抗滤过道瘢痕化的药物高通量筛选体系及其构建方法
【专利摘要】本发明涉及抗滤过道瘢痕化的药物高通量筛选体系及其构建方法。本发明基于细胞、分子水平药物筛选模型建立的抗滤过道瘢痕化的药物高通量筛选体系，可弥补传统药物筛选体系的缺陷，已逐渐成为药物筛选的主要方法。另外，其独特的优势在于，可以了解药物复方成分中的几乎全部有效成分，对于质量控制具有很大的指导意义，易将研究成果转化为产品，实现新药的创制。
【专利说明】
抗滤过道癒痕化的药物高通量筛选体系及其构建方法
技术领域
[0001] 本发明设及基因工程领域，具体地说，设及一种抗滤过道癒痕化的药物高通量筛 选体系及其构建方法。
【背景技术】
[0002] 中药复方血清药理学和血清药物化学主要研究给药后动物血清的生物活性和血 清中的化学成分，W掲示中药的药效物质基础，其中血清药理学主要是用中药复方给动物 灌胃后，采血并分离血清作免疫学的血清学实验，并结合现代化学、微生物学、分子生物学、 药理、临床等学科开展体外实验;血清药物化学主要是发现并观测血清中外源性生物活性 物质W及运些物质的作用和代谢规律，方法主要为血药浓度测定、血清药物化学的色谱指 纹图。
[0003] 在药效学实验的指导下，利用现代的提取、分离技术，如溶剂萃取、柱层析、膜萃取 及超滤、超临界萃取等方法确定复方有效部位，建立有效部位与药效间的相互关系，探讨有 效部位的君、臣、佐、使情况，建立复方量效关系。对有效部位中主要药效物质基础或者主要 药效物质群的研究是中药复方化学研究的重点，也是探明中药复方配伍规律、药效作用机 制的基础。
[0004] 创新药物的发现需要合适的筛选体系，但目前中医药研究没有抗滤过道癒痕化的 药物筛选体系，即缺乏中药筛选的共性关键技术，导致青光眼患者难W得到最优化的术后 中医药治疗，并且现有中医药研究成果难W转化为经济效益。传统药物筛选体系越来越不 适用于巨大的中药成分库，表现在药物筛选规模小、效率低、对样品的需求量较大、成本高， 造成科研经费严重浪费。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种抗滤过道癒痕化的药物高通量筛选体系及其构建方法。
[0006] 为了实现本发明目的，本发明利用基因工程技术，构建WSmad3的顺式作用元件4 X CAGACA(C0L1A2)基序为增强子、SV40为启动子，WZsGreenlDR为报告基因、新霉素抗性 (Ne〇T)基因为筛选基因的报告质粒p4C0L 1 A2-ZsGreen 1DR。
[0007] 报告质粒p4C0LlA2-ZsGreenlDR的构建方法如下：
[000引 1)采用PCR方法扩增pGL2-control中的SV40启动子，并用其替换pEGFP-Nl中的 CMVie启动子，构建PSV40-EGFP质粒；
[0009] 2)将合成的4XCAGACA基序插入到pSV40-EGFP的趾oI、Bgl^两酶切位点之间，构 建 P4C0L1A2-EGFP 载体；
[0010] 3)酶切pZsGreenl-DR质粒（购自化ONTECH公司），并回收ZsGreenlDR片段，置换 P4C0L1A2-EGFP 中的 EGFP 片段，构建成报告质粒 p4C0LlA2-ZsGreenlDR。
[0011] 本发明还提供含有所述报告质粒p4C0LlA2-ZsGreenlDR的宿主细胞、工程菌W及 转基因细胞系。
[0012] 本发明还提供抗滤过道癒痕化的药物高通量筛选体系的构建方法，即采用所述报 告质粒p4C0LlA2-ZsGreenlDR转染Tenon囊成纤维细胞，经G418筛选获取克隆细胞，克隆细 胞经连续传代获得的细胞株即为抗滤过道癒痕化的药物高通量筛选体系。
[0013] 本发明还提供由前述方法构建得到的抗滤过道癒痕化的药物高通量筛选体系。
[0014] 本发明进一步提供所述高通量筛选体系在筛选用于抗滤过道癒痕化的药物中的 应用。
[0015] 具体地，本发明的目的是采用W下的技术方案来实现的。
