包含m10c1化合物与活性成分的组合物及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于医药生物领域，具体涉及包含MlOCl化合物与活性成分的组合物及其 制备方法。
【背景技术】
[0002] 双链RNA(dsRNA)抑制蛋白的表达，沉默基因，具有广泛的、潜在的治疗人类疾 病的用途。dsRNA诱导基因沉默有三种方式：1、转录功能的失活，这一现象是指RNA指导 下的DNA或组蛋白甲基化；2、小干扰核酸（smallinterferingRNA，siRNA)诱导的信使 RNA(mRNA)的降解；3、RNA介导的转录功能的衰减。但一般认为dsRNA诱导的基因干扰（抑 制）指的是动物细胞内的RNA降解。化学合成的小分子RNA，如siRNA，能够在亚微摩尔浓 度中，酶催化下降解细胞内的mRNA达95 %以上。
[0003]RNAi的效果能够持续很长时间，甚至持续至几代细胞分裂，同时基因干扰是序列 特异性的抑制。所以，RNAi能特异性的抑制基因表达，而不影响其他的mRNA，这种特异性的 抑制在研究基因功能和药物靶点的签定有特别重要作用。siRNA能够用于开发成药物治疗： 1、由于基因过度表达或正常下不表达的基因；2、突变的基因而引起的疾病。
[0004]RNAi能应用于开发不同于小分子和蛋白的新一类药物，虽然长的dsRNA引起细胞 的干扰素反应，不能直接传递到细胞，但siRNA的应用还是比较成功的。已经成功的广泛应 用于研究并已进行了临床试验。
[0005] 应用于治疗方面，首先是用于老年性黄斑性病变和呼吸道合胞病毒。其它报道的 治疗的疾病，包括抗病毒HIV，甲、乙、丙型肝炎、感冒和麻疹等；治疗神经性退行性病变，特 别是亨廷顿氏病，如多聚谷氨酰胺疾病也有报道。RNAi也可以通过抑制过度表达的基因遏 制肿瘤细胞的分裂，治疗癌症。然而，一个非常重要的领域是开发一个安全的siRNA传递技 术，才能保证RNAi的临床应用。
[0006] 尽管细胞水平的研究表明RNAi是一个非常有前途的药物开发平台，siRNA的脱靶 效应，是否可引起一些副作用也同时引起了注意，因为脱靶效应可抑制与靶基因相似序列 的基因。据计算，脱靶效应可达10%。在哺乳细胞，长的双链siRNA可诱导干扰素反应。因 此，siRNA或者iNA(interferingnucleicacid，干扰核酸）必须保持短的序列，以避免干 扰素反应。能够设计一个siRNA或iNA没有干扰素反应最好的一个方法是设计一个治疗性 的iNA或siRNA能作用于一个或一个以上的靶基因，或一个靶基因的不同部位，它的结构可 是一个方向，或不同方向，环形的，类似环形的、或直线型的。这几种类型iNAorsiRNA与 常用的siRNA的结构不同。研究表明：通过对siRNA结构进行化学修饰和对siRNA骨架进 行载体修饰是提高siRNA体内传递稳定性的两个重要途径。
[0007]siRNA发挥作用时具有高度的序列特异性和很强的靶向性。RNAi具有级联放大效 应，极少量的双链核糖核酸（double-strandedRNA，dsRNA)便可降解比自身浓度大得多的 mRNA，但体内注射siRNA后，必须经过包裹，通过全身循环系统，尽可能避免肾脏肾小球的 滤过，吞噬细胞的吞，血清蛋白吸附和内源性核酸酶的降解，以及网状内皮系统（RES)的 滞留才能到达靶细胞。siRNA在血清中的稳定性较差，容易被核酸酶RNase降解。静脉注 射SiRNA后，SiRNA通过血液循环分布到各大器官，同时被消除。包裹的SiRNA经血管进入 组织间质（外渗），然后横跨间质到达靶细胞，到达靶细胞后通过内吞摄取。在此过程中， 包裹的siRNA被内涵体启动的内吞小囊泡包埋，必须从内涵体逃逸，释放到细胞质中，并加 载至RISC方能发挥作用。siRNA的外渗和穿透能力取决于靶组织的物理结构，而它的胞内 摄取量还与siRNA与载体的表面性质有关。将siRNA传递到靶部位的最大障碍是内涵体对 siRNA和载体的包埋和溶酶体对siRNA和载体的降解。
[0008] 裸SiRNA自身带负电，分子量大，极性强，很难穿过细胞膜、血管内皮，容易在脾脏 滞留，在生物体内容易被核酸酶降解，半衰期短，转染效率低，甚至会产生强烈的炎症反应 等。因此，siRNA的体内稳定性对其疗效的发挥至关重要。利用各种载体的协助，将siRNA 通过不同的手段高效地递送到靶细胞是当前研究的重点。
