0006] 相应地，本发明提供了基本上纯化的和/或重组的多肽，其包含：
[0007] i)SEQ ID N0:l、2或6-12中任一个提供的氨基酸序列，
[0008] ii)与SEQ ID N0:l、2或6-12中的任何一个或多个至少40%相同的氨基酸序列，或
[0009] 或ii)的生物学活性片段。
[0010] 在一个实施方案中，本发明提供了基本上纯化的和/或重组的多肽，其包含：
[0011] i)SEQIDN0:l或SEQIDN0:2中提供的氨基酸序列，
[0012] ii)与i)至少40%相同的氨基酸序列，或
[0013] 或ii)的生物学活性片段。
[0014] 本发明还提供了基本上纯化的和/或重组的多肽，其包含：
[0015] i)SEQ ID N0:l、2或6-12中任一提供的氨基酸序列，
[0016] ii)与SEQ ID N0:l、2或6-12中的任何一个或多个至少40%相同的氨基酸序列，或
[0017] 或ii)的生物学活性片段，
[0018] 其中所述多肽具有氨基转移酶活性。
[0019] 在一个实施方案中，本发明还提供了基本上纯化的和/或重组的多肽，其包含：
[0020] i)SEQIDN0:l或SEQIDN0:2中提供的氨基酸序列，
[0021] ii)与i)至少40%相同的氨基酸序列，或
[0022] 或ii)的生物学活性片段，
[0023]其中所述多肽具有氨基转移酶活性。
[0024] 在本发明的一个实施方案中，所述多肽包含与SEQ ID NO: 1、2或6-12中的任何一 个或多个至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%相同的氨基酸序列。
[0025] 在本发明的一个实施方案中，所述多肽催化氨基从氨基供体到氨基受体的转移。 换言之，本发明的多肽催化氨基从氨基供体的去除和氨基对氨基受体的添加。像这样，氨基 供体和氨基受体两者均视为所述多肽的"底物"。
[0026] 氨基转移反应一般是可逆的。相应地，在本发明的一个实施方案中，所述多肽催化 氨基从氨基供体到氨基受体的可逆转移。
[0027] 本发明人惊讶地发现本发明的多肽能够催化例如具有多达18个碳的显著更长底 物的脱氨基/氨化。
[0028]因此，在本发明的一个进一步的实施方案中，氨基供体或氨基受体包含至少3个 碳。在本发明的另一个实施方案中，氨基供体或氨基受体包含至少4个碳。在本发明的另一 个实施方案中，氨基供体或氨基受体包含至少9个碳。在本发明的一个进一步实施方案中， 氨基供体或氨基受体包含多达12、13、14、15、16、17或18个碳。在本发明的另一个实施方案 中，氨基供体或氨基受体包含9-12个碳。在本发明的另一个实施方案中，氨基供体或氨基受 体包含9-13个碳。在本发明的另一个实施方案中，氨基供体或氨基受体包含9-14个碳。在本 发明的另一个实施方案中，氨基供体或氨基受体包含9-15个碳。在本发明的另一个实施方 案中，氨基供体或氨基受体包含9-16个碳。在本发明的另一个实施方案中，氨基供体或氨基 受体包含9-17个碳。在本发明的另一个实施方案中，氨基供体或氨基受体包含9-18个碳。 [0029]在一个实施方案中，所述多肽包含：
[0030] i)SEQ ID N0:1中提供的氨基酸序列，
[0031] ii)与i)至少40%相同的氨基酸序列，或
[0032] 或ii)的生物学活性片段，并且
[0033]催化氨基从包含3-12个碳的氨基供体到氨基受体的转移。
[0034]在一个实施方案中，所述多肽包含：
[0035] i)SEQ ID N0:1中提供的氨基酸序列，
[0036] ii)与i)至少40%相同的氨基酸序列，或
[0037] 或ii)的生物学活性片段，并且
[0038]催化氨基从氨基供体到包含3-12个碳的氨基受体的转移。
[0039]在一个实施方案中，所述多肽包含：
[0040] i)SEQ ID N0:2或6-12中的任何一个提供的氨基酸序列，
[0041 ] ii)与如SEQ ID N0:2或6-12中的任何一个至少40%相同的氨基酸序列，或
