ecotropicreceptor)以提高工作人员的安全性。另外，通过使用pO)NA-neo 载体克隆，表达新霉素抗性盒也是可能的。可选择地，如果抑制剂是针对c-Myc的，表达载 体可包含L-myc基因代替N-Myc基因。
[0119] 使用Amaxa核转染或任何其他合适的方法学将载体克隆到人细胞中。用新霉素和 用于GFP阳性细胞的FACS分选术选择成功转导的细胞。
[0120]B.将编码人Myc蛋白的抑制剂的DNA序列引入产生纳米囊泡的细胞中
[0121] 将从SigmaAldrich,USA(MISSIONTRCpLKO-puroclones)获得的具有选自由SEQ IDNO: 185-196组成的组的序列的慢病毒质粒转染到HEK293T细胞中。当被转染进细胞时， 产生基于HIV-1的转录产物，所述基于HIV-1的转录产物已因3' -长末端重复中的缺失变 得无复制能力和自灭活。此外，将慢病毒载体与pCMV-dR8. 2dvpr和pHCMV-Eco(两者均来 自Addgeneplasmiddepository)共转染，前者包含表达HIV-GAG的最小载体且后者包含 亲嗜性包膜。因此，HEK293T细胞将产生不能复制的且仅可感染鼠细胞或如实施例2A中 的表达鼠逆转录病毒受体（mCATl)的细胞的慢病毒。接下来，培养HEK293T细胞，并使用 来自转染的细胞的包含病毒的细胞培养物上清转导表达mCATl的人细胞，随后用嘌呤霉素 (由慢病毒质粒编码）选择。由于表达mCATl的人细胞依赖N-Myc基因，而不依赖于人靶基 因例如c-Myc，其生长或存活力可不受针对人靶基因例如人c-Myc的抑制剂分子的表达的 影响。
[0122] C.纳米囊泡的分离
[0123] 纳米囊泡，和/或天然存在的细胞外囊泡的分离可通过已知的包括离心步骤的方 法来进行。例如，人工纳米囊泡可按照US2012/0177574中描述的产生。从核膜中形成的 人工高密度囊泡可通过简短的离心步骤取出。表达靶向例如EGF受体的分子的纳米囊泡可 通过阳性选择或阴性选择，使用先进的FACS分选方案、磁吸方法或使用抗体技术的任何其 他方法来纯化。
[0124]实施例3 :伸用人细朐产牛的纳米囊泡（诱导表汰）
[0125]A?将编码针对Myc蛋白（诱导表达）的抑制剂的DNA序列引入人细胞
[0126] 使用四环素（多西环素）或IPTG诱导表达系统克隆期望的抑制剂分子的DNA序列 (此处为根据SEQIDN0:185-218中的任一个的DNA序列）。例如，可使用pLKO-TetON-puro 系统（Addgene)或pLK0_IPTG_3xLac0 系统（Sigma)。
[0127] B?纳米囊泡的分离（任选的）
[0128] 纳米囊泡和/或天然形成的细胞外囊泡的分离可通过包括离心步骤的已知方法 进行。例如，人工纳米囊泡可按照US2012/0177574中描述的产生。从核膜中形成的人工 高密度囊泡，可通过简短的离心步骤取出。表达靶向例如EGF受体的分子的纳米囊泡可通 过阳性选择或阴性选择，使用或先进的FACS分选方案、磁吸方法或使用抗体技术的任何其 他方法纯化。
[0129] 可选择地，无需分离纳米囊泡，抑制剂分子可从细胞培养物中回收并稍后例如使 用电穿孔被直接引入纳米囊泡。在这样的实施方案中，可按照以上描述的将抑制剂分子引 入人工产生的纳米囊泡。
[0130] 可选择地，无需使用通过连续挤压产生人工纳米囊泡，可从细胞培养物中分离工 程化生产细胞天然释放的细胞外囊泡，例如外来体，微米囊泡或凋亡小体。这种天然的细胞 外囊泡将在其表面上表达祀向分子，也包含抑制剂分子。
[0131]实施例4 :伸用鼠细朐产牛纳米囊泡
[0132] A.将编码Myc抑制剂的DNA序列引入进鼠细胞
[0133]将从SigmaAldrich,USA(MISSIONTRCpLKO-puroclones)获得的具有选自由SEQ IDNO: 185-218组成的组的序列的慢病毒质粒转染到HEK293T细胞中。当转染进细胞时， 产生已因3'-长末端重复中的缺失变得不能复制的基于HIV-1的转录产物。此外，将慢病 毒载体与pCMV_dR8.2dvpr和pHCMV-Eco(两者均来自Addgeneplasmiddepository)共转 染，前者包含表达HIV-GAG的最小载体且后者包含亲嗜性包膜。因此，HEK293T细胞将产生 无复制能力的慢病毒，并可仅感染鼠细胞。接下来，培养ffiK293T细胞，并使用来自转染的 细胞的包含病毒的细胞培养物上清用于转导NIH3T3小鼠成纤维细胞，随后用嘌呤霉素（由 慢病毒质粒编码）选择。由于小鼠成纤维细胞依赖其天然的小鼠基因，而不依赖人靶基因， 例如c-Myc，因此其生长或存活力可不受针对人靶基因，例如人c-Myc的抑制剂分子的表达 的影响。
[0134] B.纳米囊泡的分离
[0135] 纳米囊泡和/或天然存在的细胞外囊泡的分离可通过包括离心步骤的已知方法 来进行。例如，人工纳米囊泡可按照US2012/0177574中描述的产生。从核膜中形成的人 工的高密度囊泡，可通过简短的离心步骤取出。表达靶向例如EGF受体的分子的纳米囊泡 可通过阳性选择或阴性选择，使用先进的FACS分选方案、磁吸方法或使用抗体技术的任何 其他方法纯化。
【主权项】
