新型生物催化剂组合物和使用的方法
【专利说明】
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 要求以下美国临时专利申请号的优先权：
[0003] 61/689, 921，提交于 2012 年 6 月 15 日；
[0004] 61/689, 922,提交于 2012 年 6 月 15 日；
[0005] 61/689, 923,提交于 2012 年 6 月 15 日；
[0006] 61/689, 924,提交于 2012 年 6 月 15 日；
[0007] 61/689, 925,提交于 2012 年 6 月 15 日；
[0008] 61/689, 929,提交于 2012 年 6 月 15 日；
[0009] 61/689, 930,提交于 2012 年 6 月 15 日；
[0010] 61/689, 932,提交于 2012 年 6 月 15 日；
[0011] 61/689, 933,提交于 2012 年 6 月 15 日；
[0012] 61/689, 935,提交于 2012 年 6 月 15 日；
[0013] 61/689, 939,提交于 2012 年 6 月 15 日；
[0014] 61/689, 940,提交于 2012 年 6 月 15 日；
[0015] 61/689, 943,提交于 2012 年 6 月 15 日；
[0016] 61/689, 945,提交于 2012 年 6 月 15 日；
[0017] 61/689, 953,提交于 2012 年 6 月 15 日；
[0018] 61/849, 725,提交于 2013 年 2 月 1 日；
[0019] 61/850, 631，提交于 2013 年 2 月 20 日；
[0020] 61/851，467,提交于 2013 年 3 月 8 日；和
[0021] 61/852, 451，提交于 2013 年 3 月 15 日，
[0022] 其中每个专利据此全文引入以供参考。藉此保留权利以具有基于公法112-29的 适用部分做出的专利性判定。
[0023] 有关联邦资助的研宄或开发的声明
[0024] 利用国立卫生研宄院资助的根据1R43ES022123-01合同的政府支持，首次使利用 生物催化剂连续降解水中超低浓度的1，4-二噁烷得以实现。政府对其具有某些权利。
技术领域
[0025] 本发明涉及新型生物催化剂及其用途。
【背景技术】
[0026] 代谢方法被提议用于合成代谢和分解代谢生物转化很长时间。多种类型的微生物 已被提议用于这些生物转化，包括细菌和古细菌（这两者均为原核生物）真菌和藻类。代谢 方法为自然所利用，并且一些已被人改造使用上千年用于合成代谢和分解代谢生物转化， 范围从培养酸奶和发酵糖以产生醇到处理水以除去污染物。代谢方法提供在相对低成本处 理设备中的低能耗、高效率生物转化的可能性并且因此可能并且常常作为化学合成和降解 方法的可行替代形式。合成代谢方法常常可使用从可更新或环境立场来看是优选但对化学 合成不理想的原材料，例如，二氧化碳至生物燃料和其他生物产物的转化。分解代谢生物转 化可降解物质并且长久以来被用于废水处理。对改善工业使用的代谢方法和扩大化学合成 和降解的替代形式的代谢方法的种类存在极大兴趣。
[0027] 已提出许多类型的方法技术用于合成代谢和分解代谢生物转化。这些方法包括使 用悬浮微生物，即浮游方法。另外，还公开了使微生物位于固体载体之上或之内的方法技 术。
[0028] 在改善代谢方法并且提供经济可行性足以带来商业利益的代谢方法时，工作人员 面对各种挑战。一些问题可能是给料自身所固有的，包括毒素、噬菌体和外来竞争微生物的 存在。其他问题可能源于用于生物转化的微生物，例如低代谢转化率、低种群生长率、自发 突变、大量消耗物质以支持种群生长，对诱导物、共代谢物、促进剂和性能增强添加剂的需 要，以及具有所寻求的代谢转化的微生物的缺乏。并且其他问题可能源于用于生物转化的 方法，例如从水性发酵液中回收生物产物时的成本。尤其采用受支撑微生物时，问题可能源 于生物膜的不稳定性，包括它们的物理降解；导致窒息的微生物的种群的过度生长；微生 物从支撑体上剥离；和易受竞争微生物影响。另外，代谢方法特征为从死亡或裂解细胞产生 固体碎片，并且该碎片需要被纳入该方法以去除这些固体。在某些情况下，碎片具有作为进 料补充物的价值，例如来自乙醇生产的酒柏，但在其他代谢方法中，例如对于市政废水的处 理，以环境可接受方式处理碎片可能产生成本。提议用于克服一种或多种这些问题的基因 工程可能其自身就存在问题。