[0042] 或ii)的生物学活性片段，并且
[0043]催化氨基从包含4-12个碳的氨基供体到氨基受体的转移。
[0044]在一个实施方案中，所述多肽包含：
[0045] i)SEQ ID N0:2或6-12中的任何一个提供的氨基酸序列，
[0046] ii)与如SEQ ID N0:2或6-12中的任何一个至少40%相同的氨基酸序列，或 [0047] 或ii)的生物学活性片段，并且
[0048] 催化氨基从氨基供体到包含4-12个碳的氨基受体的转移。
[0049] 在本发明的一个实施方案中，所述氨基供体是氨基酸或胺化合物。
[0050] 在一个实施方案中，所述氨基酸是ω-氨基酸例如3-氨基丙酸、4-氨基丁酸、5-氨 基戊酸、6-氨基己酸、7-氨基庚酸、8-氨基辛酸、11-氨基十一酸、12-氨基十二酸、3-氨基庚 酸、3-氨基异丁酸，或其衍生物。3-氨基异丁酸是3-氨基丙酸或4-氨基丁酸的衍生物的实 例。
[0051] 在一个实施方案中，所述氨基酸是β-氨基酸例如3-氨基庚酸或其衍生物。
[0052]在一个实施方案中，所述胺化合物是伯胺，例如1，4-二氨基丁烷、1，5-二氨基戊 烷、1，6_二氨基己烷、6-氨基己烷-1-醇、牛磺酸、酪胺、环己胺、异丙胺、2-氨基茚满，或其衍 生物。
[0053]所述伯胺可以是二胺例如1，4_二氨基丁烷、1，5_二氨基戊烷、1，6_二氨基己烷，或 其衍生物。
[0054]在本发明的一个实施方案中，胺化合物不是氨基丙二酸二乙酯、氨甲基膦酸、3-氨 基环己酸、1-氨基环己酸、5-氨基乙酰丙酸、2，6_二氨基庚二酸酯、2,4_二氨基丁酸酯、肌 酸、瓜氨酸、2-羟基-4-氨基丁酸酯、乙胺或1，3-二氨基丙烷、叔丁胺。
[0055] 在一个实施方案中，氨基受体是含羰基化合物例如酮酸、酮或醛。醛可以是例如甘 油醛或戊二醛。
[0056] 在一个进一步的实施方案中，氨基受体还包括通过酶或全细胞过程转换为氨基受 体的物质例如己二酸。己二酸可以通过己二酸半醛脱氢酶转换为1，6_己二醛（己二醛)和6-氧代己酸(己二酸半醛），这两者均可充当氨基受体。
[0057] 在一个实施方案中，本发明的多肽具有约pH 10的最佳pH。
[0058] 在本发明的一个实施方案中，所述多肽与至少一种其他多肽融合。所述至少一种 其他多肽可以是例如增强本发明的多肽的稳定性的多肽，或帮助融合蛋白纯化的多肽。
[0059] 本发明还提供了经分离的和/或外源的多核苷酸，其包含下述中的一种或多种：
[0060] i)SEQ ID N0:3-5或14-20中任一提供的核苷酸序列，
[0061] ii)编码本发明的多肽的核苷酸序列，
[0062] iii)与SEQ ID N0:3-5或14-20中的任何一个或多个至少45%相同的核苷酸序列， [0063] iv)在严格条件下与i)杂交的核苷酸序列，或 [0064] V)与i)至iv)中任一互补的核苷酸序列。
[0065] 在一个实施方案中，所述多核苷酸包含下述中的一种或多种：
[0066] i)SEQIDN0:3、SEQIDN0:4或SEQIDN0:5中提供的核苷酸序列，
[0067] ii)编码权利要求1-13中任一项的多肽的核苷酸序列，
[0068] i i i)与i)至少45 %相同的核苷酸序列，
[0069] iv)在严格条件下与i)杂交的核苷酸序列，或
[0070] V)与i)至iv)中任一互补的核苷酸序列。
[0071] 优选地，所述多核苷酸编码多肽，其编码具有氨基转移酶活性的多肽。
[0072 ]优选地，所述多核苷酸与启动子可操作地连接。
[0073]在本发明的一个实施方案中，多肽包含与SEQ ID N0:3-5或14-20中的任何一个或 多个至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%相同的氨基 酸序列。
[0074]本发明提供了包含本发明的多核苷酸的载体。优选地，所述多核苷酸与启动子可 操作地连接。
[0075] 本发明还提供了包含本发明的多核苷酸或本发明的载体的宿主细胞。
[0076] 宿主细胞可以是任何类型的细胞。在本发明的一个实施方案中，宿主细胞是细菌 或真菌细胞。
