新颖方法
【专利说明】新颖方法 发明领域
[0001] 本发明涉及通过将TET家族基因、其衍生物或片段引入细胞以增强细胞效力的方 法。本发明还涉及用于制备具有增强效力的细胞的方法和试剂盒，以及所述细胞的用途。
[0002] 发明背景
[0003] 据认为，干细胞的使用可以从根本上改变人类疾病的治疗。已知干细胞具有高水 平的效力和自我更新，这意味着它们可以分化成多种细胞类型。这种有利的特性可以在器 官和组织的产生或修复中使用。
[0004] 胚胎干（ES)细胞的分离已经在干细胞技术和研究中带来很大进步。ES细胞是多 能的，因此它们可被诱导分化成随后可被利用的多种细胞类型，例如，在科学动物模型或细 胞移植疗法中使用。然而，ES细胞尚未满足它们作为在疾病的治疗中现在所面对的大多数 问题的方案的预期。例如，已被证实的是，ES细胞的移植面临与当前器官移植一样的排斥 问题。此外，鉴于在收获ES细胞期间胚胎遭到破坏的事实，这些细胞的使用引发了伦理问 题。
[0005] 最近，科学家已开发出产生诱导多能干（iPS)细胞（如W0 2007/069666中所述） 的方法，所述方法允许患者自身的体细胞去分化成多能状态，从而克服与ES细胞相关的伦 理问题。然而，来自人和啮齿动物谱系之外的其它哺乳动物的iPS细胞和ES细胞在几乎所 有的情况下都缺少完全的多能性。
[0006] 此外，作为多能细胞，来自任何物种的ES和iPS细胞不能形成胚外谱系的组织，并 且必须注射到宿主囊胚以产生完整的有机体。
[0007]W0 2010/037001描述使用TET蛋白家族来调节和检测DNA的胞嘧啶甲基化状态以 便重编程干细胞的方法。
[0008] 因此需要产生具有更高效力的细胞（如全能细胞）以用于在干细胞技术中使用的 方法。
[0009]发明概述
[0010] 根据本发明的第一方面，提供增强细胞效力的方法，其中所述方法包括以下步骤： 将TET家族基因、其衍生物或片段引入细胞中。
[0011] 根据本发明的另一方面，提供制备具有增强效力的细胞的方法，所述方法包括以 下步骤：将TET家族基因、其衍生物或片段引入细胞中。
[0012] 根据本发明的另一方面，提供可通过本文所定义的方法获得的具有增强效力的细 胞。
[0013] 根据本发明的另一方面，提供包含SEQIDN0:11或13的TET3同工型的核酸。
[0014] 根据本发明的另一方面，提供包含如本文所定义的核酸的载体。
[0015] 根据本发明的另一方面，提供如本文所定义的核酸或如本文所定义的载体在增强 细胞效力的方法中的用途。
[0016] 根据本发明的另一方面，提供用于在疗法中的使用的如本文所定义的具有增强效 力的细胞。
[0017] 根据本发明的另一方面，提供试剂盒，所述试剂盒包括含有TET家族基因、其衍生 物或片段的载体，和根据如本文所定义的方法来使用所述试剂盒的说明书。
[0018] 附图简述
[0019] 图1 :5'Tet3基因座的示意图。图不是按比例绘制。虚线代表多个外显子和内含 子。箭头表示用于启动子使用分析的qRT-PCR引物的位置（参见实施例部分）。所指示的 起始密码子与全长TET3蛋白同框。'Cat' =催化结构域。
[0020] 图2 :启动子使用和编码CXXC的外显子的并入。示出了相对于参考基因Atp5b和 Hspcb的平均值的转录水平。除了卵母细胞（其具有单个值），所示的值是两个生物学平行 测定值的平均值，范围被示出为误差线条。EB:胚状体。
[0021] 图3:在由Tet3变体1转染的分选细胞中通过qPCR进行的候选基因的表达分析。 示出了相对于参考基因Atp5b和Hspcb的平均值的转录水平。Mut:催化非活性突变体。
[0022] 图4 :在由Tet3变体1转染的分选细胞中通过qPCR进行的对照基因的表达分析。 示出了相对于参考基因Atp5b和Hspcb的平均值的转录水平。Mut:催化非活性突变体。
[0023] 图5:在由Tet3变体3转染的分选细胞中通过qPCR进行的候选基因的表达分析。 示出了相对于参考基因Atp5b和Hspcb的平均值的转录水平。Mut:催化非活性突变体。
[0024] 图6:由Tet3变体1转染的分选细胞中的表达水平的散点图。每个点代表单个基 因。用黑色来指示通过qPCR检测的候选基因（参见实施例4)和几个家族成员，其中用箭 头标记一些示例性基因。
[0025]图7:由Tet3变体1催化突变体转染的分选细胞中的表达水平的散点图。每个点 代表单个基因。用黑色来指示通过qPCR检测的候选基因（参见实施例4)和几个家族成员， 其中用箭头标记一些示例性基因。
[0026] 图8:示出表达Tet3变体1的胚胎干细胞中单细胞表达数据的结果的热图。
