一种来源于宏基因组的低温酯酶、编码基因及其应用的制作方法

本发明涉及生物技术和生物工程领域，具体涉及一种来源于土壤宏基因组的低温酯酶est18及其编码基因和应用。

背景技术：

酯酶广泛存在于动物、植物及微生物中，是一类催化水解或形成酯键的酶，作用的底物通常是脂肪链小于十个碳原子的酯类。酯酶属于α/β折叠水解酶超家族，催化中心一般由丝氨酸、天冬氨酸/谷氨酸和组氨酸组成，保守序列为丝氨酸附近的五肽(gxsxg)序列。酯酶能催化水解、酯化、转酯化等多种化学反应，是一种很重要的工业生物催化剂，被广泛运用于精细化工、洗涤、医药、食品、造纸、皮革加工、纺织、废水处理和饲料工业等领域。从催化特性来看，酯酶具有高度的化学选择性和立体异构选择性，且反应不需要辅酶、反应条件温和、副产物少。在生产应用中的酯酶的另一显著特点是它能在异相系统（即油-水界面）或有机相中作用。在水相中，酯酶通常催化水解反应，而在有机相中，它却能催化酯化和转酯化反应。

宏基因组，又称元基因组，是指生境中全部微小生物遗传物质的总和。因为宏基因组技术是将直接提取的环境微生物基因组dna克隆于不同的载体并转入合适的宿主，通过不同的筛选技术筛选并获得新基因或生物活性类物质，所以该技术实际上绕过了微生物培养环节，能够更好地开发和利用未培养微生物资源，为工业、农业或各方面提供了更广阔的基因库。目前，越来越多的专利酶类是来自于宏基因组文库，它们可适用于食品、化工、医药等领域。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种来源于泰山土壤宏基因组的新的低温碱性酯酶est18、编码基因及其制备方法，该酯酶可用于酯键的水解，尤其是短链酯类的水解。

本发明从泰山土壤宏基因组文库中，通过特异性底物三丁酸甘油酯利用功能筛选方法(function-drivenscreening)从中筛选到一株表现出酯酶活性的菌株ts-est18，利用生物信息学分析方法，分析得到一个酯酶基因est18。该基因全长为957bp（从起始密码子到终止密码子），编码318个氨基酸。通过pcr的方法，将克隆得到酯酶基因est18与表达载体pet-30b(+)连接后得到重组质粒pest18，经大肠杆菌bl21(de3)plys诱导表达后，得到了重组酯酶est18。est18是低温碱性酯酶，在温度40℃以下时相对稳定，最适温度20℃，在ph6-11范围内稳定，最适ph为8，ph11时的最大活性>80％。包含该基因的重组菌株保藏在位于武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccm2017317，菌株分类为escherichiacoli。

本发明的第一个目的是提供一种编码所述的酯酶est18的酯酶基因est18，所述的酯酶基因est18的核苷酸序列如seqidno.1所示。

本发明的第二个目的是提供一种酯酶est18，其氨基酸序列如seqidno.2所示。

本发明还提供一种含有所述的酯酶基因est18的重组表达载体。所述的表达载体，优选pet-30b(+)载体。

本发明还提供一种含有所述的酯酶基因est18的基因工程菌。所述的基因工程菌，优选大肠杆菌escherichiacolibl21(de3)plys。

本发明的第三个目的是提供一种制备低温碱性酯酶est18的方法，包括以下步骤：

1)用上述重组载体转化宿主细胞escherichiacolibl21(de3)plys。，得重组菌株；

2)培养重组菌株，诱导重组酯酶表达；

3)回收并纯化所表达的酯酶est18。

本发明所述低温碱性酯酶est18来自泰山土壤宏基因组（宿主菌未知），其氨基酸序列如seqidno.2所示：

mstldpklfsdkaiapetravndaiiaamtgmpewwdvgaaktraarargegifpaaakserarwieidgpagkvplrviapenprgvylhihggghvlgaadqqdrllerisnetrltaisveyrlapenpypagpddceaaalwvnehaadfgghkiaiggesagahlsaltilrlrdkhgltpfnaanlvfgvfdlgmtpsarafgderlvlrtrdiekfgeaflpgtddeqkrapefsplyanlaglcpalftigtrdallddslfmharwvaagnvgeldiypggchgfiafpypqafasiarqatflnaalg

本发明还提供上述的低温碱性酯酶est18在催化酯类水解、酯化或转酯化反应中的应用。优选的短链脂肪酸酯为具有c2-c8短碳链的对硝基苯酚酯，例如对硝基苯乙酸酯、对硝基苯丁酸酯，对硝基苯辛酸酯等，其中底物为对硝基苯丁酸酯（c4）时催化活性最高。

