子可以是组成型启动子或诱导型启动子。如本文所用的"靶 基因"是指待被抑制剂分子抑制或阻抑的基因，或同时基因产物待被抑制剂分子抑制或阻 抑的基因。
[0097] 例如，非人动物细胞或细菌可用作生产细胞以产生包含针对人基因或基因产物的 抑制剂分子的纳米囊泡。例如，小鼠细胞可用于产生针对人基因，例如人MYC基因家族的成 员，诸如人c-Myc的RNAi分子（及包含该RNAi分子的纳米囊泡），至少其中鼠和人基因不 具有过高的序列相似性。可选择地，可使用具有同类物质作为靶基因的生产细胞（producer cellsofthesamespeciesasthetargetgenemaybeused)，所述生产细胞已被修饰 为不依赖该靶基因。举例来讲，待用于产生针对MYC家族的第一成员的RNAi分子的人细胞 可被修饰以过表达MYC基因家族的另一个成员，使得其变得不依赖第一MYC成员的功能。特 别地，可使用标准技术遗传修饰人细胞以过表达在正常情况下仅以低水平表达的N-myc，其 在功能上可代替c-Myc并使得细胞不依赖c-Myc。因此，针对人c-MYC的RNAi分子在相同 的生产细胞内的表达不会破坏细胞生长和增殖。可选择地，人细胞的天然c-Myc可被遗传 修饰，例如通过引入一个或更多个点突变以避免与针对人c-Myc的RNAi分子互补，并因此 避免抑制生产细胞的c-MyC〇
[0098] 在本发明的实施方案中，纳米囊泡可从如上所述的细胞中产生，而无需插入编 码抑制剂分子的DNA序列。在这样的实施方案中，可使用电穿孔或类似的技术将抑制 剂分子直接引入（"载入"）分离的纳米囊泡。例如，可通过电穿孔直接将RNAi分子诸 如siRNA插入分离的纳米囊泡。在先的研究表明，这种方法可有效地用于递送至外来 体（Alvarez-Erviti,L.，等人，DeliveryofsiRNAtothemousebrainbysystemic injectionoftargetedexosomes.NatBiotechnol, 2011. 29(4):第 341-5 页）。
[0099] 本发明中用作生产细胞的细胞可以是能够形成纳米囊泡并容易表达抑制剂分子 的任何真核细胞。通常，细胞可以是动物细胞，特别是哺乳动物细胞，包括鼠和人的细胞。此 外，用作生产细胞的细胞可源自适合于体外增殖、修饰并表达抑制剂分子并产生纳米囊泡 的细胞系。细胞可以是干细胞。合适的细胞的实例包括人胚胎肾01EK，例如HEK293)细 胞、间充质干细胞、成纤维细胞（例如NIH3T3小鼠成纤维细胞）或任何其他合适的真核细 胞。或者，间充质干细胞可从其他细胞，诸如胚胎细胞产生，或通过自体同源性手段（因此 来自想要该治疗的患者）产生。
[0100] 为了实现将纳米囊泡选择性递送至癌细胞，纳米囊泡可具有靶向分子存在于其膜 的外表面上。优选地，靶向分子可以是例如配体的分子，所述分子选择性结合癌细胞表面特 异性的或癌细胞的表面上过度呈现（过表达）的另一分子，例如配体受体。合适的靶向分子 的实例包括表皮生长因子（EGF)，其结合EGF受体（EGFR)，及促黑激素（MSH)，其结合MSH受 体（MSHR;还称作黑皮质素1受体，MC1R)。EGFR在大多数上皮癌细胞类型上过表达，而MC1R 在黑色素瘤和黑色素细胞谱系的细胞上表达。最近，已表明，过表达使用血小板来源的生长 因子的跨膜结构域的EGF样肽的外来体，可靶向小鼠体内表达EGFR的肿瘤（Ohno,S.I.，等 人，SystemicallyInjectedExosomesTargetedtoEGFRDeliverAntitumorMicroRNA toBreastCancerCells.MolTher, 2012)。革E向分子可还包括具有结合癌症特异性表面 抗原的能力的天然配体或甚至工程化的抗体片段。
