或纯化步骤以例如通过离心和/或 过滤除去例如，细胞碎片或源自细胞的其他组分。
[0041] 应当理解，尽管本说明书引述了"一个纳米囊泡"，该术语还涵盖多个纳米囊泡。
[0042] 在另外的方面，本发明提供了包含人致癌基因或原癌基因，优选地人致癌基因性 或原癌基因性转录因子的抑制剂寡核苷酸的分离的纳米囊泡。特别是，致癌基因或原癌基 因可以是MYC基因家族的成员，且更优选编码人c-Myc的基因。可选择地，致癌基因或原癌 基因可以是E2F基因家族的成员，且更优选编码人E2fl、E2f2或E2f3的人基因。作为另一 个实例，致癌基因或原癌基因可以是RAS基因家族的成员，且更优选编码人H-Ras、N-Ras或 K-Ras的人基因。
[0043] 在本发明的实施方案中，抑制剂寡核苷酸可以是RNA，优选RNAi分子。RNAi分子 可选自由以下组成的组：shRNA、siRNA、miRNA、piRNA、nasiRNA或反义RNA，或具有RNAi能 力的任何其他分子。在一些实施方案中，RNA可以是包含选自由SEQIDN0:93-184组成的 组、优选地选自由SEQIDNO: 93-124 (靶向myc)和125-159 (靶向E2f)组成的组、例如选 自SEQIDN0:93-102(靶向c-myc)当中的序列的shRNA或siRNA。
[0044] 然而，寡核苷酸还可以是DNA，例如反义寡核苷酸（AS0)。
[0045] 在另外的方面，本发明提供了用遗传构建体转染或转导的人细胞，所述遗传构建 体包含这样的基因，其基因产物在功能上代替所述人细胞天然表达的人致癌基因或原癌基 因。因此，生产细胞可被修饰为不依赖预期被抑制剂寡核苷酸抑制的基因的正常、非病理学 表达。结果是，生产细胞的生长和存活力可不受抑制剂寡核苷酸的产生的影响。特别是，人 致癌基因或原癌基因可以是MYC基因家族中的一个成员，且被引入细胞的遗传构建体可以 是MYC基因家族的另一个成员。例如，人致癌基因或原癌基因可以是c-Myc，且遗传构建体 可包含编码N-Myc或L-Myc的基因。
[0046] 在本发明的实施方案中，人细胞还可包含编码所述致癌基因或原癌基因的抑制剂 寡核苷酸的DNA序列。
[0047] 在另外的方面，本发明提供了用DNA序列转导或转染的人细胞，所述DNA序列编码 人致癌基因或原癌基因，优选地人致癌基因性或原癌基因性转录因子的抑制剂寡核苷酸， 其中所述DNA序列可操作地连接至诱导型启动子。
[0048] 包含编码人致癌基因或原癌基因的抑制剂寡核苷酸的DNA序列的人细胞可包括 选自由SEQIDN0:1-92和SEQIDN0:185-218组成的组、优选地选自由SEQIDN0:1-32、 SEQIDN0:33-67和SEQIDNO: 185-218组成的组、更优选地选自SEQIDNO: 1-9和SEQID NO: 185-196当中的DNA序列。
[0049] 在本发明的实施方案中，人细胞可以是干细胞，优选胚胎干细胞或间充质干细胞。
[0050] 在另一个方面，本发明提供了用编码人致癌基因或原癌基因的抑制剂寡核苷酸的 DNA序列转导或转染的非人哺乳动物细胞。
[0051] 本发明可用于将治疗剂体外或体内递送至细胞，例如用于治疗。因此，在另一个方 面，本发明提供了将针对人致癌基因或原癌基因的抑制剂寡核苷酸递送至细胞的方法，包 括使所述细胞与人细胞或如上所述的纳米囊泡接触。
[0052] 在实施方案中，向癌细胞体内递送针对人致癌基因或原癌基因的抑制剂寡核苷酸 的方法，包括以下步骤
[0053] a)向具有所述癌细胞的患者施用转导或转染了编码人致癌基因或原癌基因的抑 制剂寡核苷酸的DNA序列的细胞，其中所述DNA序列可操作地连接至诱导型启动子，以及
[0054] b)通过施用激活所述诱导型启动子的物质诱导抑制剂寡核苷酸的表达。
[0055] 因此，本文描述的纳米囊泡可用于治疗癌症。
[0056] 在又另一个方面，本发明涉及包含如本文描述的纳米囊泡和药学上可接受的载体 的组合物。该组合物和/或纳米囊泡可以用作药物，特别是用于治疗癌症的药物。待治疗的 癌症可选自由以下组成的组：恶性黑色素瘤、结肠直肠癌、卵巢癌、乳腺癌、肾癌、胃肠癌、脑 癌、肺癌、鼻咽癌、食道癌、胃癌、肝癌、宫颈癌、前列腺癌、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、 鼻NK/T细胞淋巴瘤、肉瘤、白血病、神经内分泌癌、中线癌、神经母细胞瘤和头颈癌。
[0057] 发明详沐
[0058] 本发明基于认识到，源自细胞，包括哺乳动物细胞的纳米囊泡可用作用于递送靶 向到基本的细胞功能的潜在的治疗性抑制剂分子的媒介物，具有与现有技术的递送技术相 比增加的效力和减少的不良副作用的风险。
[0059] 特别是，本发明人提出了，使用如本文所述的细胞和/或囊泡用于递送核酸，所述 核酸可选择性地抑制或阻抑致癌基因或原癌基因或相应的基因产物，例如致癌基因性或原 癌基因性转录因子和/或致癌基因性或原癌基因性信号转导分子的产生或功能。致癌基因 或原癌基因可以是未突变的致癌基因。
[0060] 特别感兴趣的致癌基因或原癌基因的一个家族是由MYC、MYCN和MYCL组成的MYC 基因家族。MYC基因家族编码分别为c-Myc(由MYC编码）、N-Myc(由MYCN编码）和L-Myc(由 MYCL编码）的三种不同的转录因子，这三种不同的转录因子调控大量的在恶性疾病中至关 重要的基因和细胞进程。但是，MYC基因家族在正常的细胞增殖中也是有活性的。
[0061] 编码c-Myc的基因，MYC，位于人基因组的8号染色体。Myc蛋白通过结合增强子 盒序列（E-盒）且还通过招募组蛋白乙酰转移酶（HAT)，从而调控染色质结构起作用。认为 Myc调控全部人基因的15 %的表达。
[0062] c-Myc和N-Myc在促有丝分裂信号诸如Wnt、Shh和EGF的下游（经由MAPK/ERK通 路）。由于这些通路常常被基因如APC(Wnt-通路）、PATCHED(Shh-通路）和EGFR、BRAF、 RAS、PTEN(EGF-通路）的突变激活，因此c-Myc或N-Myc在癌细胞中被诱发。
[0063] MYC还可被染色体易位至转录活跃的染色体位置，诸如B淋巴细胞中免疫球蛋 白基因座和T淋巴细胞中T细胞受体的那些转录活跃的染色体位置激活。这些易位导致 各种血液恶性肿瘤，诸如伯基特淋巴瘤或急性T淋巴细胞白血病（T-acutelymphocytic leukemia)〇
[0064] MYC家族成员的备选激活方式是经由扩增，这发生在各种癌症，包括肺癌（MYC、 MYCN和MYCL)、神经母细胞瘤（MYCN)和乳腺癌（MYC)中。
[0065] 通过修饰其他基因的表达，Myc的激活引起许多生物学作用。所发现的第一个生物 学作用是其刺激代谢的能力；例如，其刺激编码鸟氨酸脱羧酶和乳酸脱氢酶的基因的转录。 Myc还驱动细胞增殖（例如通过上调周期蛋白、E2f转录因子并下调p21)，且Myc在调控细 胞生长（上调核糖体RNA和蛋白）、细胞凋亡（下调Bcl-2)、分化和干细胞自我更新中起非 常重要的作用。
[0066] 已证明，用小分子靶向Myc蛋白中最常见的c-Myc是非常困难的，因为蛋白三级结 构缺乏可用作小的抑制性分子的结合位点的口袋。然而，已表明Myc蛋白的表达可由RNAi 分子阻断（Wang,H.，等人，c_Mycdepletioninhibitsproliferationofhumantumor cellsatvariousstagesofthecellcycle.Oncogene, 2008. 27(13):第 1905-15页）〇
[0067] 在Myc和其他细胞信号转导通路调控的下游被调控的一组基因是E2F家族的转录 激活因子。E2F1、E2F2和E2F3A编码刺激参与细胞周期进程的基因的转录因子，诸如细胞 周期蛋白E和Cdk2、DNA复制元件（例如DNA聚合酶、复制起点结合蛋白HsOrcl、MCM5和 cdc6)和核苷酸生物产生（nucleotide biogenesis)(胸苷激酶和二氢叶酸还原酶）的转录 因子。E2F家族还包含转录抑制因子（E2f3b和E2f4-8)。
[0068]E2f激活因子被RB1基因编码的成视网膜细胞瘤蛋白pRB结合。当被结合时，E2f 蛋白不能刺激细胞周期进程。为刺激细胞周期进程，PRB在多个位点上被细胞周期蛋白依 赖性激酶Cdk2、Cdk4和Cdk6磷酸化。这使得被结合的E2f?从pRB释放，导致E2f激活。 由于包括丢失RB1基因或⑶KN2A-C基因在内的许多原因，癌细胞可展示升高的E2f活性。 CDKN2A-C基因编码统称为Ink4蛋白的Cdk抑制因子pl5、pl6和pl8,其抑制Cdk4和Cdk6。 激活组成型E2f活性的其他方式是，通过Myc蛋白，或通过Cdk4的Ink4抗性突变引起的 ⑶K4、CCND2,且甚至E2F1基因的直接基因转录。
[0069] 用小分子靶向E2f蛋白中最常见的E2fl是困难的，因为E2fl是转录因子并因此 缺乏酶的活性位点。然而，已表明在黑色素瘤中，E2fl的表达可通过RNAi分子阻断，导致 细胞周期停滞和细胞衰老。（Verhaegen等人E2Fl_DependentOncogenicAddictionof MelanomaCellstoMDM20ncogene. 2012Feb16 ；31 (7)828-841)
[0070] 在本发明的实施方案中，抑制剂分子靶向的信号转导分子可以是缺乏酶活性的信 号转导分子。抑制剂分子靶向的信号转导分子可包括参与细胞内信号转导，例如调控细胞 生长、分化和存活的信号转导分子，诸如Ras蛋白家族，包括Kras、Hras和Nras。
[0071] 根据本发明的实施方案，包含抑制剂分子的纳米囊泡可在体外产生，从体外培养 的动物细胞，通常是哺乳动物细胞诸如鼠或人的细胞产生。纳米囊泡所产自的细胞在本文 中称为"生产细胞"。在本发明的实施方案中，纳米囊泡可包含细胞天然释放的外来体和其 他细胞外囊泡，以及通过微米过滤器和/或纳米过滤器连续挤压细胞产生的人工囊泡。在 本发明的其他实施方案中，纳米囊泡是人工纳米囊泡，其可通过微米过滤器和/或纳米过 滤器连续挤压细胞来产生。已知的是，通过过滤器挤压细胞使细胞崩解，并且细胞膜和膜碎 片（membranefractions)在该过程中重新装配。通过这种方法产生的囊泡的收率比天然 产生的外来体的收率高得多。
[0072] 本发明的实施方案中使用的人工纳米囊泡可通过微米过滤器和/或纳米过滤器 连续挤压生产细胞，通常是哺乳动物细胞来产生。纳米囊泡可通过如本文通过引用并入的 US2012/0177574(特别地参见[0