1. 一种产生纳米囊泡的方法，所述纳米囊泡包含针对致癌基因或原癌基因或其基因产 物的抑制剂寡核苷酸，所述方法包括 a) 将编码能够抑制人致癌基因性或原癌基因性转录因子的寡核苷酸的DNA序列引入 哺乳动物细胞； b) 在允许所述细胞表达所述抑制剂寡核苷酸的条件下维持所述细胞；以及 c) 从所述细胞获得包含所述抑制剂寡核苷酸的纳米囊泡。2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述抑制剂寡核苷酸是人MYC基因或基因产物的 抑制剂，优选c-Myc基因或基因产物的抑制剂。3. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸是RNA，优选RNAi分子。4. 根据权利要求3所述的方法，其中所述编码能够抑制人致癌基因性或原癌基因性转 录因子的寡核苷酸的DNA序列是选自由SEQ ID NO: 1-10和SEQ ID NO: 185-196组成的组 的DNA序列。5. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞在细胞表面上表达靶向分 子。6. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法包括，在步骤a)之前或与步 骤a)同时，引入编码待在细胞表面上表达的靶向分子的DNA序列。7. 根据权利要求5或6所述的方法，其中所述靶向分子是特异性结合癌细胞上过表达 的表面蛋白的配体。8. 根据权利要求7所述的方法，其中所述靶向分子是表皮生长因子（EGF)、促黑激素 (MSH)或针对癌细胞上过表达的表面蛋白的抗体的可变区或所述抗体的fab-片段。9. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞是人细胞。10. 根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中所述细胞用包含N-Myc基因或 L-Myc基因的构建体转染或转导，并过表达N-Myc或L-Myc。11. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤a)包括引入遗传构建体，所述 遗传构建体包含可操作地连接至诱导型启动子的编码能够抑制人c-Myc的寡核苷酸的所 述DNA序列，且步骤b)包括通过激活所述诱导型启动子诱导表达。12. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法体外或离体进行。13. -种分离的纳米囊泡，所述分离的纳米囊泡根据前述权利要求中任一项所述的方 法来产生。14. 一种分离的纳米囊泡，所述分离的纳米囊泡包含针对人致癌基因性或原癌基因性 转录因子的抑制剂寡核苷酸。15. 根据权利要求13或14所述的分离的纳米囊泡，其中所述致癌基因性或原癌基因性 转录因子是MYC基因及基因产物家族的成员，且更优选人c-Myc或编码人c-Myc的基因。16. 根据权利要求13或14所述的分离的纳米囊泡，其中所述致癌基因或原癌基因是 E2F基因或基因产物家族的成员，且更优选人E2fl、E2f2或E2f3或编码人E2fl、E2f2或 E2f3的人基因。17. 根据权利要求13至16中任一项所述的分离的纳米囊泡，其中所述寡核苷酸是 RNA，优选RNAi分子。18. 根据权利要求17所述的分离的纳米囊泡，其中所述RNA是包含选自由SEQ ID N0:93-102组成的组的序列的shRNA或siRNA。19. 根据权利要求14所述的分离的纳米囊泡，所述分离的纳米囊泡是由通过微米过滤 器和/或纳米过滤器连续挤压细胞产生的人工纳米囊泡。20. -种转染或转导有遗传构建体的人细胞，所述遗传构建体包含其基因产物在功能 上代替所述人细胞天然表达的人致癌基因性或原癌基因性转录因子的基因，其中所述细胞 还包含编码能够抑制所述人致癌基因性或原癌基因性转录因子的寡核苷酸的DNA序列。21. 根据权利要求20所述的人细胞，其中所述人致癌基因性或原癌基因性转录因子由 MYC基因家族的一个成员编码，且所述遗传构建体包含所述MYC基因家族的另一个成员。22. -种转导或转染有DNA序列的人细胞，所述DNA序列编码针对人致癌基因或原癌基 因的抑制剂寡核苷酸，优选针对人致癌基因性或原癌基因性转录因子的抑制剂寡核苷酸， 其中所述DNA序列可操作地连接至诱导型启动子。23. 根据权利要求20或22所述的人细胞，其中所述DNA序列选自由SEQ ID NO: 1-10 和 SEQ ID NO: 185-196 组成的组。24. 根据权利要求20至23中任一项所述的人细胞，所述人细胞是干细胞，优选胚胎干 细胞或间充质干细胞。25. -种组合物，所述组合物包含根据权利要求13至19中任一项所述的纳米囊泡和药 学上可接受的载体。
【专利摘要】产生包含针对致癌基因或原癌基因或其基因产物的寡核苷酸抑制剂的纳米囊泡的方法，所述方法包括a)将编码能够抑制人致癌基因性或原癌基因性转录因子(oncogenic？or？proto-oncogenic？transcription？factor)的寡核苷酸的DNA序列引入哺乳动物细胞；b)允许细胞表达所述抑制剂寡核苷酸；以及c)从所述细胞获得包含所述抑制剂寡核苷酸的纳米囊泡。由要求保护的方法产生的纳米囊泡可有效并特异地靶向例如癌细胞以递送抑制剂寡核苷酸。
【IPC分类】C12N15/11, C12N15/113
【公开号】CN105051192
【申请号】CN201380069683
【发明人】扬·洛特瓦尔, 乔纳斯·安德烈·尼尔松
【申请人】扬·洛特温尔, 乔纳斯·安德烈·尼尔松
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2013年11月13日
【公告号】EP2920306A1, WO2014076137A1