一种海洋酯酶及其编码基因e32与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种海洋酯酶及其编码基因E32与应用，属于生物技术技术领域。
【背景技术】
[0002] 酯酶（esterases)是一种能催化酯键的水解与合成的水解酶，水解时催化酯键产 生甘油和短链脂肪酸10个碳原子）；合成时，把酸的羧基与醇的羟基脱水缩合，产物为 酯类及其他香味物质。酯酶广泛存在于动物、植物和微生物中。微生物资源丰富，并且利用 微生物发酵产酶具有便于工业化生产、易纯化等优点，因此微生物来源的酯酶已被广泛应 用于制药业、造纸业、化妆品生产、食品加工以及食品添加剂等领域。
[0003] 目前，微生物酶法生产风味物质（flavors)在国际上已引起极大重视。风味物质 已被广泛应用于食品、化妆品、洗涤剂和制药业中，其每年在国际市场上的需求量超过220 亿美元。现在，主要通过化学合成的方法或从原材料中提取的方法来生产风味物质。化学 合成的方法，其工艺复杂、反应条件剧烈、产物不均一、依赖有毒溶剂且能耗高，易造成环境 污染、资源浪费，且生产成本高。从原材料中提取风味物质的方法，因其在原材料中的含量 较低，因此也同样存在高生产成本的问题。但是，通过微生物酶法生产风味物质具有反应条 件温和、不发生副反应以及产物单一等化学合成方法无法比拟的优点，并且可以通过制备 全细胞催化剂以及循环利用来降低生产成本。因此，近年来采用生物合成风味物质逐渐成 为研宄热点。
[0004] 短链或者中长链的脂肪酸酯，因其果香味和高挥发性被普遍地用作一类重要的风 味物质。而酯酶则可以通过分解转化或合成生产这类风味物质。酯酶作为生物催化剂，具 有不需要辅因子、能稳定存在于有机溶剂中、高区域选择性和高立体选择性等优点。虽然酯 酶存在于所有生物中，但是具有商业价值的酯酶主要来源于微生物类群。根据生化性质和 氨基酸序列，微生物来源的酯类水解酶（包括酯酶和脂肪酶）主要分为8个家族，第I-VIII 家族。这些酯类水解酶中，只有很小一部分应用到风味物质的工业生产中，还远远满足不了 工业上对各种酯类水解酶的需求。
[0005] 海洋微生物不仅数量巨大，且富含多种类群，其处于不同的温度、压力、盐浓度、营 养物质等环境条件下，这为获取性质独特的具有工业潜力的新型酯酶提供了巨大的来源。 而分子生物学、基因组测序技术和宏基因组技术的飞速发展，大大加快了海洋来源新型酯 酶的发现，这为克隆酯酶基因，构建高产的基因工程菌，以实现工业化生产奠定了基础。
【发明内容】
[0006] 本发明针对现有技术的不足，提供一种海洋酯酶及其编码基因E32与应用。
[0007] -种海洋酯酶基因E32,核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0008] 上述海洋酯酶基因E32编码的海洋酯酶E32,氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。 [0009] 一种重组表达载体，该表达载体包含有如SEQ ID NO. 1所示核苷酸序列的功能片 段。
[0010] -种重组细胞，该宿主菌包含有上述重组表达载体或表达上述海洋酯酶E32。
[0011] 上述海洋酯酶E32和/或上述海洋酯酶基因E32在水解制备风味物质中短链和中 长链酯类及其衍生物的应用。
[0012] 本发明海洋酯酶的基因E32来自南海海底表层沉积物样品E505宏基因组文库中 大肠杆菌EPI300克隆子E32-4A的大片段质粒fosmid DNA。通过构建E32-4A克隆子中 fosmid的亚克隆文库和后期测序，确定了该克隆子fosmid上携带的酯酶基因E32的核酸序 列。根据E32基因序列设计特异性引物，利用PCR技术从E32-4A克隆子的fosmid DNA克 隆了编码海洋酯酶E32的基因，构建了含海洋酯酶基因E32的表达载体以及含有该表达载 体的大肠杆菌重组细胞。测序结果表明海洋酯酶基因E32为一个含有1，455个核苷酸的开 放阅读框架，该开放阅读框架共编码484个氨基酸。因此酯酶E32是一个含有484个氨基 酸的多肽。序列分析表明，海洋酯酶E32属于一个酯类水解酶新家族，E32是该新家族第一 个被研宄的酯酶。对纯化的海洋酯酶E32进行性质测定。结果表明该酶对短链和中长链的 酯类表现出较强的降解活性。最适pH为9.0,且在pH 6. 0-10.0范围内稳定存在。最适酶 活温度为40°C，且在30-50°C范围内保持超过85 %的活力。其为热稳定酯酶，对超过60°C 的高温环境表现出较好的耐受性。E32对高浓度的NaCl也表现出很好的耐受性。
[0013] 有益效果
[0014] 1、本发明所述的海洋酯酶E32能降解短链和中长链的的pNP酯类（C2-C12)，具有 通过分解转化生产短链或中长链脂肪酸酯类风味物质的应用潜力；
[0015] 2、本发明所述的海洋酯酶E32能在30-50°C和pH 7. 0-10. 0范围内保持很高的酶 活力，且对高温、高盐以及强碱表现出很好的耐受性，这为其更好地应用于工业生产奠定了 基础。
【附图说明】
[0016] 图1、以海洋酯酶E32及其同源序列以及已知的酯类水解酶家族代表序列构建的 系统发生树；
[0017] 图2、通过PCR扩增克隆的编码海洋酯酶E32的基因片段的电泳图；
[0018] 其中：泳道1和泳道2为扩增的DNA片段，M泳道为DNA分子量标记（marker);
[0019] 图3、在大肠杆菌中进行异源表达和纯化的海洋酯酶E32电泳图；
[0020] 其中：泳道1、含空质粒pET22b的大肠杆菌BL21经IPTG诱导表达菌体超声波破 碎后的上清液电泳图，为阴性对照，泳道2、含重组表达质粒的大肠杆菌BL21经IPTG诱导 表达菌体超声波破碎后的上清液电泳图，泳道3、上清液经过镍柱亲和层析的穿过液，泳道 4和泳道5、上清液经过镍柱亲和层析纯化后的纯酯酶E32电泳图，泳道M、蛋白质分子量标 记（marker)；
[0021] 图4、海洋酯酶E32的底物特异性分析；
[0022] 图5、海洋酯酶E32的酶活温度曲线；
[0023] 其中：(A)温度对酶活性的影响，（B)温度对酶稳定性的影响；
[0024] 图6、海洋酯酶E32的酶活pH曲线；
[0025] 其中：(A) pH对酶活性的影响，（B) pH对酶稳定性的影响；
[0026]图7、不同浓度的NaCl对海洋酯酶E32酶活性的影响曲线。
【具体实施方式】
[0027] 下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。
[0028] 培养基：