因子。合 适的NADH依赖性醇脱氢酶例如是从面包酵母、近平滑假丝酵母（Candida parapsilosis) (CPCR)(美国专利号5, 523, 223和美国专利号5, 763, 236, Enzyme Microb. Technol 1993, 15(11) :950-8)、荚膜毕赤酵母（Pichia capsulata) (EP1633779B1)、红串红球菌 (他〇(1〇(3〇(^118 6^1：]11'〇卩〇118)(1^〇1?)(美国专利号5,523,223)、1'1〇1'〇&『(11&;1!\18〇&(13;[08(3；[. Biotechnol.Biochem. ,63(10) ,1999，第1721-1729页；Appl. Microbiol. Biotechnol 2003,62(4):380_6;Epub 2003，Apr.26)或赤红球菌（Rhodococcus ruber)(J.0rg. Chem.，2003, 68(2) :402-6)可获得。这些醇脱氢酶的合适共底物例如是已经提到的仲醇如 2_丙醇（异丙醇）、2-丁醇、2-戊醇、4-甲基-2-戊醇、2-辛醇或环己醇。
[0075] 用于再生NADPH的合适仲醇脱氢酶例如是如上文所述和从乳杆菌目 (Lactobacillales)、例如开菲尔乳杆菌（Lactobacillus kefir)(美国专利号 5,200,335)、短乳杆菌（Lactobacillus brevis) (DE 19610984Al;Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 2000 December ;56 Ptl2:1696-8)、微小乳杆菌（Lactobacillus minor) (DE 10119274)、肉色明串珠菌（Leuconostoc carnosum) (A1261/2005，K1.C12N) 分离的那些或如所述从布氏热厌氧菌（Thermoanerobium brockii)、产乙醇热厌氧菌 (Thermoanerobiumethanolicus)或拜氏梭菌（Clostridiumbeijerinckii)分离的那些。
[0076] 但是，其他酶促系统原则上也可以用于辅因子再生。例如，可以使用NAD 或NADP依赖性甲酸脱氢酶实现辅因子再生（Tishkov等人，J.Biotechnol.Bioeng. [1999]64, 187-193,Pilot-scaleproductionandisolationofrecombinantNADand NADPspecificformatedehydrogenase)。甲酸脱氢酶的合适共底物例如是甲酸的盐如甲 酸铵、甲酸钠或甲酸钙。
[0077] 为了转化1kg底物奎宁环-3-酮，应当使用5000至lOMio.单位氧化还原酶。这 种酶活性单位（U)定义为每（pro)分钟将1ymol奎宁环-3-酮转化成相应醇所需要的酶 量。
[0078] 在本发明的方法中，底物奎宁环-3-酮在反应混合物中基于总体积优选地以10g/ 1至500g/l、优选地25g/l至300g/l、特别优选地50g/l至200g/l的量使用。
[0079] 其中酶促还原优选推进的反应混合物的含水部分含有具有pH值5至10、优选地 pH6至9的缓冲液，例如磷酸钾、tris/HCI或三乙醇胺缓冲液。此外，该缓冲液可以含有用 于稳定或活化酶的离子，如，例如，锌离子或镁离子。
[0080] 在实施本发明方法时，温度适当地是从约10°C至70°C，优选地20°C至45°C。
[0081] 水相中辅因子浓度、尤其NADH或NADPH的各自浓度通常是0.0 OlmM至10mM。
[0082] 本发明方法中所实现的TTN(总转换数值=还原型式I化合物摩尔数/所用辅因 子的摩尔数）通常是1〇2至10 5,然而，它优选地是> =1〇3。
[0083] 在本发明的方法中，也可以使用氧化还原酶/脱氢酶的稳定剂。合适的稳定剂例 如是甘油、山梨醇、1，4-DL-二硫苏糖醇（DTT)或二甲基亚砜（DMS0)。
[0084] 根据本发明的另一个可能实施方案，可以连续地移除氧化型共底物（例如丙酮） 和/或可以按连续方式新添加共底物（例如2-丙醇）以使反应平衡移向反应产物。
[0085] 在完成还原后，加工反应混合物。为此目的，例如将水相任选地与有机相分离并过 滤含有产物的有机相。任选地，也可以将水相提取并如同有机相那样进一步加工。一旦加 工，则从有机相蒸发溶剂并获得通式II或III的产物作为粗产物。粗产物随后可以进一步 纯化或直接用于合成所得到的产物。
[0086] 此后，以举例方式进一步说明本发明。
[0087] 实施例1
[0088] 分离来自范巴伦氏分枝杆菌的氧化还原酶
[0089] 为了从范巴伦氏分枝杆菌分离NADH-依赖性氧化还原酶，将微生物在每升水蛋白 胨5. 0g，肉浸汁3. 0g，pH7. 0中培育。
