-22siRNA罗丹明（目录号 1022176) (Qiagen))复合的纳米颗粒的初级转染测试。
[0513] 使用终浓度为100nM的siRNA进行转染。
[0514] 因此，将表达GFP的细胞接种在12孔板（25, 000个细胞/孔）中，然后使用上面 获得的siRNA/制剂（B1、B6、在其制备之后7个月的B6,或B10)复合物进行处理。然后，细 胞在37°C孵育72小时，然后被回收以使用流式细胞仪分析荧光强度，以确定制剂作为转染 试剂的效率。特异性抑制GFP蛋白表达的siRNA的主动递送诱导了GFP蛋白带来的荧光的 降低。
[0515] 商业转染试剂LipofectamineRNAimax用作对比。
[0516] 图7例示了通过使用以下物质转染细胞系，以％表示的荧光强度FITC的降低：
[0517]LipofectamineRNAimax，
[0518]siRNA/制剂B1复合物，
[0519]siRNA/制剂B6复合物，制剂在复合之前已经在室温保持了 7个月，
[0520]siRNA/制剂B6复合物，制剂在复合之前已经在室温保持了 12个月，
[0521]siRNA/制剂B10 复合物，
[0522]siRNA/ 包括D0TAP(58 %wt)、D0PE(18 %wt)、胆固醇（2 %wt)和 DSPE-PEG3000(22%wt)的阳离子脂质体的制剂的复合物（对比）。
[0523] 因此，对于所测试的根据本发明的制剂观察到荧光降低33%至50%。因此，根据 本发明的制剂允许诱导GFP基因表达的相对消光的siRNA的主动递送。
[0524] 进一步地，通过将DOPE并入到制剂中，可见荧光更实质性的消光，DOPE促进内涵 体逃逸。
[0525] 使用siRNA/阳离子脂质体复合物的制剂，没有观察到荧光降低，这可能例如解释 为脂质体在培养基中的弱稳定性、弱复合产量和/或复合之后脂质体的siRNA的弱滞留。
[0526] 最后，通过根据本发明的制剂介导的siRNA的主动递送的这些结果在表达GFP的 3种细胞系U20S、PC3和Hela上进行了重复，如图8中所示。
[0527]1.4.与唯一DNA标答的复合
[0528] 复合由上面制备的制剂和siRNA溶液（整体在缓冲液中）的简单混合而成。缓 冲液的选择依赖于所预期的应用：对于体外研究，使用用于转染步骤的优化的培养基 OptiMEM。对于复合研究，使用5mM的H印es缓冲液。混合物在室温（大约25°C)下以600rpm 搅拌至少30分钟。
[0529] 1.5.荧光闭的封装
[0530] 荧光团的封装根据在申请W02008104717中限定的方法来实现。更具体地，荧光颗 粒通过对在水相中的油相进行超声来获得。油相包括豆油和#upp_ire?_NC，以及卵磷脂 和荧光团（为了溶解）的混合物。对此，水相包括聚乙二醇化表面活性剂、水溶液（NaCl或 PBS)和可选的甘油，以增加混合物的粘度。以2或5mL批生产荧光纳米颗粒。简单来讲， 油相通过混合豆油、SuppocircKNC和卵磷脂（分散相+卵磷脂）来制备。添加有机溶剂 (二氯甲烷），以促使卵磷脂的溶解。一旦所有化合物都溶解了，则在高于蜡沸点的温度下， 在真空中蒸发溶剂。然后，将荧光分子添加到油相中。为了促使它们的分散，荧光团预先被 溶解在有机溶剂（乙醇）中。溶液是均质的，并且通过在真空中蒸发去除有机溶剂。水相 通过热混合甘油、聚乙二醇化表面活性剂和水相来制备。将预先被维持在大约50°C的两相 混合，然后使用超声进行均质化，以形成在它们核中俘获亲脂性荧光团的纳米颗粒。然后， 通过透析纯化获得的荧光纳米颗粒的溶液，以去除可能还没有被封装的分子。
[0531]1.6.纳米颗粒的库的制备