[0029] 包括但不限于细菌、古细菌、真菌和藻类的微生物能够附着或附着于表面。已经进 行一些研宄关注于浮游生长至微生物在表面生长（包括在表面形成生物膜）的变化的影 响。许多工作人员已研宄在动物或人类身体中阻止或降解生物膜以提高抗生素治疗的效力 以治愈动物或人类身体。
[0030] Tuson 等人，"Bacteria-surface Interactions"，Soft Matter，第 1 卷，期号 608 (2013)，可引用为DOI: 10. 1039/c3sm27705d，提供一篇细菌和表面相互作用的研宄综 述。作者描述涉及将微生物附着到表面的方法并且详述表面的附着导致细胞中表型切换 并且该表面可向附着细胞提供有益效果。作者详述，有机物质可在水平表面上浓缩以刺激 与表面结合的细菌的生长，并且增加的底物表面积提供了可在其上吸收营养物质的更多面 积，使得细胞能在通常太低而不能支持生长的低营养物质浓度下生长。作者还陈述，除了有 助于营养物质捕获的表面附着，一些细菌直接从它们附着的表面获得必要的代谢物和辅因 子。
[0031] 该文章中报道的一些观察结果包括：在表面上孕育细胞生长成群落可保护细胞免 受捕食和其他环境威胁并且有助于基因型的保存。作者详述，在微生物形成生物膜的情形 下，已观察到对抗生素治疗的抗性。该抗性已归因于以下一种或多种：生物膜基体的屏障功 能，非活性耐药株细胞和高抗性菌落变体的存在，和若干生物膜特异性抗菌素耐性基因的 上调中。一组工作人员已假定由于降低细菌细胞上的净负电荷并且增强膜的稳定性的主要 机制，未与生物膜结合的一些附着细胞具有抗生素抗性。Tuson等人指出了在一篇文章中得 出结论：细菌对表面的附着改变了其代谢状态并且降低了抗生素易感性，这是细菌在细胞 生长的静止期的常见特征。
[0032] 关于涉及细菌与表面结合的细胞活性，作者论述表面感测为群集的前提，而群集 为重要的适应性行为，在群集中细胞和表面之间的接触为形态学改变设定了计划，而形态 学改变则有助于协助行为、迅速群落生长和群落的迀移。细菌群落如群集或生物膜中的细 胞以若干不同方式彼此相互作用。细菌能够在称为群体感测的过程中通过使用小分子化学 ?目使进行通?目。
[0033] "细菌群落中细胞的致密堆积有助于并且增加了在细胞间转移信息并且触发生理 改变的小分子的浓度。紧邻表面的化学梯形增强了在附着至表面的生物膜和群落内的化学 信息的交换。"
[0034] Cho 等人，在 " Se I f-〇r gani zat ion in Hi gh-Dens i ty Bac ter i al Colonies:Efficient Crowd Control"，PL0S Biology，Vol.5，Issue 11，2007 年 11 月，第 2614页至第2623页中，提及他们的发现，微室中的大肠杆菌进行通信以针对从微室的约束 中逃逸来提供菌落生长，而在出口没有潜在地"蜂拥（stampede) "状阻塞并且提供通道以有 助于营养物质运输到菌落内。
[0035] Tuson等人还描述形成细胞对表面的附着的步骤。初始附着是可逆的并且涉及流 体动力学和静电相互作用，并且附着的第二步骤是不可逆的并且涉及细胞外壁的疏水区域 与表面之间的范德瓦尔斯相互作用。通过产生细胞外聚合物质有助于不可逆附着。
[0036] "热力学在细菌至表面的结合的调控中起到核心作用。当细菌的表面能大于它们 悬浮于其中的液体的表面能时，细胞优选附着至亲水性物质（即，具有大表面能的物质）。 细菌的表面能通常小于细胞悬浮于其中的液体的表面能，并且该失配导致细胞优选附着至 疏水物质（即，具有较低表面能的物质）。细菌能够附着至各式各样不同的物质，包括玻璃、 铝、不锈钢、各种有机聚合物，以及所需的材料，例如特氟隆?。"
[0037] Tuson等人报道，表面感测触发多种细胞变化。许多变化是形态上的并且有助于对 表面的附着。他们陈述：
[0038] "有趣地，表面的物理性质可能影响细胞形态和群落结构。"……"细胞均匀附着到 疏水表面，形成微菌落，并且生长成紧密堆积的多层生物膜。极少的细胞附着至亲水表面， 并且细胞分裂中的变化导致形成>100 ym长的细胞链。这些链变得松散缠结以形成相对非 结构化和较不致密堆积的生物膜。"