[0101] 为了将靶向分子引入纳米囊泡，包含DNA序列，诸如编码靶向分子的基因的DNA序 列可使用包括实现靶向分子在细胞内的表达所需要的任何序列诸如启动子等的常规克隆 技术引入。靶向分子可以是天然定位于细胞膜外表面的分子。可选择地，靶向分子可以是 具有跨膜蛋白诸如GPI-锚定蛋白或ICAM-1的跨膜/胞质结构域（T/CICAM-1)的融合蛋 白。
[0102] 当靶向分子位于细胞膜时，在如上所述地分离纳米囊泡后，靶向分子还将形成纳 米囊泡膜的一部分。为了使靶向分子表达在细胞膜表面上而对生产细胞的遗传修饰可在将 编码抑制剂分子的DNA序列引入生产细胞的步骤之前进行。可选择地，在本发明的实施方 案中，编码靶向分子的DNA序列和编码抑制剂分子的DNA序列可被同时引入生产细胞。将 靶向分子引入至生产细胞的表面并因此也在其天然形成的细胞外囊泡或由通过膜连续挤 压产生的纳米囊泡的表面上，还可在生产细胞不表达抑制剂分子的实施方案中进行，且纳 米囊泡被分离并随后用于例如通过电穿孔直接引入抑制剂分子。
[0103] 本发明提供了开发针对包括癌症的多种疾病的成功治疗的手段。可向患者施用根 据本发明的实施方案的纳米囊泡，所述患者患有至少部分地由抑制剂分子所针对的致癌基 因或原癌基因引起的癌症。任选地作为药物组合物的一部分的纳米囊泡可经由静脉内注射 施用或直接施用至肿瘤，或施用至包含肿瘤的器官或身体的受肿瘤折磨的部分。
[0104] 药物组合物可包含纳米囊泡，并且通常还包含药学上可接受的载体。适于注射的 药物组合物的实例包括无菌水溶液或分散体和用于临时制备无菌的可注射溶液或分散体 的无菌粉末。通常，组合物是无菌的。此外，在存在注射容易性的程度上，组合物可以是液 体。优选地，组合物在制造和储存条件下是稳定的，并且所述组合物的保存优选地防止微生 物，诸如细菌和真菌的污染作用。
[0105] 根据本发明的实施方案的药物组合物的施用可通过任何合适的途径例如静脉内、 皮内、肌肉内、进入脑、进入脊髓液、皮下、直接进入肿瘤或肿瘤侵染的组织，或四肢、或眼 内、或鼻内、或通过吸入、或口服和/或腹膜内途径实现。
[0106] 纳米囊泡可被癌细胞以与其内化外来体和其他囊泡相似的方式被内化，并此后将 其负载的抑制剂分子递送至癌细胞内部，在癌细胞内部抑制剂分子可例如通过RNAi执行 它的抑制剂功能。
[0107] 另外或可选择地，根据本发明的实施方案的生产细胞可直接施用至患者，例如直 接施用至肿瘤，而无需在先分离纳米囊泡。在这些个例中，细胞优选地在细胞表面上表达靶 向分子，以使其在施用后紧邻癌细胞定位。施用可通过任何合适的途径，例如静脉内、皮内、 肌肉内、进入脑、进入脊髓液、皮下、直接进入肿瘤或肿瘤侵染的组织，或四肢、或眼内、或鼻 内，或通过吸入、或口服和/或腹膜内途径实现。此外，在这些个例中，编码分子抑制剂的 DNA序列优选地在诱导型启动子，诸如由多西环素诱导的启动子的控制下。在对细胞施用 后，抑制剂分子的表达可通过以任何合适的途径，例如口服或静脉注射向患者施用多西环 素来诱导。RNAi分子表达后，细胞被施压，并因此在短的时间段内释放高量的外来体和其他 囊泡，这将在肿瘤细胞附近产生包含高浓度RNAi的囊泡，然后所述肿瘤细胞将通过天然途 径摄取这些囊泡，且RNAi分子将通过抑制关键的原癌基因诸如c-Myc或其他转录因子而具 有其在肿瘤细胞内部的治疗效应。