上调：Pramel3、Pramel5、Pramel7、SpllO、Tdpozl、Tdpoz3、 Tdpoz4、Tdpoz5、Tet3、Zfp352、Zscan4c、Zscan4d、Zscan4e、Zscan4f和Zscan4_ps2〇
[0158] 在散点图上比较GFP阳性细胞和GFP阴性细胞，并且使用SeqMonk v0. 23. 1突出 以上基因列表（图6和7)。再次，Tet3如预期地在GFP阳性细胞中强烈上调。显著地，这 个分析表明：候选基因及其家族成员都在通过无偏全基因组测序鉴定的大多数上调的基因 之中。与qPCR数据一致，Tet3变体1或其催化失活对应物的过表达对基因表达上具有在 相似效果，从而表明氧化酶功能对于转移到更"类全能"转录程序不是必须的。
[0159] 实施例6 :类全能亚群的分析
[0160] 胚胎干细胞培养物相对于基因表达和发育能力是不同的。它们可以分成亚群的特 征在于不同的标记基因的表达。通过不同的表达模式它们以单个细胞周期在不同的亚群之 间移动。在相同胚胎干细胞培养物中的亚群的丰度相对较稳定。在野生型ES细胞中，很小 比例的细胞（5% )显示出非常早期植入前胚胎的特征性表达谱。据认为与大多数ES细胞 相比，这些细胞具有膨胀的效力的表型，并且它们对ES细胞贡献的在聚合实验中的胚外谱 系的极罕见情况负责。
[0161] 评估表达Tet3变体1的ES细胞中的类全能亚群的丰度。使用C1系统（Fluidigm) 和SMARTercDNA扩增（Clontech)分离来自单独GFP-和GFP+细胞的cDNA。利用EvaGreen qPCR化学法（Bio-Rad)、使用Biomark HD microfluidics系统（Fluidigm)来分析稳态表达 水平。下列基因用作用于类全能亚群的标记（表6中以粗体突出显示）：ZSCan4C、MuERV-L、 Arg2、Dub2a、Tcstv3、Lgals4〇
[0162] 设计用于这些基因中的每一个的引物来用于定量RT-PCR，在可能的情况下跨越内 含子-外显子边界（参见表6)。
[0163] 表6 :单个基因表达分析引物的概述
[0164]
[0165]
[0166] 使用SINGULAR分析工具组2. 0 (Fluidigm)分析单个细胞表达数据，并且无监测聚 类的结果显示为以较浅颜色表示较高表达的热图（图8)。基因在一个水平方向上成簇集 中。用于类全能状态的标记基因密切相关并且以粗体突出显示。单个基因在一个水平方向 上成簇集中。密切相关细胞的亚群显示非常高的类全能标记基因的表达水平（由水平框突 出显示），并且因此命名为'类全能'亚群。落入所述类别的细胞的比例显著上升在Tet3变 体1的表达之上。而在TET3没有或非常低地表达的细胞中仅5%的细胞是所述亚群的一部 分，在TET3表达细胞中所述比例增加至40% (图9)。因此，观察到的朝向类全能表达谱系 的转移跨过由类全能亚群的突然膨胀所调节的群体。
[0167] 实施例7 :通过转分化测定论证增强效力
[0168]ES细胞是多能的，因为它们可以产生许多不同细胞类型的胚胎，但不能产生胚外 组织如滋养层。因此在生长条件下形成用于滋养层干细胞（TS)培养的类滋养层细胞的能 力提供膨胀的效力的离体测定（Ng等人（2008)NatCellBiol. 10, 1280-1290)。所述测试 应用于野生型E14ES细胞和两种过表达Tet3变体1的组成型ES细胞系（称为Tet3克 隆2和Tet3克隆7)。作为阳性对照，平行测试已知经历明显转分化的过表达Ras转基因 (称为iRas)或缺乏0ct4表达（称为ZHBTc4)的遗传修饰细胞系（Niwa等（2000)似七 Genet. 24,372-376;Niwa等（2005)Celll23,917-929)〇
[0169] 为了将任何可观察到的变化与TET3表达的水平相关联，在如以上所述野生类型 E14ES细胞和两个Tet3过表达ES细胞系上进行qRT-PCR分析（图10)。Tet3克隆7表 达TET3超过Tet3克隆2约2倍；相对于E14细胞，这两种细胞系具有显著增加的Tet3转 录水平。
[0170] 转分化测定
[0171] 由补充有20%FBS、lmM丙酮酸钠、50U/mL青霉素-链霉素和0. 05mMB-巯基乙醇 的RPMI1640组成的TS基础培养基通过以下方式调节：在细胞培养皿上培养照射过的小鼠 胚胎纤维（MEF)细胞两天，并且通过0. 22ym过滤器。通过将70%条件培养基、30%TS基 础培养基、20ng/mL0 -胎儿生长因子和1yg/mL肝素混合来制备完全TS细胞培养基。
[0172] 在完全TS细胞培养基中培养6天后，通过形态学评估转分化（图11)和TS细胞 标记CD40的流式细胞术分析（图12)。
[0173] 对代表性相差图象的检测揭示：在过表达TET3的细胞系中针对ZHBTc4细胞的类 滋养层形态的显著转移，所述类滋养层形态在E14细胞中大程度缺失。这个效果在Tet3克 隆7细胞系中更显著。