[0532] 通过使用来自Qiagen的革巴向646种激酶的1292种siRNA的集合（HumanKinase siRNAsetVI. 0;Ref. 1027091)，或来自Qiagen的靶向参与癌症的1183种基因的2375 种siRNA的集合（HumanCancersiRNAsetV2.0)，或革巴向参与癌症的139种基因的278 种siRNA的集合（HumanCancersiRNAsetVI. 0 ;Ref. 1022171)，或来自Qiagen的革巴向 22, 950 种人类基因的 91，800 种siRNA的集合（HumanGenomeWidesiRNAset)，或通过 使用来自Exiqon的靶向所有已知人类miRNA的982种LNA的集合（miRCURYLNAHuman microRNAInhibitorLibrary;Ref. 190102-2)的siRNA，进行 1000 种焚光纳米颗粒的制 备。
[0533] 唯一DNA标签在10bp合成碱基的单一序列两侧，在5'和3'含有允许扩增标签的 两条50bp的序列。集合中的每一个siRNA或每一个LNA都在硅片中与10bp的单一序列相 关联。
[0534]实施例2 :前列腺细朐的2D和3D培养
[0535] 使用以下的前列腺细胞：
[0536]PTN1和RWPE1细胞，是前列腺的永生化的正常上皮细胞，
[0537]细胞WPE1-NA22、WPE1-NB14、WPE1-NB11 和WPE1-NB26,源于RWPE1 细胞
[0538] 并且模拟在暴露于N-甲基-N-亚硝基脲之后的不同肿瘤发生阶段，
[0539] 细胞系22Rvl，对雄激素缺失应答的人类前列腺癌性上皮细胞系，
[0540] 细胞系VcaP和LNCaP，是体外和体内对雄激素敏感的转移性前列腺癌细胞系，
[0541] 细胞系PC3和DU145,是不再对雄激素缺失应答的转移性前列腺癌细胞系，
[0542] 来自健康受试者的前列腺原代细胞。
[0543] 还实现了来自这些前列腺细胞的腺泡形式的3D结构的产生。
[0544] 对这些前列腺细胞培养物的每一种，评价包括荧光团、siRNA和唯一DNA标签的纳 米颗粒的转染效率和毒性。
[0545]实施例3:通过流式细胞术讲行的高通量表型分析
[0546] 根据两种不同的表型筛选细胞：细胞增殖、细胞死亡。通过使用碘化丙啶、EdU 或赫斯特33342进行标记，来评价增殖。通过膜联蛋白（Annexine)V-FITC标记或所谓的 TUNEL( "末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记"）标记或通过半胱天冬酶活化 分析，来评价细胞死亡。对于这些表型的每一种，评价标记和选择细胞的最佳条件，以选择 适当的阳性和阴性对照。
[0547] -旦确定了根据它们的表型标记和选择细胞的条件，则对前列腺原代细胞或大约 10种对激素处理具有不同类型的应答的前列腺细胞系进行初始筛选。
[0548]实施例4:唯一DNA标答的解卷积，数据分析和验证
[0549] 在流式细胞术之后选择的小分量的细胞用于鉴定唯一DNA标签。从荧光细胞中 提取DNA，使用通用引物进行PCR，并且使用第二代测序仪（Illumina或Roche454或ABI solid)进行测序。然后，找到唯一DNA标签的10bp序列的鉴定与已经在硅片上与其相关联 的siRNA或LNA对应关系。然后，建立其受到siRNA或LNA抑制而诱导感兴趣的表型的基 因列表。筛选方法还允许根据对激素治疗的敏感性对所测试的每一种细胞系建立若干套功 能基因组数据，和对激素敏感性的潜在标记物的蛋白或miRNA的若干编码基因列表。
[0550] 对剩余细胞的表型发生和基因抑制的体外验证通过定量实时PCR或通过蛋白印 记（Western-blot)来实现。
[0551]实施例5:体内骑证和临床骑证
[0552] 实现两个阶段中的验证策略：
[0553] 对于体内验证，将经根据本发明的纳米颗粒（例如包含siRNA或LNA)转染的对照 人类前列腺癌细胞和前列腺癌症细胞植入到"裸"无胸腺细胞中。监控肿瘤的体积，并且在 安乐死之后切除肿瘤并且固定，用于对转化有根据本发明的纳米颗粒的细胞中的增殖或凋 亡进行免疫组织学分析。