[0077] 本发明还提供了用于产生本发明的多肽的方法，该方法包括在允许编码多肽的多 核苷酸表达的条件下，培养编码所述多肽的本发明的宿主细胞或在无细胞表达系统中的编 码所述多肽的本发明的载体，并且回收所表达的多肽。
[0078] 还提供的是使用本发明的方法产生的多肽。
[0079] 本发明还提供了与本发明的多肽特异性结合的经分离的或纯化的抗体。
[0080] 本发明还提供了转基因非人生物例如转基因非人动物或植物，其包含编码本发明 的至少一种多肽的外源多核苷酸。
[0081] 优选地，所述多核苷酸稳定掺入所述生物的基因组内。
[0082] 本发明还提供了本发明的宿主细胞或本发明的转基因非人生物的提取物，其中所 述提取物包含本发明的多肽。
[0083]本发明还提供了包含下述一种或多种或全部的组合物:本发明的多肽、本发明的 多核苷酸、本发明的载体、本发明的宿主细胞、本发明的抗体、本发明的转基因非人生物或 本发明的提取物。
[0084] 本发明还提供了用于催化氨基从氨基供体到氨基受体的转移的方法，该方法包括 使氨基供体和氨基受体与本发明的多肽或本发明的组合物接触。所述多肽可以通过本发明 的宿主细胞产生。
[0085] 在本发明的一个进一步的实施方案中，氨基供体或氨基受体包含至少3个碳。在本 发明的另一个实施方案中，氨基供体或氨基受体包含至少4个碳。在本发明的另一个实施方 案中，氨基供体或氨基受体包含至少9个碳。在本发明的一个进一步实施方案中，氨基供体 或氨基受体包含最高达12、13、14、15、16、17或18个碳。在本发明的另一个实施方案中，氨基 供体或氨基受体包含9-12个碳。在本发明的另一个实施方案中，氨基供体或氨基受体包含 9-13个碳。在本发明的另一个实施方案中，氨基供体或氨基受体包含9-14个碳。在本发明的 另一个实施方案中，氨基供体或氨基受体包含9-15个碳。在本发明的另一个实施方案中，氨 基供体或氨基受体包含9-16个碳。在本发明的另一个实施方案中，氨基供体或氨基受体包 含9-17个碳。在本发明的另一个实施方案中，氨基供体或氨基受体包含9-12、9-13、9-14、9_ 15、9-16、9-17 或 9-18 个碳。
[0086] 本发明还提供了使用具有氨基转移酶活性的基本上纯化的和/或重组的多肽催化 氨基从氨基供体到氨基受体的转移的方法，其中所述氨基供体或氨基受体包含至少9个碳。 在一个实施方案中，氨基供体和氨基受体两者均具有至少9个碳。在一个实施方案中，氨基 供体或氨基受体包含9-12、9-13、9-14、9-15、9-16、9-17或9-18个碳。多肽可以是本发明的 多肽。所述多肽可以通过本发明的宿主细胞产生。
[0087] 上述方法可以进一步包括添加辅因子，例如5 '磷酸吡哆醛(PLP)、PLP_磷酸吡哆 醛、或磷酸吡哆胺。在一个优选实施方案中，所述辅因子是PLP-磷酸吡哆醛。
[0088] 在一个实施方案中，该方法产生工业产品。
[0089] 在一个进一步的实施方案中，该方法进一步包括一种或多种反应以产生工业产 品。例如，脱氨基的氨基供体或胺化的氨基受体可以例如与化合物的一种或多种酶进一步 反应以产生工业产品。
[0090] 所述工业产品可以是下述中的一种或多种或全部:氨基酸、二酸、胺、二胺、酮酸、 二酮酸、酮、二酮、醛、二醛、半醛、氨基醛、多肽、聚胺、聚酰胺、聚酮、聚醛、内酰胺、内酯或脂 肪酸。
[0091] 在一个实施方案中，所述工业产品是氨基酸例如ω-氨基酸例如3-氨基丙酸、4-氨 基丁酸、5-氨基戊酸、6-氨基己酸、7-氨基庚酸、3-氨基庚酸、8-氨基辛酸、11-氨基十一酸、 12-氨基十二酸、3-氨基庚酸、3-氨基异丁酸或其衍生物。在另一个实施方案中，所述工业产 品是氨基酸例如3-氨基庚酸或其衍生物。
[0092] 在另一个实施方案中，所述工业产品是胺，例如1，4_二氨基丁烷、1，5_二氨基戊 烷、1，6_二氨基己烷、6-氨基己烷-1-醇、牛磺酸、酪胺、环己胺、异丙胺、2-氨基茚满或其衍 生物。