[0090] 一旦达到稳定期，将细胞收获并且通过离心与培养基分离。将5g范巴伦氏分枝杆 菌细胞用20ml缓冲液（100mM三乙醇胺，ImMMgCl2，pH= 7. 0)悬浮并匀浆。离心后（7000 转/分钟）获得的粗提物随后进一步纯化并通过借助FPLC(快速蛋白质液相色谱）再加 工。可以通过丁基-琼脂糖凝胶（Messrs.Pharmacia)上离子交换层析、Q-琼脂糖凝胶快 速流动（Messrs.Pharmacia)上纯化两次、之后进行羟基磷灰石色谱（Bio-Rad)，以这四个 连续步骤纯化氧化还原酶。为此目的，将离心后获得的裂解物直接施加至用50mMTEA、ImM MgCI2、1M硫酸铵pH= 7. 0平衡的丁基-琼脂糖凝胶柱，并用递减线性盐梯度洗脱。在这样 做的过程中，氧化还原酶以0. 2至0. 3M硫酸铵洗脱。将含有氧化还原酶的级分汇合并且通 过超滤（排阻限制lOkDa)浓缩到适宜体积。随后，将已经浓缩的氧化还原酶级分再加工并 通过Q-琼脂糖凝胶进一步纯化，使用含ImMMgCljPlMNaCl的50mM磷酸钾缓冲液。酶 因而在0. 7-0. 8MNaCl洗脱。随后，将活性级分浓缩并用10mM磷酸钾缓冲液，pH7. 0,ImM MgCl2平衡并施加到羟基磷灰石柱上并用200mM磷酸钾缓冲液、ImMMgCl2洗脱。下表总结 获得的结果。
[0091]表
[0092]
[0093]根据Lowry等人，JournalofBiologicalChemistry, 193 (1951) : 265-275 或 Peterson等人，AnalyticalBiochemistry, 100(1979) : 201-220)进行蛋白质量的确定。酶 活性与蛋白质量之比产生比活性，其中每分钟转化1ymol对应于1单位（U)。
[0094] 实施例2
[0095] 本发明氧化还原酶的N端序列的测定
[0096] 在羟基磷灰石柱纯化步骤后，将根据实施例1的酶制备物在10%十二烷基硫酸钠 (SDS)凝胶中分离并转移到聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）上。
[0097] 通过Edman降解法（Procise492 (PE-Biosystems))和优势内部肽的测序，对约 30kDa处的明显条带进行N端测序。获得以下N端序列：
[0098]TRTVVVTGAGSGIGR
[0099] 内部肽的序列：
[0100]LEQADDVAR
[0101] 实施例3
[0102] a)来自范巴伦氏分枝杆菌的氧化还原酶的克隆
[0103] 使用从范巴伦氏分枝杆菌PYR-1细胞分离的基因组DNA作为采用简并引物的PCR 反应的模板，所述简并引物基于来自Edman降解法的蛋白质片段序列设计。在这情况下，扩 增在PCR缓冲液[16mM(NH4)2S04) ;67mMTris-HClpH8.3(在 25°C) ;1.5mMgCl2;0.01% Tween20 ;0? 2mMdNTP混合物；在每种情况下30pMol引物和1. 25UBioThermStar聚合酶 (Genecraft)]中实施，以50ng基因组DNA作为模板。
[0104]循环 1 :95°C，7 分钟；
[0105] 循环 2x 28 :94°C，40 秒
[0106]温度降低始于63 °C每个步骤降低0. 5°C，30秒
[0107] 68°C 60 秒
[0108] 循环 3x 20 :94°C，40 秒
[0109] 53°C，40 秒
[0110] 72。。，60 秒
[0111]循环 4:70°C，7 分钟
[0112] 4°C，[无限]
[0113] 在1 %琼脂糖凝胶中对完整PCR混合物分级后，鉴定到一个约650条带并将它通过 突出的腺苷部分克隆入Topo-TA载体（Invitrogen)以测定DNA序列。
[0114] 从筛选反应所得的DNA条带示出与227个氨基酸残基的氧化还原酶片段相对应的 可读框。
[0115] 通过反向PCR(iPCR)法完成编码氧化还原酶的完整序列的测定。
[0116] 编码氧化还原酶的基因序列包含771个碱基对并且等同于256个氨基酸残基长 度。
[0117]b)通过PCR合成编码来自范巴伦氏分枝杆菌的短链ADH的全长DNA片段
[0118] 构建特异性引物以便将全长转录物后续克隆入适宜表达系统。通过这样做，修饰 带有NdeI识别序列的5' -引物和带有HindIII识别序列的3' -引物。从范巴伦氏分枝 杆菌细胞分离的基因组DNA充当聚合酶链反应的模板。在PCR缓冲液[10mMTris-HCl(pH 8. 0) ;50mMKC1 ;10mMMgS04;lmMdNTP混合物；在每种情况下 20pMol引物和 2. 5U PlatinumPfxDNA聚合酶（Invitrogen)]中，采用50ng模板和以下温度循环实施扩增：
[0119]循环 1:94 °C，2 分钟
[0120] 循环 2x30 :94°C，15 秒；
[0121] 58 °C，30 秒；
[0122] 68°C，75 秒
[0123]循环 3:68 °C，7 分钟
[0124] 4。(：，[无限]
[0125] 在1 %琼脂糖凝胶上纯化后，将所得到的PCR产物借助核酸内切酶NdeI和Hind III限制性切割并连接入pET21a载体（Novagen)的主链，所述主链已经用相同的核酸内切 酶处理。在转化2y1连接混合物入大肠杆菌ToplOF'细胞（Invitrogen)后，借助核酸内 切酶NdeI和Hind限制性分析，对氨苄青霉素（或卡那霉素）抗性菌落的质粒DNA检验大 小750的插入物的存在。将表达构建体pET21-Myc测序。来自范巴伦氏分枝杆菌的编码短 链氧化还原酶的基因具有总计771的可读框（SEQIDN0:2)，所述可读框对应于256个氨基 酸的蛋白质（SEQIDN0:1)。
[0126] 实施例4.
[012