酯酶est18为一种低温碱性酯酶，共含有318个氨基酸，在20-45℃间的酶活力达80%以上，温度大于50℃时酶活性急剧下降。最适ph为8.0，在ph11的缓冲液中保温20min仍然保存80%以上的酶活，在ph值7-11之间有较高酶活性，优选为7.0~9.0。1mm的cu²⁺、fe²⁺和zn²⁺对est18的酶活产生强烈的抑制作用，而ca²⁺，mg²⁺，ni²⁺和co²⁺，以及金属螯合剂edta均对酶活有增强作用。

本发明从泰山土壤宏基因组文库中筛选得到新的酯酶基因，发现该基因编码的蛋白在20℃时稳定高效，50℃时迅速失活（便于酶促反应控制），同时在碱性环境中表现出较高稳定性和活性。因此本发明的低温碱性酯酶可在食品、化工、洗涤、制药等工业中应用，以降低生产温度减少能耗。

附图说明

图1：在e.coli中表达的重组酯酶est18的sds-page分析。泳道m为蛋白质marker，泳道a为酯酶est18诱导前的可溶性组分，泳道b为酯酶est18诱导后的可溶性组分，泳道c为酯酶est18纯化后的蛋白。

图2：重组酯酶est18最适反应ph。

图3：重组酯酶est18最适反应温度。

图4：重组酯酶est18的热稳定性。

图5：二价阳离子对酯酶est18活性影响。

图6：有机溶剂、变性剂和螯和剂对est18活性影响。

具体实施方式

实施例1：酯酶基因est18的获取

以三丁酸甘油酯为底物从泰山土壤宏基因组文库中筛选并纯化得到表现出酯酶活性的菌株ts-est18。提取ts-est18的质粒dna，经亚克隆测序得到插入片段的序列信息。利用生物信息学方法对基因信息进行注释，分析并确定了其中酯酶基因的开放阅读框（openreadingframe,orf），将该orf命名为est18，其基因序列如seqidno.1所示，全长为957bp（atg起始，tag终止），其编码的酯酶est18的氨基酸序列如seqidno.2所示，共318个氨基酸。

实施例2：酯酶基因est18的克隆、重组载体及重组菌株的构建

将本发明获得的酯酶基因est18克隆到表达载体上，构建重组表达载体。根据分析得到的酯酶基因序列，利用primer5软件设计扩增酯酶全基因的上游引物forwards（5’-ccaagctttccggtttttgacgaagcgc，bamhi）和下游引物reverse（5’-cgggatccgagcgcgatccgcaaactag，hindiii）。使用以下pcr扩增程序扩增酯酶基因est18：94℃预变性3min；94℃变性1min，复性温度56℃1min，72℃延伸1min，进行25个循环；循环结束后72℃延伸10min，4℃10min，扩增目的片段的长度约为1kb。纯化后的pcr产物经bamhi和hindiii双酶切，割胶回收后与bamhi和hindiii双酶切的质粒pet-30b(+)连接，转化大肠杆菌dh5α，通过卡那霉素抗性及三丁酸甘油酯活性筛选得到阳性克隆。抽提阳性克隆的质粒得到重组载体pest18，经双酶切及测序鉴定插入片段同seqidno.1。包含重组载体pest18的大肠杆菌escherichiacolidh5α菌株保藏在位于武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccm2017317，保藏日期为2017年6月8日。

实施例3：表达酯酶est18的基因工程菌的构建

3.1大肠杆菌bl21(de3)plys感受态细胞制备

1.将少量大肠杆菌bl21(de3)plys菌种接入3mllb试管液中，200rpm、37℃过夜培养；

2.按1%体积比的接种量将试管中的菌液接种到200mllb摇瓶中，200rpm、20℃过夜培养；

3.将培养好的摇瓶在冰水中迅速冷却至4℃，分装至冰预冷的离心管(50ml)，冰浴数分钟；

4.4℃、4000rpm离心10min回收细胞，弃上清；

5.用冰预冷的10ml0.1m的cacl2重悬细胞，4℃4000rpm离心10～15min回收细胞；

6.重复5，用10ml0.1m的cacl2重悬细胞，冰浴30min以上；

7.4℃，4000rpm离心10min回收细胞；

8.每50ml原培养物用1ml的0.1mcacl2重悬后，在加入1ml50%的甘油混匀后，分装于1.5ml离心管，50～100μl每管。-80℃保藏。由此得到大肠杆菌bl21(de3)plys感受态细胞。

