信使rna的纯化方法
【专利说明】信使RNA的纯化方法
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请案要求2013年3月14日提交的美国临时专利申请序列号61/784，996的权益，其整体通过弓I用并入本文。
[0003]发明背景
[0004]信使RNA疗法正成为日益重要的治疗各种疾病的方法。信使RNA疗法涉及向需要该疗法的患者施用信使RNA(mRNA)并在患者体内生成由mRNA编码的蛋白质。因此，重要的是确保生成高纯度且安全的mRNA产物。传统上，RNA纯化通常采用旋转柱并且涉及使用腐蚀性或易燃性溶剂，例如乙醇，这对于治疗剂施用和大规模生产而言不合需要。
[0005]发明概述
[0006]本文提供了基于切向流过滤(TFF)，纯化适合作为药物产品施用的mRNA的改进方法。在本发明之前，RNA纯化通常采用旋转柱并且涉及使用腐蚀性或易燃性溶剂，例如乙醇，这对于治疗剂施用和大规模生产而言不合需要。进一步地，先前技术方法通常不允许分离称为提前中断产物或“短聚物(shortmer) ”的不完全转录产物，据报道这具高免疫刺激性并且其存在可大大改变mRNA作为活性药物成分(API)的毒性和耐受性。本发明部分基于发现切向流过滤对从mRNA生成混合物中去除反应物、酶、副产物，尤其是短聚物惊人地有效。如本文所述，切向流过滤，特别是与使用变性剂的预处理相结合，可有效地去除反应物、酶和包括提前中断RNA序列(即，短聚物)在内的副产物，同时仍保持mRNA的完整性。更令人惊讶的是，本发明人已经证明仅使用含水缓冲液作为溶剂，无需使用任何腐蚀性或易燃性溶剂，可成功地进行切向流过滤。因此，本发明提供了一种更有效、可靠且更安全的从大规模生产工艺治疗应用中纯化mRNA的方法。
[0007]—方面，本发明尤其提供了纯化信使RNA(mRNA)的方法，所述方法包括(a)使包含体外合成的mRNA的掺杂制剂经受变性条件，以及(b)通过切向流过滤从来自于步骤(a)的所述掺杂制剂纯化所述mRNA的步骤，其中从步骤(b)纯化的所述mRNA基本上无提前中断的RNA序列和/或用于体外合成的酶试剂。
[0008]在一些实施方案中，步骤(a)包括向掺杂制剂添加蛋白质变性剂。在一些实施方案中，步骤(a)包括在室温下用添加的蛋白质变性剂孵育掺杂制剂约1-10分钟(例如，约2-9、2-8、2-7、3-10、3-9、3-8、3-7、3-6、4-10、4-9、4-8、4-7、4-6 分钟)。在一些实施方案中，步骤(a)包括在室温下用添加的蛋白质变性剂孵育掺杂制剂约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10分钟。在一些实施方案中，步骤(a)包括在室温下用添加的蛋白质变性剂孵育掺杂制剂约5分钟。在一些实施方案中，适合的蛋白质变性剂选自脲、硫氰酸胍、KCl、十二烷基硫酸钠、十二烷基肌氨酸钠、其它洗涤剂及其组合。
[0009]在一些实施方案中，步骤(a)包括向掺杂制剂中添加脲以达到约IM或更高的所得脲浓度。在一些实施方案中，所得脲浓度为约2M或更高、3M或更高、4M或更高、5M或更高、6M或更高，7M或更高、8M或更高、9M或更高，或1M或更高。
[0010]在一些实施方案中，步骤(a)包括向掺杂制剂中添加硫氰酸胍以达到约IM或更高的所得硫氰酸胍浓度。在一些实施方案中，所得硫氰酸胍浓度为约2M或更高、3M或更高、4M或更高、5M或更高、6M或更高、7M或更高、8M或更高、9M或更高，或1M或更高。
[0011]在一些实施方案中，步骤(a)包括向掺杂制剂中添加KCl以达到约IM或更高的所得KCl浓度。在一些实施方案中，所得KCl浓度为约2M或更高、3M或更高、4M或更高，或5M或更高。
[0012]在一些实施方案中，仅使用水溶剂进行切向流过滤。在一些实施方案中，使用水作为溶剂进行切向流过滤。在一些实施方案中，以大约100-200mL/分钟(例如，大约100-180mL/ 分钟、100_160mL/ 分钟、100_140mL/ 分钟、110_190mL/ 分钟、110_170mL/ 分钟或110-150mL/分钟)的给料速度和/或大约10_50mL/分钟(例如，大约10_40mL/分钟、10-30mL/分钟、20-50mL/分钟或20_40mL/分钟)的流速进行切向流过滤。在一些实施方案中，以大约 100、110、120、130、140、150、160、170、180、190 或 200mL/ 分钟的给料速度和 /或大约10、20、30、40或50mL/分钟的流速进行切向流过滤。