[0174]CD40是用于区分TS和ES细胞的确定标记（Rugg-Gunn等（2012)Cell 22, 887-901)。流式细胞分析表明在TET3过表达之后，⑶40阳性细胞的数量有明显上升。总 细胞群体的统计学测试确定相对于E14ES细胞用于过表达TET3的细胞系的高度显著增加 (学生t检验；在两种情况下p〈0. 0001)。再者，Tet3克隆7细胞系中的变化更广泛，⑶40 阳性细胞达到与阳性对照iRas细胞系中观察到的几乎相等的水平。
[0175] 这个数据显示：ES细胞中TET3的过表达导致转分化至类全能状态能力的增强，从 而证明发育效力的增强。此外，效力的这种扩展与细胞所接收的TET3的剂量相关；在两种 分析中，具有较高的TET3表达的细胞系（克隆7)显示出更大的效果。
【主权项】
1. 一种增强细胞效力的方法，其中所述方法以下步骤：包括将TET家族基因、其衍生物 或片段引入所述细胞中。2. 如权利要求1所述的方法，其中所述细胞被增强至全能状态。3. 如权利要求1所述的方法，其中所述细胞被增强至多能状态，如真实多能状态。4. 如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述TET家族基因、其衍生物或片段是 TET2 或 TET3。5. 如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述TET家族基因、其衍生物或片段是 TET3。6. 如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述TET家族基因、其衍生物或片段是 SEQ ID NO: 11 或 13 的 TET3 同工型。7. 如权利要求1、2或4至6中任一项所述的方法，其中所述细胞是多能细胞，如胚胎干 (ES)细胞，特别是E14胚胎干（ES)细胞。8. 如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述细胞是体细胞。9. 如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述引入步骤包括用含有所述TET家 族基因、其衍生物或片段的载体转染所述细胞。10. 如权利要求9所述的方法，其中所述载体是转座子载体。11. 一种制备具有增强效力的细胞的方法，所述方法包括以下步骤：将TET家族基因、 其衍生物或片段引入细胞。12. 如权利要求11所述的方法，其中所述细胞是多能细胞，如胚胎干（ES)细胞，特别是 E14胚胎干（ES)细胞。13. 如权利要求11所述的方法，其中所述细胞是体细胞。14. 如权利要求13所述的方法，其还包括以下步骤：将0ct3/4基因、Sox2基因、Klf4 基因和c-Myc基因引入所述体细胞中。15. 如权利要求11至14中任一项所述的方法，其还包括以下步骤：在引入所述TET家 族基因、其衍生物或片段之后培养所述细胞。16. 如权利要求11至15中任一项所述的方法，其还包括以下步骤：选择过表达所述 TET家族基因、其衍生物或片段的一种或多种细胞。17. 如权利要求16所述的方法，其中使用流式细胞术选择所述一种或多种细胞。18. -种具有增强效力的细胞，所述细胞可通过如权利要求1至17中任一项所述的方 法获得。19. 一种包含SEQ ID NO: 11或13的TET3同工型的核酸。20. -种包含如权利要求19所述的核酸的载体。21. 如权利要求19所述的核酸或如权利要求20所述的载体在增强细胞效力的方法中 的用途。22. 如权利要求18所述的具有增强效力的细胞，所述细胞用于在疗法中使用。23. 如权利要求22所述的用于使用的具有增强效力的细胞，其中所述疗法包括组织再 生。24. -种试剂盒，其包括含有TET家族基因、其衍生物或片段的载体，和根据如权利要 求1至17中任一项所述的方法来使用所述试剂盒的说明书。25. 如权利要求24所述的试剂盒，其还包括至少一种多能细胞，如胚胎干（ES)细胞，特 别是E14胚胎干（ES)细胞。26. 如权利要求24所述的试剂盒，其还包括至少一种体细胞。27. 如权利要求25或26所述的试剂盒，其还包括用于培养所述细胞的培养基，和用于 根据权利要求1至17中任一项所述的方法制备具有增强效力的所述细胞的说明书。
【专利摘要】本发明涉及通过将TET家族基因、其衍生物或片段引入细胞中来增强所述细胞的效力(例如，增强至全能状态)的方法。本发明还涉及用于制备具有增强效力细胞的方法和试剂盒，以及所述细胞的用途。
【IPC分类】C12N5/0735, C12N9/02, C12N5/074
【公开号】CN105051188
【申请号】CN201380070275
【发明人】W.赖克, J.皮特, T.霍尔, C.克鲁格
【申请人】巴布拉哈姆研究院
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2013年12月17日
【公告号】CA2894822A1, EP2931881A1, WO2014096800A1