治疗剂的递送的制作方法
【专利说明】治疗剂的递送 发明领域
[0001] 本发明涉及通过细胞来源的囊泡递送潜在的治疗剂。
[0002] 发明背景
[0003] 癌症是全世界死亡的主要原因。2008年，根据世界卫生组织（WH0)，各种癌 症导致了 760万例死亡（约所有死亡例的13% )，并且这个数字预计将继续上升， 估计在 2030 年全世界有 1310 万死亡例[GL0B0CAN2008 (IARC)SectionofCancer Information(11/11/2012)]。
[0004] 恶性黑色素瘤是由皮肤肿瘤引起的大多数死亡的原因，并且是年轻人中最常见 的恶性肿瘤。当黑色素瘤是转移性的时，预后不利，且治疗可选方案很少。葡萄膜黑色素 瘤具有不同于皮肤黑色素瘤的临床特征，并经常主要传播至肝。对于葡萄膜黑色素瘤，已 指出大约一半的患者在眼部原发性肿瘤治疗后的15年内将发展转移病灶。肝转移诊断 后的平均存活时间为8至10个月，且具有葡萄膜黑色素瘤的肝转移的患者的死亡率在 两年中是92%。一种治疗选择是对肝部局部灌注过高温度（hyperthermia)和溶肉瘤素 (melphalan)。然而，这种方法极具侵入性并与手术并发症的风险相关。尽管在大多数病例 中观察到缓解，但是存活期仅稍许延长。
[0005] 皮肤的黑色素瘤和葡萄膜黑色素瘤仅仅是每年夺走数百万人的生命的癌症的两 个实例。因此，癌症治疗是现代医学面对的主要挑战之一。
[0006] 总体上，目前的抗癌治疗策略包括外科手术、放射治疗、细胞毒性药物（化疗）和 激素药物。化疗剂的缺点是，它们是非选择性的并引起不良的副作用，该不良的副作用有效 地限制剂量并因此还限制治疗效果。存在对改进的、更有选择性的癌症疗法的需要。
[0007] 直接革E1向点突变致癌基因的药物的罕见实例是维罗非尼（vemurafenib)，其特 异性地靶向皮肤黑素瘤中常见的BRAFV6°°E突变，与化疗相比具有相对较少的脱靶效应 (off-targeteffect)。然而，这种治疗在转移性黑色素瘤中仅使寿命延长几个月，且仅在 具有该特定突变的那些黑色素瘤中有效。因此，一种可能性将是，靶向下游的信号转导分 子。然而，下游靶标缺乏酶活性，并且由于其三级结构，常常不可能用小分子治疗。另外，由 于小分子抑制剂会遍及全身分布，其也会在依赖这些下游分子的正常的健康细胞中引起全 身性副作用。
[0008] 在过去十年中，基因治疗已经受到越来越多的关注，并认为在未来，基因治疗可应 用于许多疾病，包括癌症。
[0009] 基因治疗的最常见形式涉及使用编码功能性、治疗性基因的DNA来代替突变基 因。其他类型的基因治疗涉及直接校正突变，或使用编码治疗性蛋白药物的DNA(而不是天 然的人类基因）来提供治疗。还已提出，称为RNAi的RNA干扰对于开发针对例如，传染病 或癌症的基因治疗可能是合适的。
[0010] 自20世纪90年代末，已经知晓，RNAi是发生在许多真核细胞中的基因调控机制， 且已被用作实现基因敲除的主要研究工具。
[0011] 然而，发展基于RNAi的疗法和其他基因治疗应用的主要挑战是，治疗剂（例如， RNA分子）的递送。病毒载体可能是有效的，但是可能产生安全隐患，并且可被患者的免疫 系统快速消除，降低其作用。
[0012] 当靶标是对正常的健康细胞的功能也重要的基因或基因产物时，递送方式是特别 重要的。因此，将药物以集中的方式递送至患病细胞特别地具有降低全身性副作用及其他 细胞中的副作用的潜力。
[0013] 因此，成功靶向参与疾病，包括癌症的基因及蛋白的一个障碍是开发安全且有效 的将治疗剂递送至靶标的方法。
[0014] 发明概沐
[0015] 本发明的目的是至少部分地克服现存技术的缺点，并提供将治疗剂，特别是寡核 苷酸递送至靶细胞的手段。
[0016] 在第一方面，这些目的及其他目的通过产生包含针对致癌基因或原癌基因或其基 因产物的抑制剂寡核苷酸的纳米囊泡的方法来实现，所述方法包括
[0017]a)将编码能够抑制人致癌基因或原癌基因或其基因产物的核酸的DNA序列引入 哺乳动物细胞；
[0018] b)在允许表达所述寡核苷酸抑制剂的条件下维持细胞；以及
[0019] c)从所述细胞获得包含所述寡核苷酸抑制剂的纳米囊泡。
[0020] 获得纳米囊泡的步骤可包括从细胞培养物中分离天然释放的细胞外囊泡，和/或 通过微米过滤器和/或纳米过滤器挤压细胞产生纳米囊泡。
[0021] 如本文所用，"致癌基因"是指具有导致癌症的潜力的基因。在癌细胞中，致癌基因 经常突变或以高水平表达（上调或扩增）。"原癌基因"是指，由于突变或增加的表达可变 成致癌基因的基因。已知的原癌基因的实例包括狀3、1犯\1^(：、￡服和了服。
[0022] 如本文所用，"纳米囊泡"是指具有在纳米范围内并且通常小于500nm的尺寸的细 胞来源的囊泡。"细胞来源的囊泡"包括细胞天然释放的细胞外囊泡或外来体，以及通过微 米过滤器和/或纳米过滤器连续挤压细胞而从细胞产生的囊泡。通过连续挤压从细胞产生 的纳米囊泡可称为"人工纳米囊泡"，然而应注意，在该背景下"人工"仅意指并非由细胞天 然释放的纳米囊泡（相对于例如，外来体而言）。因此，在该背景下"人工"并不暗示着纳米 囊泡是合成的；它们仍旧是细胞来源的并由与纳米囊泡所源自的细胞（"生产细胞"）相同 的组分构成。
[0023] 如本文所用，"抑制"意指例如，通过抑制转录、mRNA降解、或抑制mRNA翻译为蛋 白，减少产生功能性基因产物（例如蛋白）的基因的表达。在本发明的上下文中，"抑制"不 必是完全的；部分抑制或阻抑或下调也可提供期望的作用。
[0024] 如本文所用，"寡核苷酸抑制剂"是指为抑制剂，S卩，能够抑制靶分子的寡核苷酸。 它还可称为"寡核苷酸抑制剂"。
[0025] 因为纳米囊泡的产生可容易地通过培养更多的生产纳米囊泡的细胞按比例放大， 且纳米囊泡可以在适当的时间点大量地产生，例如当细胞正在表达最佳水平的靶分子时， 所以本发明的方法是有利的，特别是与使用合成递送媒介物，诸如合成脂质体相比。另外， 本发明获得的纳米囊泡，特别是通过连续挤压生产细胞获得的纳米囊泡，可包含较高浓度 的抑制剂寡核苷酸（较高的负载能力），并可更容易地负载抑制剂寡核苷酸，诸如siRNA。此 外，纳米囊泡的各种修饰，例如通过在表面上表达革G向分子的修饰，成为可能或至少被极大 地简化。本发明的方法还具有成本效益，因为产生纳米囊泡的细胞的培养物可通过正常的 细胞培养按比例放大，并且还可被冷冻，这减少了与细胞的贮藏寿命（shelf-life)相关的 浪费。
[0026] 在本发明的实施方案中，抑制剂寡核苷酸是人致癌基因性或原癌基因性转录因子 (oncogenicorproto-oncogenictranscriptionfactors)的抑制剂。通过革巴向车专录因 子，许多不同的恶性肿瘤可被一种抑制剂来抑制。优选地，抑制剂寡核苷酸可以是人MYC基 因或基因产物，优选地c-Myc基因或基因产物的抑制剂，或E2F基因家族成员或其基因产物 的抑制剂。在其他实施方案中，抑制剂寡核苷酸可以是缺乏酶活性的人细胞信号转导分子， 例如Ras家族成员的抑制剂。
[0027] 在本发明的实施方案中，寡核苷酸可以是RNA，优选RNAi分子。RNAi分子可选自 由以下组成的组：shRNA、siRNA、miRNA、piRNA、nasiRNA或反义RNA，或具有RNAi能力的任 何其他分子。
[0028] 在本发明的实施方案中，编码能够抑制人致癌基因或原癌基因的寡核苷酸的DNA 序列可以是选自由以下组成的组的DNA序列：SEQ ID N0:l-92和SEQ ID N0:185-218,优选 地选自由以下组成的组：3￡〇10勵：1-32、5￡〇10勵:33-67、和5￡〇10勵：185-218，更优 选地选自SEQ ID NO: 1-10和SEQ ID NO: 185-196当中。
[0029] 在本发明的实施方案中，细胞可在细胞表面表达靶向分子。
[0030] 如本文所用，"靶向分子"意指能够特异性结合另一个分子（"靶分子"）的分子。 因此，靶向分子可用于将例如在其表面上呈递靶向分子的细胞或囊泡特异性定位至某一实 体，诸如呈递靶分子的癌细胞。
[0031] 靶向分子可以是特异性结合癌细胞上过表达的表面蛋白的配体。靶向表面分子在 产生纳米囊泡的细胞中的表达可提供从这些细胞获得的纳米囊泡的组织特异性靶向。使生 产细胞表达靶向分子具有的优势是，该细胞创建了膜结合的分子，所述膜结合的分子可更 有效地与靶向受体相互作用，而脂质体工程化靶向的效力却往往不能做到。
[0032] 任选地，该方法可包括在步骤a)之前或与步骤a)同时，引入编码待在细胞表面上 表达的革G向分子的DNA序列。
[0033] 在本发明的实施方案中，细胞可表达至少两种不同的靶向分子，这可进一步提高 革巴向特异性或以其他方式改善这些细胞和/或纳米囊泡对癌细胞的革巴向。
[0034] 合适的靶向分子的实例包括表皮生长因子（EGF)、促黑激素（MSH)或针对癌细胞 上过表达的表面蛋白的抗体的可变区、或所述抗体的fab-片段。
[0035] 在本发明的实施方案中，细胞是人细胞且致癌基因或原癌基因是人致癌基因或原 癌基因。在这样的实施方案中，人细胞可用遗传构建体转染或转导，所述遗传构建体包含这 样的基因，其基因产物在功能上代替人细胞天然表达的人致癌基因或原癌基因。例如，人致 癌基因或原癌基因可以是MYC基因家族中的一个成员，且该遗传构建体可包括MYC基因家 族的另一个成员。
[0036] 在本发明的实施方案中，细胞可用构建体转染或转导，所述构建体包含N-Myc基 因或L-Myc基因并且过表达N-Myc或L-Myc〇
[0037] 在本发明的实施方案中，以上方法的步骤a)可包括引入包含编码能够抑制人 c-Myc的寡核苷酸的所述DNA序列的遗传构建体，所述DNA序列可操作地连接至诱导型启动 子，且步骤b)可包括通过激活所述诱导型启动子诱导表达。
[0038] 根据本发明的产生纳米囊泡的方法可在体外或离体进行。
[0039] 在另一个方面，本发明提供了通过以上描述的方法产生的分离的纳米囊泡。
[0040] 如本文所用，"分离的纳米囊泡"是指，至少已从生产细胞中被分离，通常从生产细 胞培养物中被分离，或当按照下文所述的通过微米过滤器或纳米过滤器连续挤压产生人工 纳米囊泡时，从所获得的第一滤出物中被分离的纳米囊泡。分离的纳米囊泡通常被包含在 培养基或组合物中，并且可能已经受一个或更多个分离