[0013]在一些实施方案中，从步骤(b)纯化的mRNA含有少于约5% (例如，少于约4%、3%、2%或1%)的提前中断RNA序列和/或用于体外合成的酶试剂。在一些实施方案中，从步骤(b)纯化的mRNA含有少于约1% (例如，少于约0.9%,0.8%,0.7%,0.6%,0.5%,0.4%、0.3%、0.2%或0.1% )的提前中断RNA序列和/或用于体外合成的酶试剂。在一些实施方案中，从步骤(b)纯化的mRNA含有少于0.5%的提前中断RNA序列和/或用于体外合成的酶试剂。在一些实施方案中，从步骤(b)纯化的mRNA含有少于0.1 %的提前中断RNA序列和/或用于体外合成的酶试剂。在一些实施方案中，如通过溴化乙锭和/或考马斯亮蓝染色(Coomassie staining)测定，从步骤(b)纯化的mRNA含有不可检测的提前中断RNA序列和/或用于体外合成的酶试剂。
[0014]在一些实施方案中，提前中断RNA序列包含少于15个碱基(例如，少于14、13、12、11、10、9或8个碱基)。在一些实施方案中，提前中断RNA序列包含约8_12个碱基。
[0015]在一些实施方案中，用于体外合成的所述酶试剂包含T7RNA聚合酶、DNA酶1、焦磷酸酶和/或RNA酶抑制剂。在一些实施方案中，用于体外合成的所述酶试剂包含T7RNA聚合酶。
[0016]在一些实施方案中，切向流过滤在向体外合成的mRNA加帽和聚腺苷酸(poly_A)尾之前进行。在一些实施方案中，切向流过滤在向所述体外合成的mRNA加帽和聚腺苷酸尾之后进行。在一些实施方案中，切向流过滤在向所述体外合成的mRNA加帽和聚腺苷酸尾之前和之后进行。
[0017]在一些实施方案中，体外合成的mRNA长度大于约lkb、1.5kb、2kb、2.5kb、3kb、3.5kb、4kb、4.5kb或5kb。在一些实施方案中，体外合成的mRNA包含一个或多个修饰以增强稳定性。在一些实施方案中，所述一个或多个修饰选自经修饰的核苷酸、经修饰的糖磷酸骨架、5’和/或3’非翻译区。在一些实施方案中，体外合成的mRNA未经修饰。
[0018]在一些实施方案中，从步骤(b)纯化的mRNA具有高于约95% (例如，高于约96%、97%、98%、99%或更高)的完整性。在一些实施方案中，从步骤(b)纯化的mRNA具有高于98%的完整性。在一些实施方案中，从步骤(b)纯化的mRNA具有高于99%的完整性。在一些实施方案中，从步骤(b)纯化的mRNA具有高于大约100%的完整性。
[0019]本发明还提供了生产信使RNA(mRNA)的方法，包括体外合成mRNA，并且使用根据本文所述的方法纯化体外合成的mRNA的步骤。
[0020]本发明还提供了根据本文所述的方法纯化的信使RNA(mRNA)。
[0021]在本申请中使用的术语“约”和“大约”作为等效项使用。本申请中使用的任何数值，在有或无约/大约的情况下，意指涵盖相关领域中的普通技术人员理解的任何正常变动。
[0022]在随后的详细描述中，本发明的其它特征、目的和优点是显而易见。然而，应理解，详细描述虽然表明本发明的实施方案，但仅以示例说明而非限制的方式提供。基于详细描述，在本发明范围内的各种变化和修改对本领域技术人员而言将变得显而易见。
[0023]附图简述
[0024]以下图仅是出于示例说明目的而非限制。
[0025]图1显示了如凝胶电泳和考马斯亮蓝染色所示，连同各种对照一起，根据提供的包括暴露于脲的方法纯化的FFL mRNA样品体外转录的示例性蛋白质水平。
[0026]图2显示了如琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色所示，与根据传统方法纯化的mRNA相比，根据提供的方法纯化的体外转录样品的示例性萤火虫荧光素酶(FFL)mRNA水平。
[0027]图3显示了与根据传统方法凝胶电泳和考马斯亮蓝染色纯化的mRNA相比，根据提供的包括暴露和不暴露于5M脲的TFF的方法纯化的FFL mRNA样品体外转录的示例性蛋白质水平。
[0028]图4描绘了与由传统方法提供的纯化mRNA相比，从由提供的方法提供的翻译纯化FFL mRNA收集的示例性荧光数据。
[0029]图5显示与根据传统方法凝胶电泳和考马斯亮蓝染色纯化的mRNA相比，来自于根据提供的包括暴露于蛋白酶K和/或5M脲的方法纯化的因子IX(FIX)mRNA体外转录样品的示例性蛋白质水平。
[0030]图6显示了如琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色所示，根据提供的方法纯化的体外转录样品中的示例性FIX mRNA水平。