【发明内容】
[0009] 本发明一个技术方案是提供一种包含MlOCl化合物与活性成分的组合物，所述的 MlOCl化合物结构式如下：
[0010]
[0011] 进一步地，还包含胆固醇-聚乙二醇，所述的活性成分为SiRNA。
[0012] 更进一步地，按照质量份数计算，所述的siRNA1-5份和MlOCl化合1-24份，胆固 醇-聚乙二醇1-10份。
[0013] 进一步地，所述的siRNA序列为HBVsiRNA:
[0014]正义链：[mC]CG[mU]GUG[mC]ACUUCGCUU[mC]A[dT] [dT];
[0015]反义链：UGAAGCGAA⑶G[mC]A[mC]ACGGUC。
[0016] 进一步地，按照质量份数计算，所述的siRNAl份MlOCl化合物I.5份，胆固醇-聚 乙二醇3份。
[0017] 进一步地，胆固醇-聚乙二醇选自胆固醇-PEG400,胆固醇-PEG600和胆固 醇-PEG2000,胆固醇-PEG1000,胆固醇-PEG5000中的一种或几种。
[0018] 本发明还提供包含MlOCl化合物与活性成分的组合物的制备方法，包括以下步 骤：
[0019] (1)将SiRNA溶解于枸橼酸溶液中，pH5. 0,得溶液一；
[0020] (2)取胆固醇-聚乙二醇，MlOCl化合物，并将胆固醇-聚乙二醇和MlOCl化合物 溶解于溶剂中得溶液二；
[0021] (3)将溶液一放置于磁力搅拌器上，一边搅拌一边将溶液二缓慢滴入溶液一中，混 合后，加入磷酸缓冲液，将pH调至6-8,优选7,通过透析，置换缓冲液，浓缩；
[0022] (4)再对浓缩液进行高压均质、冻干，形成干燥物，即得所述的组合物。
[0023] 步骤（2)的组分的重量的和与所述siRNA序列组中的一组或混合的重量比为 2-10 : 1;配制完成后的溶液一与溶液二的体积比为1 : 0. 2-1，优选1 : 0.25-0.8。
[0024] 更进一步地，所述溶剂为甲醇、乙醇、氯仿、丙酮、乙酸乙酯中的一种或两种以上的 组合。
[0025] 本发明的包含MlOCl化合物与活性成分的组合物可提高siRNA治疗的药动学特 征，改变生物分布、胞内摄取量、靶向性和转染效率，减少不良反应等。MlOCl化合物与活性 成分组成的组合物，能够将siRNA包裹，在体内递送到靶组织中，稳定siRNA分子。在纳米 颗粒被内吞摄取，进入细胞的内涵体时MlOCl也起着关键的作用。MlOCl分子是一个两性大 环脂质分子。在纳米颗粒形成后，其亲水基团暴露在颗粒外边。而且纳米颗粒的表面电荷 随其环境pH的变化而变化。在正常的血液中，pH接近中性，其颗粒表面不带电荷，避免与 血浆蛋白结合及被白细胞的吞噬。当进入到细胞内涵体时，由于其PH值降低，呈酸性而带 正电（表一）。在氢离子从外部流入内涵体过程中，由于内涵体的压力增加而破裂（海绵似 的效应）。释放siRNA到细胞质中，发挥其特异性的基因抑制功能（基因沉默）。
【具体实施方式】
[0026] 实施例1合成化合物MlOCl化合物
[0027]MlOCl化合物是（1，4, 7,10,13,16-六氮杂环十八烷六盐酸盐）和环氧化合物在装 有搅拌子的玻璃瓶内无溶剂下90°C反应得到。反应时间为90°C下24-72小时。其N，N-二 (3-氨丙基）甲胺与环氧烷基化合物（烷基（C12-C14)缩水甘油醚，C12-14缩水甘油醚在 反应中比例（摩尔比）为1 : 4。其结果已知从薄层色谱（TLC)上得到证实，反应混合物中 只存在一种主要产物。反应物的产物通过提纯后即可应用；
[0028] 实施例2
[0029] 胆固醇_聚乙二醇化合物的合成方法是：在2000毫升圆底烧瓶放置，为（1S，2R， 55，105，115，141?，151?)-2，15-二甲基-14-[(21?)-6-甲基庚基-2基]四环[8.7.0.0~[2， 7].(T[11，15]]十七烷-7-烯-5-醇（200 克，517. 26mmol，l. 0 当量，吡啶（1000毫升）。加入 4-甲苯磺酰氯（148克，776. 30 1. 50当量）。在油浴50°C搅拌过夜。反应混合物用水/冰浴 冷却到低温室。加2000毫升醚稀释。向混合物加水1X1000水和5x1000 20%柠檬酸。由此产 生的混合物用IxlOOOmlsat.NaClaq洗。由此产生的产品在真空下浓缩。大约180克（64%) 白色固体（1S，2R，5S，10S，11S，1