[0554] 对于临床验证，使用含有不同级别的几百种前列腺癌组织的前列腺组织的商业微 芯片。
[0555] 这允许验证前列腺癌症的生物标记物，新的治疗靶点和作为新的治疗试剂的 siRNA〇
[0556]实施例6:通讨荧光纳米颗粒共涕送感兴趣的siRNA和DNA标答（条形码），枏据 感兴趣的表铟分诜已经并入了纳米颗粒的细朐，以及通讨从分诜细朐提取DNA并讲行特异 件扩增后验鉴宙DNA标答的条形码
[0557]6. 1.在不同的核酸、标答DNA和siRNA,与荧光纳米颗粒的制剂之间的复合
[0558] 在该实施例中，借助于荧光纳米颗粒的分散，使用感兴趣的siRNA和该siRNA的特 异性DNA标签进行靶细胞的共转染。
[0559] 凝胶延迟实验（图9):
[0560] 在本实施例中使用的脂质纳米颗粒制剂根据与在实施例1中描述的相同的制造 方法来获得，并且对应于制剂A3。普通的复合程序与遵循实施例1的复合程序相同。简单来 讲，复合由简单地混合制剂A3 (包括被封装在核中的亲脂性焚光团（DiD,Invitrogen,Ref. D7757))和siRNA和DNA标签溶液与纳米颗粒（整体在缓冲液中）而成。在本研究中，使用 的缓冲液是ffiPES(5mM，pH7. 2)。对于孔1，纳米颗粒A3与含有ling的siRNA(siAllStar NegativeControlsiRNA,Qiagen,Ref. 1027280)和 20ng的DNA标签（Eurogentec)的溶 液复合。对于接下来的孔（第2至7号孔），根据级联稀释技术，该siRNA/DNA标签溶液 在与纳米颗粒复合之前被稀释两倍。对于孔1至孔7,这里使用的N/P比率（N=组成脂 质颗粒的冠的阳离子脂质的氮的铵基团带来的正电荷；P=核酸的磷酸基团带来的负电 荷）分别是 12/1、24/1、48/1、96/1、192/1、384/1、768/1。混合物在室温（大约 25°C)下 以600rpm搅拌30分钟。琼脂糖凝胶（具有1.5%的Agaroseultrapure1000的琼脂糖， Invitrogen,Ref. 16550100 ;缓冲液TBE10X,Ref. 15581044 ;超纯水，Ref. 10977035)上的电 泳可以证明两种核酸实际上都被复合在荧光脂质微滴上，如图9所示。事实上，如果纳米颗 粒/siRNA/DNA标签复合物是稳定的，则所有核酸（siRNA和DNA标签）都被保留在孔（孔 1至孔7)中，并且不能在凝胶中迀移。相反地，游离的siRNA(没有与纳米颗粒复合）将可 见为朝21bp迀移的条带（孔8)。而且，游离的DNA标签（没有与纳米颗粒复合）将以可见 的朝129bp的条带迀移（孔9)。该实验示出了脂质纳米颗粒（制剂A3的Lipido丨类型） 同时且以稳定的方式复合siRNA和DNA标签的效率。
[0561]6. 2.两种核酸siRNA和DNA标答通讨荧光纳米颗粒的共转染
[0562] 使用制剂A3/DNA标签/siRNA复合物对过表达GFP的HeLa进行的体外转染实验：
[0563] 评价由含荧光团的脂质纳米颗粒（制剂A3)转运的不同分子在体外靶细胞中的同 时递送。
[0564] 为此，对HeLa细胞（即起源于宫颈癌（ATCC，Ref.HeLa_CCL2)的细胞）进行了研 究，该HeLa细胞经改变以过表达GFP蛋白。通过siGFP特异性筛选GFP蛋白的mRNA使GFP 蛋白消光（FITC信号降低），验证siRNA的主动递送。平行地，通过研究由封装的荧光团 DID(紧接着是APC信号）带来的荧光信号的时间依赖的变化，可以观察荧光纳米颗粒与细 胞的相互作用。该第一步骤示出，在使用纳米颗粒A3/DNA标签/siGFP复合物处理的细胞 中，FITC信号发生非常强的降低，GFP的表达因此也发生非常强的降低，并且指示荧光纳米 颗粒（携带荧光团DID)与细胞相互作用的APC信号增加（图10和图11)。