3.2转化

取实施例2中得到的pest18质粒0.5～1μl与50μl大肠杆菌bl21(de3)plys感受态细胞混合，冰浴30min，于42℃水浴锅热激90s，冰浴2min后加入500μllb液体培养基，37℃200rpm培养45min。培养物离心后涂布于含有50μg/ml的卡那霉素的lb平板，由此得到含有pest18的大肠杆菌bl21(de3)plys。

实施例4：酯酶est18的表达和纯化

4.1蛋白诱导表达

含有pest18的大肠杆菌bl21(de3)plys在200ml的lb培养基中37℃培养至od600为0.4-0.6时，加iptg至终浓度0.2mm，20℃培养过夜。每50ml菌液4000rpm、4℃离心10min，收集菌体，并2ml(20mm，ph7.4)pbs缓冲液（kh2po4-k2hpo4）重悬菌体，超声波破碎15min分钟，离心，收集上清。

4.2酯酶est18的纯化与sds-page电泳

用his亲和层析柱纯化4.1中收集的上清，具体实施方案如下：

1.his亲和层析柱的ni²⁺结合和bindingbuffer（20mmpbs缓冲液，5mm咪唑和500mmnacl并用0.22μm过滤器过滤）的平衡。加入（0.5倍柱体积）0.1mniso4溶液进行ni²⁺的相应结合，填充完后，加入dh2o（已用0.22μm过滤器过滤）洗涤未结合的ni²⁺，再用5倍柱体积的bindingbuffer进行平衡。

2.酯酶est18蛋白的纯化。平衡后上样，样品为4.1中收集的上清（上清中的盐浓度和咪唑浓度与bindingbuffer相同）10ml，以5倍柱体积的bindingbuffer洗去未结合（杂蛋白）蛋白。然后洗脱，洗脱体积为20ml（在这20ml内，elutionbuffer（20mmpbs缓冲液，500mm咪唑和500mmnacl并用0.22μm过滤器过滤）和bindingbuffer在该步骤进行混合，elutionbuffer比例逐渐增大，使咪唑浓度从5mm匀速增加到500mm）；最后再用5倍体积elutionbuffer完全洗脱，收集蛋白峰(1ml/tube)。

3.检验收集的蛋白洗脱液的酯酶活性。在含有三丁酸甘油酯的lb培养皿底部划上小方格，然后对每个格进行标号，将收集的洗脱液各取10μl，然后根据序号加入相应的小格子内，置于37℃培养箱内正放培养3h左右即可观察到结果（含有酯酶est18蛋白的洗脱液会有水解圈）。

4.对收集的洗脱液进行脱盐和浓缩。用超滤管（默克密理博merckmillipore）进行脱盐和浓缩，具体操作方法参照默克密理博merckmillipore公司的操作手册进行。

5.酯酶est18的sds-page电泳。将纯化的酯酶进行sds-page凝胶电泳（图1），得到纯化的酯酶est18，纯化的蛋白大小约37kda，符合理论预期。

4.3酯酶est18活性测定

酯酶est18活力测定采用对硝基苯酚酯，具体方法如下：

1用二甲基亚砜（dmso）配制200mm的对硝基苯酚酯；

2在1ml反应体系中加980μl50mmtris-hclbuffer（100mmnacl，50mmtris-hcl，0.3%（v/v）tritonx-100，ph8.0），10μl对硝基苯酚酯，10μl纯酶液（稀释100倍后的浓度0.012276μg/μl）；

3使用分光光度计在400nm吸光度下检测游离的对硝基苯酚的含量，在该条件下测定对硝基苯酚含量的消光系数为16,642m^-1cm^-1（即ε=16,642m^-1cm^-1）。酶活性单位的定义是在标准条件下（25℃，101.325kpa）每分钟生成1μmol对硝基苯酚所需的酶量。

实施例5：酯酶est18的底物特异性分析

按照4.3的测定条件，比较酯酶est18水解不同长度酰基的对硝基苯酚酯的活性。底物采用对硝基苯乙酸酯（c2）、对硝基苯丁酸酯（c4），对硝基苯辛酸酯（c8）。结果表明，est18对酰基碳链较短的对硝基苯酚酯具有催化活性，其中底物为对硝基苯酚丁酸酯（c4）时催化活性最高。

实施例6：酯酶est18的最适反应条件分析

酯酶est18的最适反应ph在4.0~11.0范围内测定。配制不同的缓冲溶液，其中hac-naac缓冲液ph为4.0-6.0，k2hpo3-kh2po3缓冲液ph为6.0-8.0，h3bo3-na2b4o7缓冲液ph为7.4-9.0，na2co3-nahco3缓冲液ph为9.0-11.0。这些不同ph的缓冲溶液浓度均为50mm。将4.3中测定条件所述的缓冲液(tris-hclbuffer)用配制的缓冲溶液分别进行替换，测定重组酯酶est18的酶活力，底物为对硝基苯酚丁酸酯。ph对重组酯酶est18活性的影响结果见图3。在50mm的h3bo3-na2b4o7缓冲液ph8.0时，酯酶est18的酶活性最高，ph值在7.0–11.0之间有较高的酶活性。当ph低于7.0时，其活性迅速降低（图2）