[0093] 在另一个实施方案中，所述工业产品是包含羰基的化合物，例如酮酸、酮或醛。醛 可以是例如甘油醛或戊二醛。
[0094] 在另一个实施方案中，所述工业产品是聚酰胺例如尼龙。
[0095] 在另一个实施方案中，所述工业产品是内酰胺。
[0096] 在另一个实施方案中，所述工业产品是多肽。
[0097] 在另一个实施方案中，所述工业产品是官能化的脂肪酸。
[0098] 本发明的方法可以用于产生药学相关的工业产品，例如药学相关的胺、多胺、氨基 酸包括ω -氨基酸、多肽和内酰胺。
[0099] 本发明的方法还可以用于产生聚酰胺例如尼龙。例如，当与己二酸半醛脱氢酶结 合使用时，本发明的多肽可以用于产生尼龙6,6的二酸和二胺组分（左下显示），或可替代 地，由己二酸制备尼龙6(右下）的ω-氨基酸。
[0101]在这个例子中，二胺(六亚甲基二胺)和ω -氨基酸(氨基己酸)可以与尼龙6，6和尼 龙6-样视为工业产品。
[0102] 本发明的方法还可以用于从氨基受体产生工业产品。例如，甘油(散装柴油废物） 衍生物例如甘油醛、二羟基丙酮或酮基丙二酸酯可以用作化学生产的"底物"。
[0103] 本发明的方法还可以用于使脂肪酸官能化。脂肪族脂肪酸可以充当本发明的方法 中的氨基受体。
[0104] 还应认识到氨基供体和氨基受体可以具有不对称中心，并且因此能够以超过一种 立体异构形式存在。本发明因此还涉及在一个或多个不对称中心处以基本上纯的异构体形 式的氨基供体和氨基受体的使用和生产，例如大于约90 %ee，例如约95%或97 %ee或大于 99%ee，以及其混合物包括外消旋混合物。此类同分异构体可以通过不对称合成例如使用 手性中间产物或通过手性拆分进行制备。
[0105] 在一个实施方案中，本发明的方法还可以用于制备对映纯的胺。以对映纯形式的 手性胺是重要的化学构件块，其可以用于例如药物的生产。
[0106] 本发明的多肽可以被突变，并且所得到的突变体就改变的活性例如增强的酶促活 性或改变的底物特异性进行筛选。此类突变可以使用本领域已知的任何技术包括但不限于 位点饱和诱变来进行。
[0107] 因此，本发明还提供了产生多肽的方法，所述多肽具有增强的催化氨基从氨基供 体到氨基受体的转移的能力，或具有改变的底物特异性，所述方法包括：
[0108] i)改变本发明的多肽的一个或多个氨基酸，
[0109] ii)测定得自步骤i)的改变的多肽催化氨基从氨基供体到氨基受体的转移的能 力，和
[0110] iii)选择当与步骤i)中使用的多肽相比较时，具有增强的催化氨基从氨基供体到 氨基受体的转移的能力、或具有改变的底物特异性的改变的多肽。
[0111] 步骤i)可以使用本领域已知的任何合适技术进行，所述技术包括但不限于编码核 酸的定点诱变、化学诱变和DNA改组。
[0112] 还提供的是通过本发明的方法产生的多肽。
[0113] 本发明还提供了用于筛选能够催化来自包含至少9个碳的氨基供体的氨基转移的 微生物的方法，该方法包括：
[0114] i)在包含至少9个碳的氨基供体作为单独的氮源的存在下，培养候选微生物，和
[0115] ii)测定微生物是否能够生长和/或分裂。
[0116] 在一个实施方案中，所述氨基供体包含9-12、9-13、9-14、9-15、9-16、9-17或9-18 个碳。
[0117] 还提供的是使用本发明的方法鉴定的微生物。
[0118] 本发明还提供了包含下述中的一种或多种或全部的试剂盒:本发明的多肽、本发 明的多核苷酸、本发明的载体、本发明的宿主细胞、本发明的抗体、本发明的转基因非人生 物或本发明的提取物。
[0119] 本发明还提供了本发明的氨基转移酶的晶体结构。在一个实施方案中，所述氨基 转移酶具有如SEQ ID N0:1或SEQ ID N0:2中提供的氨基酸序列。
[0120] 本发明还提供了本发明的晶体结构的原子坐标集合或其子集。
[0121]本发明还提供了在附录I中提供的原子坐标集合或其子集。
[0122] 本发明还提供了在其上记录有数据的计算机可读介质，所述数据代表本发明的晶 体结构的原子坐标或其子集;或者附录I中提供的原子坐标或其子集;和/或使用原子坐标 产生的模型。