[0565] 这些结果示出，标签DNA的存在不扰乱siRNA在细胞中的递送，并且后者的功能被 保护了，即与编码GFP的mRNA相互作用并且通过RNA干扰机制抑制该蛋白的表达。在细胞 与靶向GFP的mRNA的荧光纳米颗粒A3/DNA标签/siRNA复合物孵育之后，对应于GFP表达 的FITC荧光的消光效率在这些实验中大约为70%，（图10)。
[0566] 在经A3/DNA标签/siRNA复合物转染之后，基于GFP的消光鉴定经分选的细胞中 的DNA标签：
[0567] 在该实验中，通过流式细胞术（Cytomation,MoFlo)分选强或弱表达GFP的细胞 群。在实践中，将200, 000个HeLa-GFP细胞接种在6孔板的孔中。在培养24小时之后， 使用荧光纳米颗粒A3/DNA标签/siAllStar复合物或荧光纳米颗粒A3/DNA标签/siGFP 复合物转染这些细胞。转染后72小时，通过添加胰蛋白酶从孔中分离细胞。加入被包含 在三个相同转染条件的孔中的细胞，并且根据它们的GFP的强或弱的表达水平被分选成两 种不同的群体（图12)。经由QiaAmpDNA小型试剂盒（Ref. 51304)提取由此回收的细胞 的DNA内容物，然后使用DNA标签的特异性引物进行PCR。用于该扩增的引物是pGEX3' 和 5' 引物（Eurogentec，Ref.UN-PR130-005 和UN-PR135-005)。使用 35 个扩增循环进行 PCR(Qiagen，HotStarTaqMasterMix,Ref. 203443)。然后，将由此扩增的核酸沉淀在预先 制备的2%琼脂糖凝胶的孔中。在图13中，我们可以观察到，转染有荧光纳米颗粒A3/DNA 标签/siGFP复合物的细胞的GFP的表达有非常大的降低，并且还携带了通过PCR检测的 DNA标签。该结果示出了制剂A3的荧光纳米颗粒在细胞内同时递送DNA标签和功能siRNA 的能力。
[0568] 这些结果证明了：
[0569] 根据本发明的纳米颗粒允许在靶细胞中同时递送两种核酸（siRNA和DNA标签）， 被siRNA转染的细胞由此是带荧光的。
[0570] 分选已经并入了荧光纳米颗粒和具有感兴趣的表型的细胞的可行性，
[0571] 在提取了细胞DNA并且扩增了标签DNA之后，通过分析与siRNA特异性相关联的 DNA标签的条形码后验证感兴趣的siRNA的可行性。
【主权项】
1. 一种筛选感兴趣的分子的方法，包括以下步骤： a) 在允许细胞整合至少一个纳米颗粒的条件下，使所述细胞与所述纳米颗粒的库接 触，每一个纳米颗粒都包括候选分子、示踪物和对所述候选分子具有特异性的唯一 DNA标 签， b) 选择已经整合了所述示踪物并且具有感兴趣的表型的细胞， c) 通过鉴定所述唯一 DNA标签的序列，鉴定作为感兴趣的分子的候选分子，该候选分 子已经被整合到步骤b)选择的细胞中。2. 根据权利要求1所述的筛选方法，其中，所述候选分子定位于每一个纳米颗粒的表 面。3. 根据权利要求1或2所述的筛选方法，其中，每一个纳米颗粒都是直径小于1微米的 颗粒。4. 根据权利要求1至3中任一项所述的筛选方法，其中，所述纳米颗粒进一步包括靶向 细胞和/或器官的生物配体。5. 根据权利要求1至4中任一项所述的筛选方法，其中，所述纳米颗粒是无机纳米颗 粒、有机纳米颗粒或杂合纳米颗粒。6. 根据权利要求5所述的筛选方法，其中，所述纳米颗粒是脂质载体。7. 根据权利要求6所述的筛选方法，其中，所述脂质载体是纳米乳剂形式的制剂微滴， 包括连续的水相和至少一种分散相，并且包括： a) 至少5摩尔％的两亲性脂质， b) 15摩尔％至70摩尔％的至少一种阳离子表面活性剂，包括： i) 至少一种选自以下基团的亲脂性基团： 基团R或R-(C = 0)-，其中，R代表含有11至23个碳原子的直链烃链， 含有12至24个碳原子的脂肪酸和磷脂酰乙醇胺的酯或酰胺，以及 聚（环氧丙烷），以及 ii) 至少一种选自以下基团的包括至少一种阳离子基团的亲水性基团： 含有1至12个碳原子的、并且经至少一个阳离子基团间断和/或取代的直链或支链烷 基，以及 包括至少一个阳离子基团的亲水性聚合基团，以及 c) 10摩尔％至55摩尔％的包括至少一种聚（环氧乙烷）链的助表面活性剂，该聚（环 氧乙烧）链包括至少25个乙撑氧单元， d) 增溶脂质， e) 可选地，膜融合脂质， 其中，两亲性脂质、阳离子表面活性剂和助表面活性剂的摩尔百分比是相对于（两亲 性脂质/阳离子表面活性剂/助表面活性剂/可选的膜融合脂质）的集合。