酯酶est18的最适反应温度在20~70℃范围内测定。使用4.3中测定条件所述的50mm缓冲液(tris-hclbuffer)ph8.0作为缓冲液，对硝基苯酚丁酸酯作为底物，按照4.3中的反应体系，在不同温度下测定酶活。结果表明，est18为低温酶，温度越低反应速度越高，在20-45℃间的酶活力达80%以上，温度大于50℃时酶活性急剧下降（图3）。

实施例7：酯酶est18酶学稳定性分析

酯酶est18的热稳定性在20~50℃范围内测定。将纯化后的酶液分别保温在20、30、40、45和50℃下，间隔一定时间取出按4.3所示检测方法测定酶活性，结果见图4。酯酶est18随着处理温度的升高，酯酶残余酶活力逐渐下降，当温度高于50℃时酶活性急剧降低，在50℃处理5min后，残余酶活力基本丧失（图4）。

二价阳离子酯酶est18活性影响的测定。在反应体系中分别加入1mm的fe²⁺、zn²⁺、cu²⁺、mn²⁺、ca²⁺、mg²⁺、ni²⁺和co²⁺，在室温下孵育20min，按4.3测定方法（以对硝基苯酚丁酸酯作为底物）测定相对酶活，以未添加任何离子的反应体系中的酶活力为100%。结果表明，与对照相比，低浓度的fe²⁺、zn²⁺和cu²⁺对酯酶催化对硝基苯酚丁酸酯的活力有不同程度的抑制作用。而mn²⁺对酯酶est18酶活力的影响很小，低浓度ca²⁺、mg²⁺、ni²⁺和co²⁺对酯酶est18酶活力有增强效果（图5）。

有机溶剂和变性剂等对est18活性影响的测定。在反应体系中分别加入15%（v/v）和30%（v/v）有机溶剂（甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮和二甲基亚砜dmso）、1%变性剂（十二烷基硫酸钠sds、吐温20）及螯合剂（10%edta）孵育20min后，按4.3测定方法（以对硝基苯酚丁酸酯作为底物）测定相对酶活，以原始反应体系中的酶活力为100%。结果表明，所测有机溶剂对est18的活性有不同程度的抑制，且随着有机溶剂浓度的增大，抑制程度增强。变性剂对酶活的抑制是非常强烈的，加入1%的sds孵育20min后仅剩下0.14%的活性。但是est18在螯合剂edta（122%）存在下酶活性有较大的增加（图6）。

sequencelisting

<110>武汉轻工大学

<120>一种来源于宏基因组的低温酯酶、编码基因及其应用

<160>2

<210>seqidno.1

<211>957

<212>dna

<213>environmentaldna

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gaacgcgcgcgctggatcgagatagatgggcccgccggcaaggtgccgttgcgcgtcatc240

gcgccggaaaatccgcgcggcgtatatctgcacattcacggcggcggccacgtgttgggc300

gccgcggatcaacaggatcggttgctcgagcgcatctcaaacgaaaccaggctgacggcg360

atcagcgttgagtatcgcttggcgccggaaaatccctatcccgctgggcccgacgattgt420

gaagcggcggcgctttgggtgaacgagcatgcggcggattttggcggccacaagattgcc480

atcggcggcgaaagcgcgggcgcgcacctgtcagcgctgactattctgcgcttgcgcgac540

aagcatgggctgacgcccttcaatgcggcgaaccttgtgttcggcgttttcgatttggga600

atgacgccaagtgcgcgcgcgtttggcgatgagcggctggtcttgcgcacgcgcgacatc660

gagaagttcggcgaggcgttcttgcccggtacggacgacgagcagaagcgcgcgccggaa720

ttctcgccgctctacgcgaacctcgccggcttgtgccccgcgctcttcaccatcggcacg780

cgcgatgcgctcctggacgacagtctcttcatgcacgcgcgctgggtggcggcgggaaat840

gtcggcgaactcgacatctatccgggcggctgtcatggcttcatcgccttcccgtacccg900

caggcgttcgcgtcgatcgcgcgccaagccacgtttttgaacgcggccctgggttag957

<210>seqidno.2

<211>318

<212>prt

<213>environmentaldna

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metserthrleuaspprolysleupheserasplysalailealapro

151015

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354045

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