[0031]图7显示了与根据传统方法凝胶电泳和考马斯亮蓝染色纯化的mRNA相比，根据提供的包括暴露于2M KCl的方法纯化的囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)mRNA的体外转录样品中的示例性蛋白质水平。
[0032]图8显示了如琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色所示，根据提供的包括暴露于2MKCl的方法纯化的体外转录样品中的示例性CFTR mRNA水平。
[0033]图9显示了如琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色所示，与根据传统方法纯化的mRNA相比，根据提供的包括暴露于2M KCl的方法纯化的体外转录样品中的示例性CFTR mRNA水平。
[0034]定义
[0035]为了使本发明更易于理解，首先定义某些术语如下。对以下术语及其它术语的其它定义在整个说明书中进行阐述。
[0036]动物:如本文所用的，术语“动物”是指动物界的任何成员。在一些实施方案中，“动物”是指处于任何发育阶段的人类。在一些实施方案中，“动物”是指处于任何发育阶段的非人类动物。在某些实施方案中，非人类动物是哺乳动物(例如，啮齿动物、小鼠、大鼠、兔、猴、狗、猫、羊、牛、灵长类动物和/或猪)。在一些实施方案中，动物包括但不限于，哺乳动物、鸟类、爬行动物、两栖动物、鱼、昆虫和/或蠕虫。在一些实施方案中，动物可以是转基因动物、基因工程动物和/或克隆。
[0037]大约或约:如本文所用的，术语“大约”或“约”在应用于一个或多个相关的值时是指与所指的值相似的值。在某些实施方案中，除非另有说明或者从上下文显而易见有所不同(除了此类数值将超过可能值的100%的情况之外)，术语“大约”或“约”是指以任一方向在(大于或小于)所述参考值的25%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或更小的范围内的值。
[0038]生物活性:如本文所用的，短语“生物活性”是指在生物体系中，特别是在生物体中具有活性的任何药物的特征。例如，在向生物体施用时对该生物体具有生物学效应的药物被视为具有生物活性。
[0039]表达:如本文所用的，核酸序列的“表达”是指将mRNA翻译成多肽(例如，抗体的重链或轻链)、将多个多肽(例如，抗体的重链或轻链)组装成完整蛋白(例如，抗体)和/或将多肽或完全组装的蛋白(例如，抗体)翻译后修饰。在本申请中，术语“表达”和“产生”以及语法等效项可互换使用。
[0040]功能性:如本文所用的，“功能性”生物分子是处于其呈现出它特征性的性质和/或活性的形式的生物分子。
[0041]改进、增高或降低:如本文所用的，术语“改进”、“增高”或“降低”或者语法等效项表明相对于基线测量值如在开始本文所述的治疗之前在相同个体中的测量值或者在没有本文所述的治疗下在对照受试者(或多个对照受试者)中的测量值的值。“对照受试者”是罹患与接受治疗的受试者相同的疾病形式的受试者，其与该接受治疗的受试者的年龄大约相同。
[0042]杂质:如本文所用的，术语“杂质”是指限定量的液体、气体或固体内，不同于靶材料或化合物的化学组成的物质。杂质也称为污染物。
[0043]体外:如本文所用的，术语“体外”是指发生在人工环境中，例如，在试管或反应容器中，在细胞培养物等中而不是在多细胞生物体内的事件。
[0044]体内:如本文所用的，术语“体内”是指发生在多细胞生物体如人和非人类动物内的事件。在基于细胞的系统的上下文中，该术语可以用来指发生在活细胞(与例如体外系统相对)内的事件。
[0045]分离的:如本文所用的，术语“分离的”是指物质和/或实体，其已经(I)与在最初产生(无论在自然界中和/或在试验环境中)时与它结合的组分中的至少一些分离，和/或
(2)通过人工进行生产、制备和/或制造。分离的物质和/或实体可以从与它们最初结合的其它组分的约10%、约20%、约30%、约40%、约50%、约60%、约70%、约80%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99%或者大于约99%分离。在一些实施方案中，分离的药物是约80%、约85%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99%或者大于约99%纯度。在本文中使用时，若物质基本上不含有其它组分，则它是“纯的”。在本文中使用时，分离的物质和/或实体的百分比纯度的计算不应该包括赋形剂(例如，缓冲剂、溶剂、水等)。
[0046]信使RNA(mRNA):如本文所