8. 根据权利要求7所述的筛选方法，其中，在所述纳米乳剂中： 所述阳离子表面活性剂选自： N [ 1- (2, 3-二油酰氧基）丙基]-N，N，N-三甲胺， 1，2-二油酰基-3-三甲胺-丙烷， N-(2-羟乙基）-N，N-二甲基-2, 3-双（十四烷氧基-1-丙胺）， 1-[2-(油酰氧基）乙基]-2-油酰基-3-(2-羟乙基）咪唑啉，以及 双十八烷基酰胺基甘氨酰基精胺；和/或 所述膜融合脂质是1，2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺；和/或 所述两亲性脂质是磷脂。9. 根据权利要求7或8所述的筛选方法，其中，在所述纳米乳剂中，所述助表面活性剂 枝接有靶向细胞核/或器官的所述生物配体。10. 根据权利要求1至9中任一项所述的筛选方法，其中，所述候选分子是可以调节 RNA干扰机制的核苷酸序列。11. 根据权利要求10所述的筛选方法，其中，所述可以调节RNA干扰机制的核苷酸序列 为： ⑴小干扰RNA(siRNA)， (ii) 锁核酸（LNA)，或 (iii) 微小 RNA(miRNA)， (iv) 长双链 RNA (RNAds)。12. 根据权利要求1至11中任一项所述的筛选方法，其中，所述唯一 DNA标签由在一 条链上以5'~3'的顺序由以下序列组成的具有至少50个核苷酸或碱基对（bp)的DNA序 列，优选双链DNA序列组成： 所述库中所有唯一 DNA标签共有的至少20个核苷酸的第一序列， 对所述分子具有特异性的至少10个核苷酸的唯一序列， 所述库中所有唯一 DNA标签共有的至少20个核苷酸的第二序列。13. -种疾病和/或表型特征的生物标记物的筛选方法，包括以下步骤： a) 在允许细胞整合至少一个纳米颗粒的条件下，使所述细胞与所述纳米颗粒的库接 触，每一个纳米颗粒都如权利要求1至12中任一项中所述， b) 选择已经整合了所述示踪物并且具有感兴趣的表型的细胞， c) 通过鉴定所述唯一DNA标签的序列，鉴定已经被整合到在步骤b)选择的细胞中的候 选分子， d) 鉴定作为疾病和/或表型特征的生物标记物的，在步骤c)鉴定的所述分子的祀点。14. 根据权利要求13所述的筛选方法，其中，所述疾病是癌症或感染。15. 根据权利要求1至12中任一项所述的纳米颗粒在筛选感兴趣的分子，和/或疾病 和/或表型特征的生物标记物中的应用。16. -种根据权利要求1至12中任一项定义的纳米颗粒的库。17. -种根据权利要求1至12中任一项定义的纳米颗粒。18. 根据权利要求17所述的纳米颗粒，其中，所述唯一 DNA标签由具有至少50个核苷 酸或碱基对（bp)的DNA序列，优选双链DNA组成。
【专利摘要】本发明涉及一种通过纳米颗粒筛选感兴趣的分子的方法，所述纳米颗粒包括候选分子、示踪物和对所述候选分子具有特异性的唯一DNA标签。更具体地，本发明涉及一种使用所述纳米颗粒筛选疾病和/或表型特征(特别是癌症或感染)的生物标记物的方法。本发明还涉及纳米颗粒自身及所述纳米颗粒的库。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105051205
【申请号】CN201380068556
【发明人】法布里斯·纳瓦罗塔·Y·加西亚, 乔纳森·布吕尼奥, 泽维尔·吉道尔, 艾瑞克·叙尔皮斯
【申请人】原子能和替代能源委员会
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2013年12月2日
【公告号】EP2925882A1, US20150322494, WO2014083205A1