[0016] 基于TGF-e/Smad3的抗滤过道癒痕化药物高通量筛选体系的建立：
[0017] l、Smad3反应性ZsGreenlDR报告基因载体的构建 [001引 （1)载体PSV40-EGFP的构建
[0019] 采用PCR方法扩增P化2-control中的SV40启动子，并用其替换祀GFP-Nl中的CMVie 启动子，构建PSV40-EGFP质粒。具体为：
[0020] 根据pGL2-contro 1质粒中SV40启动子序列用设计一对引物：
[0021] Pl: 5 ' -CGGATTAATGGTACTGTAACTGAG-3 '（下划线表示Ase I酶切位点）
[0022] P2:5'-CCCAAGCTTTTTGCAAAAGCCTA-3'（下划线表示Hind III酶切位点）
[0023] WpGL2-control为模板，PCR扩增目的片断，纯化PCR产物。
[0024] 将载体祀GFP-N巧日SV40启动子PCR产物均应用AseI、Hind虹双酶切，使用凝胶回收 试剂盒纯化酶切产物。将目的片断和载体按10:1的体积比混合，将上述2个纯化的酶切产物 进行连接反应。将连接产物转化到宿主细菌中，后进行重组子筛选，筛选后进行酶切鉴定和 DNA测序鉴定。
[0025] (2)载体 P4C0L1A2-EGFP 的构建
[00%] 将合成的4 X CAGACA基序插入到PSV40-EGFP的趾〇1、Bgl n两酶切位点之间，构建 P4C0L1A2-EGFP载体。具体为：
[0027] 人工合成4XC0L1A2基序：
[002引正义链:5 ' -TCGA(GTGGGGCGGAC) X 4GA-3 '
[0029] 反义链:5 ' -GATCTC(GTCCGCCCCAC) X 4-3 '
[0030] 经退火后形成寡核巧酸双链，5 '、3 '侧分别有趾O巧日Bgl n粘性末端，重复4次的 CAGACA为Smad3转录因子作用的C0L1A2基序及其两端的几个碱基。
[0031] 载体PSV40-EGFP分别应用趾oI、Hind虹W及Bgin、Hind虹双酶切。前者记为A组， 后者记为B组。然后纯化酶切产物，A组回收含EGFP的载体大片段，B组回收含SV40的小片段。 按C0L1A2基序、SV40片段、pEGFP-Nl载体为10:7:1的体积比混合，将上述2个纯化的酶切产 物、新合成基序进行连接反应。将连接产物转化到宿主细菌中，后进行重组子筛选，筛选后 进行酶切鉴定和DNA测序鉴定。
[0032] (3)报告质粒 p4C0LlA2-ZsGreenlDR 的构建
[0033] 酶切 pZsGreenl-DR 质粒并回收 ZsGreenlDR 片段，置换 P4C0L1A2-EGFP 中的 EGFP 片 段，构建成p4C0LlA2-ZsGreenlDR载体。具体为：
[0034] 载体 pZsGreenlDR-Basic 和 P4C0L1A2-EGFP 均采用 EcoRI 和 HpaI 双酶切，使用凝胶 回收试剂盒纯化酶切产物。按ZsGreenlDR片段、pEGFP-Nl载体为7:1的体积比混合，将上述2 个纯化的酶切产物、新合成基序进行连接反应。将连接产物转化到宿主细菌中，然后进行重 组子筛选，筛选后提取质粒，进行酶切鉴定和DNA测序鉴定，即得报告质粒P4C0L1A2-ZsGreenlDR。构建流程如图1所示。
[0035] 2、将构建好的基因载体转染至TCFS，建立高通量筛选体系
[0036] 用报告质粒p4C0LlA2-ZsGreenlDR转染Tenon囊成纤维细胞（Tenon ' S Capsule Fibroblasts，TCFS)，经G418筛选获取克隆细胞，并进行鉴定。
[0037] (1)细胞培养
[0038] 取健康家兔，麻醉后无菌条件下取兔眼结膜下组织，在含双抗的D-化nks液中浸 洗，剪成碎块，接种在25cm2培养瓶中。向培养瓶中加入IOml 10%培养液，置37°C条件下培 养。常规膜蛋白酶-EDTA法消化，m : 3或1:4的比例传代，即得兔TCFS。