[0027] 图9:指示表达TET3的亚群中类全能细胞比例的图。
[0028] 图10 :TET3表达的定量RT-PCR分析。示出了相对于E14( = 1)的转录水平。值 是两个独立平行测定值的平均值；误差线条指示范围。
[0029] 图11 :6天转分化测定后的菌落形态的相差显微镜检查。图像代表观察到的菌落 形态的范围。
[0030] 图12 :6天转分化测定后的CD40表达的流式细胞分析。在TS细胞培养基中培养 6天后，将细胞用山羊a-⑶40-次抗体（R&DSystem)、然后抗山羊AlexaFluor647二次 抗体（Invitrogen)染色。A:点图针对单个细胞，在Y-轴上示出正向散射宽度值（FSC-W)， 并且在X-轴上示出640nm的荧光值（即⑶40信号）。指示了针对称为⑶40阳性的阈值， 以及超过这个水平的细胞百分比。对总细胞群体中的学生t检验表明对于两种过表达TET3 的细胞系来说，在CD40阳性细胞中相对于E14ES细胞的非常显著增加（在两种情况下 p〈0. 0001)。B.每个细胞系中称为⑶40阳性的细胞百分比的定量。
[0031] 发明详述
[0032] 根据本发明的第一方面，提供增强细胞效力的方法，其中所述方法包括以下步骤： 将TET家族基因、其衍生物或片段引入细胞。
[0033] 本文提到的'增强效力'涉及具有增加的分化成不同细胞类型的能力的细胞。已 知全能细胞是具有最高效力的细胞。其次是多能、多潜能、寡能和单能细胞。
[0034] 在一个实施方案中，细胞的效力被增强至多能状态，如真实多能状态。
[0035] 本文提到的'多能'涉及具有分化成不同细胞类型的潜力的细胞。这些细胞比全 能细胞更受限，原因在于单独的多能细胞不能发育成胎儿或成年生物体，因为多能细胞不 能分化成胚外细胞。因此，必须使用供体囊胚细胞以产生完整的有机体。
[0036] 如本文所述，产生iPS细胞的方法在本领域中是公知的，然而这些细胞已被证明 缺乏完全的多能性，因为它们保留其供体体细胞的表观遗传记忆（Kim等人（2011)Nature 467, 285-290页）。因此，这些细胞不被认为是真实多能的，因为它们不具有如天然的多能 细胞分化成多种细胞类型一样的能力。
[0037] 因此，本文提到的'真实多能状态'涉及具有如天然的多能细胞分化成多种细胞类 型一样的能力（即它们是完全的多能）的细胞。特别是，真实/完全的多能细胞可以分化 成胚胎的三个胚层（即内胚层、中胚层或外胚层）中的任何层。
[0038] 在一个实施方案中，细胞的效力被增强至多能状态。
[0039] 因此，根据本发明的另一方面，提供将细胞重编程至全能状态的方法，其中所述方 法包括以下步骤：将TET家族基因、其衍生物或片段引入细胞。
[0040] 本文提到的'全能'涉及具有分化成不同细胞类型的潜力的细胞，包括包含胚外组 织的细胞。因此，全能细胞具有能够发育成完整的生物，而不需要使用宿主产生的囊胚细 胞的优点。应理解，提到的'全能，细胞包括'类全能，细胞（即与全能细胞有高度的相似 性的细胞），例如与全能细胞的高程度转录或表观遗传相似性（参见Macfarlan等（2012) Nature487, 57-63页，描述了产生全能性获得的基因表达转移）。此外，如本文所用提到的 '全能'或'类全能'细胞是指具有比多能细胞更高效力的细胞。
[0041] 本文提到的'体细胞'是指构成生物体的任何类型的细胞，但排除生殖细胞和未分 化的干细胞。体细胞因此包括例如皮肤、心脏、肌肉、骨骼或血液细胞。
[0042] 由于细胞分化为特定细胞类型（例如皮肤、肌肉、血液等），它们失去其成为不同 细胞类型的能力（或潜力）。因此，重编程细胞回到多能状态或全能状态，使得它们可以被 操作成所期望的细胞类型是有利的。
[0043] 本文提到的'重编程'是指细胞被转换回到不同的分化状态的过程。本文所述的 发明将细胞重编程至全能状态，从而提高其效力和分化成多种细胞类型的能力。
[0044] 当前干细胞技术依赖于ES细胞和iPS细胞的使用。然而，这两种细胞类型都具有 一些缺点。例如，iPS细胞已被证实保留它们的供体体细胞的表观遗传记忆，所述表观遗传 记忆在天然多能细胞中是不存在的（Kim等（2011)Nature467,285-290页）。此外，来自 人和啮齿动物谱系之外的其它哺乳动物的ES和iPS细胞已被证实不是真实多能的。本发 明提供增强细胞的效力的状态（例如，增强至全能状态）的方法，从而克服这些与人ES和 iPS细胞相关联的问题。
[0045] 如本文所示，使用TET家族基因（例如Tet3基因）可以增加细胞培养基中的类全 能干细胞的数量（参见图9)。类全能干细胞的亚群已被证实具有增强效力，如通过其转分 化至类滋养层细胞的能力所精确计量的（参见实施例7)。因此，