抑制剂分子在被注射的细胞中的高水平和/或长时间的 表达将很可能诱导细胞凋亡，这可进一步导致细胞通过凋亡小体释放分子抑制剂，凋亡小 体还可将其负载物递送至肿瘤细胞接受者。结果是，RNAi分子将被包封在紧邻肿瘤细胞的 天然形成的纳米囊泡和微米囊泡中，并随后将进入癌细胞并引发RNAi。RNAi分子被包封进 囊泡中是重要的，因为如果RNAi分子在间质组织中（细胞外）作为游离分子存在，其将被 天然降解。
[0108] 本发明提供了可在许多癌性疾病的治疗中使用的治疗工具。c-Myc基因 可能在所有癌症的多达80%中过表达（附188〇11&€16￥61&11(1011(3〇86116.200306〇8; 22(56):9007-21)〇
[0109] 可使用根据本发明的实施方案的细胞或纳米囊泡治疗的癌症的一个实例是黑色 素瘤。先前已表明，c-Myc抑制可有效地在大多数恶性人黑色素瘤细胞系中引起衰老（Wang 等人，2008)。此外，通过在Ras诱导的肺腺癌（lungadenocarcinoma)的小鼠模型中全身表 达主导性的干扰性Myc突变体而抑制Myc，引起初期且确诊的肺肿瘤的快速衰退，证实了革巴 向Myc可有效治疗恶性肿瘤（Soucek，L.，等人，ModellingMycinhibitionasacancer therapy.Nature, 2008. 455 (7213) : 679-83页）。总之，这些在先的研究表明，许多恶性肿瘤 包括黑色素瘤依赖c-Myc〇
[0110] 因此，不管致癌基因的突变状态如何，a)靶向恶性黑色素瘤细胞，并且b)包含下 调黑色素瘤细胞的下游致癌基因或关键转录因子的RNAi分子的根据本发明的实施方案的 纳米囊泡，可能能够用于转移性葡萄膜黑色素瘤以及转移性皮肤黑色素瘤。c-Myc和E2fl 基因被认为是非常适合用于这种治疗的靶基因，因为总体上它们已被证明在黑色素瘤中是 至关重要的。最后，靶向黑色素瘤的细胞或纳米囊泡可能还能够用作眼睛的未转移的葡萄 膜黑色素瘤的局部治疗，或在局部除去肿瘤的同时作为可能避免摘除术的辅助治疗。
[0111] c-Myc还已与子宫颈、结肠、乳腺、肺和胃的癌相关，且因此本发明在这些恶性肿瘤 的治疗中可能也是有用的。
[0112] 因此，除了黑色素瘤以外，靶向例如EGFR阳性恶性肿瘤并包含c-Myc的抑制剂的 细胞和/或纳米囊泡，可以是用于许多恶性疾病的推定的治疗方法。 实施例
[0113]实施例1:将靶向分子引入到人牛产细朐的表而h
[0114] 首先，构建了符合GPI锚定蛋白或I-CAM1的读框地表达EGF或MSH的pCMV-zeo 载体并将其转染到ffiK293细胞或间充质干细胞中。用zeocin处理转染的细胞并基于EGF 或MSH的表面表达使用磁珠或细胞分选仪来分选抗性细胞。转基因表达的保持可常规地用 流式细胞仪进行监测。
[0115] 表达EGF或MSH融合蛋白的细胞可进一步用于产生任选地表达抑制剂分子的纳米 囊泡。
[0116]实施例2:伸用被修饰为不依赖c-mvc的人细朐产牛纳米囊泡
[0117] A.将人细胞修饰为变得不依赖c-Myc
[0118] 将包含由IRES(以促进独立于帽的翻译）间隔的鼠逆转录病毒受体（mCAT-1)和 N-Myc:GFP融合体的哺乳动物表达载体转染到HEK293T细胞或间充质干细胞中。所使用的 细胞系可配备有针对鼠特异性包膜-假型慢病毒（envelope-pseudotypedlentivirus)的 亲嗜性受体（