[0123] 本发明还提供了鉴定与本发明的氨基转移酶结合的化合物的计算机辅助方法，该 方法包括下述步骤：
[0124] i)将候选化合物的结构与通过本发明的晶体结构的原子坐标或其子集，或者附录 I中提供的原子坐标或其子集限定的结构对接，和
[0125] i i)鉴定可以与氨基转移酶结合的候选化合物。
[0126] 在一个实施方案中，所述氨基转移酶具有如SEQ ID NO: 1或SEQ ID N0: 2中提供的 氨基酸序列。
[0127] 在一个实施方案中，该方法进一步包括合成或获得所鉴定的候选化合物，并且测 定化合物是否与氨基转移酶结合。
[0128] 本发明还提供了用于鉴定具有氨基转移酶活性的多肽的计算机辅助方法，该方法 包括下述步骤：
[0129] i)比较通过本发明的晶体结构的原子坐标或其子集，或者附录I中提供的原子坐 标或其子集限定的结构与候选多肽的三级结构的模型，和
[0130] i i)鉴定可能具有氨基转移酶活性的候选化合物。
[0131] 在一个实施方案中，该方法进一步包括合成或获得所鉴定的多肽，并且测定多肽 是否催化氨基从氨基供体到氨基受体的转移。
[0132] 本文的任何实施方案应在细节上作必要的修改，以应用于任何其他实施方案，除 非另有具体说明。
[0133] 本发明在范围中并不限于本文描述的具体实施方案，其仅旨在用于例证的目的。 显然功能上等价的产物、组合物和方法在本发明的范围内，如在本文描述。
[0134] 本发明在下文通过下述非限制性实施例且参考附图进行描述。
【附图说明】
[0135] 图1 ·使用祖先重建(ancestral reconstruction)产生的多肽的比对。
[0136] 序列表的注解
[0137] SEQ ID N0:l:p6的氨基酸序列。
[0138] SEQ ID N0:2:p7的氨基酸序列。
[0139] SEQ ID N0:3:p6的核苷酸序列。
[0140] SEQ ID N0:4:p7的核苷酸序列。
[0141] SEQ ID N0:5:具有单个点突变的p7的核苷酸序列。
[0142] SEQ ID N0:6:p4的氨基酸序列。
[0143] SEQ ID N0:7:p7N6的氨基酸序列。
[0144] SEQ ID N0:8:p7N15的氨基酸序列。
[0145] SEQ ID N0:9:p7N16的氨基酸序列。
[0146] SEQ ID N0:10:p7N17的氨基酸序列。
[0147] SEQ ID N0:ll:p7N43的氨基酸序列。
[0148] SEQ ID N0:12:p7N48的氨基酸序列。
[0149] SEQ ID N0:13:GabT( γ-氨基丁酸转氨酶;E.C.2.6.1.19)的氨基酸序列。
[0150] SEQ ID Ν0:14:ρ4的核苷酸序列。
[0151] SEQ ID Ν0:15:ρ7Ν6的核苷酸序列。
[0152] SEQ ID N0:16:p7N15的核苷酸序列。
[0153] SEQ ID N0:17:p7N16的核苷酸序列。
[0154] SEQ ID N0:18:p7N17的核苷酸序列。
[0155] SEQ ID N0:19:p7N43的核苷酸序列。
[0156] SEQ ID NO :20:p7N48的核苷酸序列。
【具体实施方式】
[0157] 一般技术和定义
[0158] 除非另有具体定义，否则本文使用的所有技术和科学术语均应视为具有与本领域 (例如细胞培养、分子遗传学、免疫学、免疫组织化学、蛋白质化学、多肽和聚酰胺的生产、以 及生物化学)普通技术人员通常理解相同的含义。
[0159] 除非另有说明，否则本发明中利用的重组蛋白质、细胞培养和免疫学技术是本领 域技术人员众所周知的标准程序。此类技术在例如下述来源中的参考文献自始至终得到描 述和说明：J.Perbal，A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984)，Maniatis等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbour L