173]-[0197]段）中描述的方法来产生。这样人工产生的 纳米囊泡保留了生产细胞的膜结构，诸如脂质双层结构和包括细胞膜表面分子的拓扑学的 膜蛋白。此外，纳米囊泡保留了与生产细胞相同的细胞质组分。
[0073] 根据本发明的实施方案的纳米囊泡可具有多达500nm，例如多达300nm，诸如多达 250nm或200nm的尺寸。例如，纳米囊泡可具有100nm-200nm范围内的尺寸。然而，在一些 实施方案中，纳米囊泡可小于l〇〇nm，例如至少50nm或至少80nm。
[0074] 在本发明的实施方案中，外来体和其他囊泡，例如细胞天然产生和释放的微米囊 泡，还可包含抑制剂分子且任选地还在其表面上表达祀向分子。
[0075] 虽然外来体、微米囊泡和人工纳米囊泡具有若干相似性，但是这些囊泡之间还存 在重要差异。外来体通过参与细胞膜的向内出芽的天然过程产生，并经由多泡体形成。外 来体负载有非常特殊的物质，包括RNA，所述RNA不是随机选择的细胞内容物。此外，外来 体是非常紧密的结构，其已被证明难以负载外来的siRNA(Wahlgren等人，NucleicAcids Res. 2012S印1 ;40 (17) :el30)。另一方面，微米囊泡似乎在一些实验中包含比外来体少得多 的RNA〇
[0076] 通过微米过滤器和纳米过滤器连续挤压细胞产生的人工纳米囊泡确实在其表面 上包含该细胞不具有的任何蛋白，并且所述人工纳米囊泡还包含细胞质的随机选择物。因 此，靶向表面分子在工程化细胞的细胞膜中的过表达将导致该分子在人工纳米囊泡上的存 在。相似地，在细胞内过表达的分子，也将以高的浓度存在于人工纳米囊泡中。最重要的是， 人工纳米囊泡的收率被预期比细胞天然释放的外来体或其他细胞外囊泡的收率显著更高。
[0077] 在本发明的实施方案中，纳米囊泡内包含的抑制剂分子可以是核酸，通常是RNAi 分子，诸如shRNA、siRNA或miRNA，并且通常是shRNA或siRNA。
[0078] 称为RNAi的RNA干扰是存在于许多真核细胞中的基因调控机制。RNAi由Dicer 酶介导，所述Dicer酶将长的双链RNA分子（dsRNA)裂解成链较短的双链RNA，小干扰 RNA(siRNA)。siRNA的链被分成两个单链的RNA分子ssRNA，并且引导链被整合到称为RNA 诱导的沉默复合物（RISC)的复合物中，并可通过与mRNA分子互补结合沉默基因表达。RNAi 机制可用于选择性沉默感兴趣的基因，通过使包含为沉默特定mRNA而设计的核苷酸序列 的小发卡RNA分子（shRNA)在细胞中遗传工程化表达，并且随后shRNA被Dicer裂解为 siRNA〇
[0079] 如本文所用，"RNAi分子"通常是指参与RNAi过程的任何RNA分子，包括例如， dsRNA、短发夹RNA(shRNA，其可用为代替dsRNA的起始材料）、miRNA、siRNA和ssRNA。
[0080] 抑制剂寡核苷酸，且特别是RNAi的使用与小分子药物相比具有许多优势。小分子 表现出溶解度问题，这使得它们不可能被配制为用于体内递送。一经配制，它们还可能表现 出吸收问题，需要通过静脉内途径，而不是口服途径递送。小分子还可被血清蛋白结合或由 于过高的间隙压力而被妨碍不能进入例如肿瘤，导致分布不良。小分子还可全身分布，这导 致较低的肿瘤内浓度。小分子还可被代谢，导致稳定性降低并可能产生有毒的副产物。降 低的稳态水平还可能是排泄的结果。最后，小分子在活的多细胞生物体中可能具有多个靶 标并显示出毒性。另一方面，寡核苷酸迅速降解为无毒性残基。
[0081] 在本发明的实施方案中，抑制剂分子可以是可实现对Myc家族的成员的抑制的 RNAi分子。在这样的实施方案中，抑制剂分子可包含选自SEQIDN0:93-124当中，例如选 自5￡〇10勵:93-102(靶向（31^(：的1?熟）、5￡〇10勵：103-111(靶向11^(3)、或5￡〇10 NO: 112-124(靶向N-myc)的RNA序列。
[0082] 在本发明的实施方案中，抑制剂分子可以是可实现对E2F家族的成员，例如E2fl、 E2f2或E2f3的抑制的RNAi分子。这样的抑制剂分子可包含选自SEQIDN0:125-159， 例如SEQIDN0:125-140(靶向E2fl)、SEQIDN0:141-148(靶向E2f2)或SEQID NO: 149-159 (靶向E2f3)的RNA序列。
[0083] 又在本发明的其他实施方案中，抑制剂分子可以是可实现对Ras家族中的成 员例如Hras、Kras或Nras的抑制的RNAi分子。这样的抑制剂分子可包含选自SEQID NO: 160-184,例如选自SEQIDNO: 160-171 (靶向Hras)、SEQIDNO: 172-177 (靶向Kras) 或SEQIDNO: 178-184 (靶向Nras)的RNA序列。
[0084] 为了产生具有抑制剂分子，特别是RNAi分子，诸如shRNA或siRNA的期望的内容 物的纳米囊泡，可使用常规的遗传工程技术，例如，使用病毒载体将编码该抑制剂分子的 DNA序列插入生产细胞。适合于获得例如shRNA在动物，例如哺乳动物细胞中表达的载体是 本领域技术人员已知的，并可包括基于腺相关病毒、腺病毒或逆转录病毒/慢病毒的载体。