[0039] Tuson等人在其结束语中陈述：
[0040] "我们对细菌在表面的相互作用的理解极不完整。这一主题似乎理想上适合微生 物学家和材料科学家、化学家和工程师之间的合作，原因是其将得益于被制订以渗透到多 个领域的多学科方法，包括：（1)鉴别细菌感测的表面的特性；（2)阐明细菌用于发送表面 和它们的生化响应的分子机制；和（3)确定如何调节表面性质以引起所需细胞响应，包括 形态改变、生物力能学改变，或细胞死亡。"
[0041] 有许多提议用微生物的固体载体或支撑体来影响众多合成代谢和分解代谢生物 转化；然而，尽管通过使用固体提供了潜在的方法优点，但商业成功限于相对少的应用。已 提出提议用于将微生物支撑在载体的表面上或载体的孔中并且用于将微生物定位在载体 内 ° 参见例如 Zhou 等人，"Recent Patents on Immobilized Microorganisms Technology and Its Engineering Application in Wastewater Treatment， Recent Patents on Engineering，2008, 2, 28_35〇
[0042] 通常，由于生物活性，例如载体上形成的生物膜的不稳定性和细胞群的死亡和恶 化，产生固体碎片。例如，Sato等人在美国专利6, 610, 205中公开使用热塑性微生物载体 使有机废水硝化和脱氮的方法。专利权人声称单个载体可影响需要需氧和厌氧条件的生物 转化。一旦形成，载体接触含有微生物的活化油泥接触。专利权人陈述，硝化细菌在载体的 表面上"浓密生长"，脱氮细菌被"吸附到载体上并因而牢固固定在其上"。他们的图1示出 使用载体的设备并且包括沉降槽9以移除油泥（sludge)。因此，这种方法似乎需要从支撑 体或载体上移除碎片的器件。
[0043] -些工作人员已形成微生物和聚合物的水性（aqueous)混合物作为溶液、分散体 或乳液。一些工作人员喷雾干燥该混合物并且其他人提议交联以获得在固体结构的内部含 有微生物的固体结构。提供以下讨论作为提议由也含有微生物的水性介质（medium)形成 固体结构的示例。
[0044] Hino等人在美国专利4, 148, 689中公开通过将微生物分散在某些均相溶胶中随 后使该混合物胶凝并且对其进行化学处理或通过干燥获得干凝胶，来在亲水性复合凝胶中 使用微生物。干凝胶据说具有所需强度并且由胶凝水溶性聚合物如天然聚合物、聚乙烯醇、 聚乙二醇和聚乙烯亚胺和二氧化硅构成。实例中所用干凝胶似乎产生了生物转化，但活性 比悬浮细胞发酵低。大多数实例似乎显示出短时间例如小于30小时的生物活性。似乎报道 较长时间的活性的那些实例也显示随时间推移而失活。实际上，专利权人理解他们的干凝 胶的优点在于该聚合物可在失活之后被回收并且再循环。参见第9列，第66行起之各行。
[0045] Fukui等人在美国专利4, 195, 129中公开微生物细胞与光固化树脂混合并且辐照 该混合物以提供含有固定细胞的固化产品。该实例的产物不具有游离细胞悬浮液的生物活 性。专利权人未提供有关长时间内固定细胞性能的任何数据。
[0046] Yamada等人在美国专利4, 546, 081中公开一种用酵母连续发酵以产生醇的方法。 酵母固定于薄膜中，而薄膜随后被设置在发酵容器内。专利权人详述用于制备含酵母的膜 的多种不同技术。虽然存在其中酵母和聚乙烯醇的混合物通过辐射胶凝并且成型为所需形 状的方法，但该专利中未特别详述各种技术制备的膜之间的性能差异。
[0047] Ishimura等人在美国专利4, 727, 030以获得含有微生物细胞的模制的多孔器件 作为目的。他们公开用于固定酶或细胞的方法，其中该酶或细胞与聚乙烯醇和活性炭混合， 并随后该混合物部分干燥，然后模制并且在规定条件下进一步脱水。该多孔凝胶据说在水 合后具有极小膨胀。
[0048] 在二十世纪90年代，日本研发出称为Pegasus方法的一种方法，参见例如Stowa Pagasus/Pegazur/Bio-tube Process Sheets，2006年6月 13 日，其使用由聚乙二醇和硝化 的活化油泥的混合物构成的有机凝胶小球。还可参见美国专利4, 791，061，其与本文中参考 的KR9312103属于相同专利家族。小球据说具有3毫米直径并且15%聚乙二醇和2%微生 物，并且生物膜厚度约60微米。该专利公开由含有活化油泥和预聚物的混合物制备小球并 且将该混合物滴入多价金属离子和过硫酸盐的水溶液以形成具有固定微生物的粒子。该方 法声称减少了在形成小球时微生物活性的损失。
[0049] Chen等人在美国专利5, 290, 693中将微生物或酶固定在聚乙烯醇的小珠上。他们 形成聚乙烯醇和微生物的混合物并且随后使用硼酸和随后的磷酸或磷酸盐来进行两阶段 胶凝和硬化步骤。专利权人陈述他们的方法提供了强效小珠，并且对被固定的微生物或酶 无害。实例是指导性的。例如，实施例1涉及制备和使用用于使含有IOOppm硝酸钾的水脱 氮的小珠。他们在于第5列，第7至11行描述：
[0050] "在第七天，固定微生物的脱氮速率达到0. 65mg NO^-N/g gel/h(sic)，其维持不 变直至第30天。微生物的生化活力维持稳定。"
[0051] 用于制备小珠的溶液含有约25g/L的脱氮油泥微生物。该实例似乎表明，需要微 生物的种群的7天的生长来实现活性，并且30天之后，丧失稳定活性。该实例中报道的比 较性对照物（其仅使用硼酸来凝胶和硬化PVA)提供0. 55mg N03_-N/g gel/h的脱氮速率并 且在15天之后变得不稳定。实施例2和3报道用于分别延续10和20天的连续操作的数 据。实施例4涉及使用酿酒酵母（Sacchramyces cerevisa)(约15g/L，在与聚乙稀醇的混 合物中）生产乙醇并且报道与含有在乙醇生产中比未支撑酵母稍微低级的固定微生物的 小珠一起使用仅8个小时。
[0052] Nagadomi 等人在"Treatment of Aquarium Water by Denitrifying Photosynthetic Bacteria Using Immobilized Polyvinyl Alcohol Beads''， Journal of Bioscience and Bioengineering，87, 2,189-193 (1999)中确认 Chen 等人的观察结果。他 们发现硼酸对微生物有害。他们还观察到了固定在海藻酸盐小珠和聚乙烯醇小珠中的微生 物的种群的生长。作者报道的该数据未延续超过15天的操作。
[0053] Willuwait等人在美国专利7, 384, 777B2中在聚合物基材中固定细菌。该基材用 于微生物的控释。如在第3列第63至67行所解释：
[0054] "借助于清洗方法，微生物繁殖，直至已达到胶囊/球体或凝胶的容纳能力并且壁 破裂，即释放微生物。"
[0055] 因此，并不令人意外的是，导致改善代谢方法的大量活性集中于（例如通过基因 工程）改变微生物的基因型。基因型的改变常常成本高昂并且需要大量时间以从微生物获 得所寻求的性能。通常，大多数基因工程微生物缺乏稳健性，例如，生长缓慢并且对侵入性 微生物处于竞争劣势并且在按比例扩大足以填充商用级别生物反应器的数量期间和在生 物转化方法本身期间丧失质粒。另外，基因工程微生物可能必须被谨慎控制以便不逃逸到 环境中，并且对使用基因工程微生物的代谢方法的碎片进行处置可能产生危害性废物。
【发明内容】
[0056] 本发明的含微生物生物催化剂具有不可逆地保留在生物催化剂的内部中的微生 物的大型种群，并且生物催化剂具有微生物的意外稳定种群，并因此具有稳定的生物活性， 以及基本上不存在由微生物的代谢活性所致的碎片生成，并且生物催化剂可在很长时间段 内具有这些现象。这些现象与通常的预期相反，即，微生物从物理限制区域逃逸或该物理限 制区域变得阻塞或被过度增殖，引起代谢活动的丧失以及微生物种群的最终死亡。
[0057] 本发明的生物催化剂中的微生物具有表型改变，这与生物催化剂的内部的含腔体 结构结合产生了高度有利的生物催化剂，包括但不限于从微生物和其种群的生长至生物转 化活动（合成代谢或分解代谢）的代谢转变；对毒素增强的耐受性；进入甚至时间延长的 实质静止状态的能力增强；和有效生物转化底物的能力增强。这些表型改变显著地增加至 以下事实：影响生物转化的微生物被保留在生物催化剂的内部中，以提供有利的代谢方法， 尤其是这样的代谢方法，其中本发明的生物催化剂在优选至少约3个月、优选至少约6个月 并且很多情况下超过12