[0085] 因此，可将编码感兴趣的抑制剂分子的DNA序列引入生产细胞，所述生产细胞可 在允许所述DNA序列表达，即在生产细胞中产生抑制剂分子的条件下维持。通过引入编码 抑制剂分子的DNA序列，抑制剂分子可以以高的量在生产细胞内表达并定位于胞质溶胶。 例如，DNA序列编码的shRNA由细胞机器转位至胞质溶胶，在胞质溶胶中shRNA可被加工 成siRNA。当抑制剂分子在生产细胞中被表达并存在于胞质溶胶区室内时，抑制剂分子也 将存在于产自这些细胞的纳米囊泡中，因为所述纳米囊泡具有与生产细胞相同的胞质溶胶 组成。因此，产自表达shRNA的细胞的纳米囊泡将包含，例如，shRNA和/或源自shRNA的 siRNA，通常是siRNA。
[0086] 可选择地，抑制剂分子，诸如寡核苷酸，可直接被负载到分离的纳米囊泡中。
[0087] 在本发明的实施方案中，抑制剂分子是用于抑制或阻抑人MYC基因或基因产物的 RNAi分子，通常是shRNA或siRNA。
[0088] 为表达针对人c-Myc的RNAi分子诸如shRNA，可将包含选自以下的序列的DNA序 列引入生产细胞：SEQIDN0:1、SEQIDN0:2、SEQIDN0:3、SEQIDN0:4、SEQIDN0:5、SEQ IDNO: 6、SEQIDNO: 7、SEQIDNO: 8及SEQIDNO: 9;可选择地，可引入选自由以下组成的 组的DNA序列：SEQIDN0:185、SEQIDN0:186、SEQIDN0:187、SEQIDN0:188、SEQID NO:189、SEQIDNO:190、SEQIDNO:191、SEQIDNO:192、SEQIDNO:193、SEQIDNO:194、 SEQIDNO:195 及SEQIDNO:196。
[0089] 为表达针对人L-Myc的RNAi分子诸如shRNA，可将包含选自以下的序列的DNA 序列引入生产细胞：SEQIDNO: 10、SEQIDNO: 11、SEQIDNO: 12、SEQIDNO: 13、SEQID NO: 14、SEQIDNO: 15、SEQIDNO: 16、SEQIDNO: 17、SEQIDNO: 18 及SEQIDNO: 19。可 选择地，可引入选自由以下组成的组的DNA序列：SEQIDNO: 197、SEQIDNO: 198、SEQID NO:199、SEQIDNO:200、SEQIDNO:201、SEQIDNO:202、SEQIDNO:203、SEQIDNO:204 及SEQIDNO:205。
[0090] 为表达针对人N-Myc的RNAi分子诸如shRNA或siRNA，可将包含选自以下的序列 的DNA序列引入生产细胞：SEQIDN0:20、SEQIDN0:21、SEQIDN0:22、SEQIDN0:23、SEQ IDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29、SEQ IDN0:30、SEQIDN0:31及SEQIDN0:32。可选择地，可引入选自由以下组成的组的DNA序列：SEQIDN0:206、SEQIDN0:207、SEQIDN0:208、SEQIDN0:209、SEQIDN0:210、 SEQIDN0:211、SEQIDN0:212、SEQIDN0:213、SEQIDN0:214、SEQIDN0:215、SEQID NO:216、SEQIDNO:217 及SEQIDNO:218。
[0091] 包含SEQIDNO: 185-218的DNA序列的慢病毒质粒是从SigmaAldrich(USA)商 购的。
[0092] 在本发明的实施方案中，抑制剂分子是用于抑制或阻抑人E2F基因或基因产物的 RNAi分子，通常是shRNA或siRNA。为表达针对人E2H的RNAi分子诸如shRNA，可将包含 选自3￡〇10勵:33-48的序列的0嫩序列引入生产细胞。为表达针对人￡2€2的1?熟1分子 诸如shRNA，可将包含选自SEQIDN0:49-56的序列的DNA序列引入生产细胞。为表达诸如 针对人E2f3的RNAi分子shRNA，可将包含选自SEQIDN0:57-67的序列的DNA序列引入生 产细胞。
[0093] 在本发明的实施方案中，抑制剂分子是用于抑制或阻抑人RAS基因或基因产物的 RNAi分子，通常是shRNA或siRNA。为表达针对人Hras的RNAi分子诸如shRNA，可将包含 选自SEQIDN0:68-79的序列的DNA序列引入生产细胞。为表达针对人Kras的RNAi分子 诸如shRNA，可将包含选自SEQIDN0:80-85的序列的DNA序列引入生产细胞。为表达针对 人Nras的RNAi分子诸如shRNA，可将包含选自SEQIDN0:86-92的序列的DNA序列引入生 产细胞。
[0094] 编码抑制剂分子的DNA序列通常在启动子的控制下。启动子可以是组成型启动子 或诱导型启动子。
[0095] 在本发明的实施方案中，例如，当生产细胞是其自身增殖依赖有功能的人c-Myc 蛋白的人细胞时，使用诱导型启动子可能是优选的，以使得抑制剂分子的表达可在合适的 时间点被启动，例如当已获得期望数量的生产细胞或期望的生产细胞的密度时。可使用任 何合适的常规启动子，例如多西环素诱导型启动子。
[0096] 在其他实施方案中，生产细胞可不依赖抑制剂分子想要抑制或阻抑的靶基因的功 能。在这样的实施方案中，启动