[0039] (2)Smad3反应性ZsGreenlDR报告细胞株的建立
[0040] G418浓度的确定:将TCFS细胞接种于24孔板中，采用含20%NCS的DMEM进行培养， 分别加入梯度浓度6418(200、300、400、500、600、700、800旨/1)，并^未加6418组为对照。培 养2周，选择能全部杀死细胞所用G418的最低浓度。
[0041 ] 转染批。5^及6418筛选:大量抽提94〇)1^42-236'6611101?载体，紫外分光光度计法 测定质粒的浓度及纯度，W无血清DMEM将p4C0LlA2-ZsGreenlDR 4. Oiig稀释至25化1。并将 IOul Lipof ectamine?2〇〇〇稀释至250]il，二者混合，形成DNA-Lipof ectamine?2〇〇〇复合 物。加入TCFS中，轻轻摇匀后于37°C解育。转染结束后传代，用含G418(400iig/ml)的DMM完 全培养液4周。挑选生长良好的克隆并分离、收集并转移培养，继续传代，该培养的克隆细胞 即为 TCFS-ZsGreenlDR 细胞株。
[0042] 报告细胞株的鉴定：提取报告细胞株TCFS-ZsGreenlDR及TWS细胞(对照）基因组 DNA，WTCFS-ZsGreenlDR细胞株基因组DNA为模板，W前述用来扩增SV40启动子的下游引物 和4 X COLl A2寡脱氧核巧酸链的正义链为一对引物，进行PCR鉴定。
[0043] 3、筛选体系的反应性、特异性、稳定性评价
[0044] (1)反应性评价一TGF-化、TGF-02诱导表达实验
[0045] 在6孔板中培养TCFS-ZsGreenIDR细胞，待其生长达70 %生长融合时，加入TGF-m (再次实验时加入TGF-的），取其后0、4、12、24、3611共5个时相点，于巧光显微镜下观察细胞 巧光，然后收获细胞，用含4%多聚甲醒的PBS固定lOmin，用流式细胞仪检测绿色巧光蛋白 阳性细胞率及巧光强度。每孔重复3次，并W未加 TGF-0的阳性细胞率及巧光强度为基准，计 算相对阳性细胞率及相对巧光强度。
[0046] (2)特异性评价一Smad3转录因子圈套(Smad3TFD)抑制表达实验
[0047] 设计并合成针对S m a d 3的寡核巧酸单链：5 ' -CGTTGTCTGCATTTTTTTAATGCAGACAACGTGATGCAGACAACTTTTTG TTGTCTGCATCA-3 '
[004引下划线为C0L1A2基序，退火后形成含2 X C0L1A2基序的哑铃型DNA双链，如图2所 示，同时设计并合成5 '端标记6-簇基巧光素(FAM)的Smad3T抑W测定其转染效率。
[00例 Smad3TFD转染效率的测定：将TCFS-ZsGreenlDR细胞接种于6孔培养板，用脂质体 Lipof ectamine?2000将5 ' 端标记有6-FAM 的 Smad3T 抑（Img/L)转染 TCFS-ZsGreenlDR 细胞， 继续培养12h后，观察细胞巧光并进行流式细胞检测，确定转染效率。
[005日]Smad3TFD 抑制ZsGreenlDR 表达：将51113(131。0^0、0.5、1和2111旨几剂量分别转染 TCFS-ZsGreenlDR细胞，并WTCFS细胞作为阴性对照，半小时后加入12.5ng/ml TGF-Pl，继 续培养12h后，观察细胞巧光并用流式细胞观测阳性细胞率及细胞巧光强度。每孔重复3次， 并W转染Smad3TFD后未加 TGF-Pl的阳性细胞率及巧光强度为基准，计算相对阳性细胞率及 相对巧光强度。
[0化1 ] (3)TCFS-ZsGreenlDR细胞株稳定性的鉴定
[0化2 ]将TCFS-ZsGreen IDR细胞株经冻存90天后复苏，连续传代培养3个月。然后用TGF-0 1(再次实验时加入TGF-的)作用，并于其后0、4、12、24、3611观察巧光并进行流式细胞仪检测 ZsGreenlDR的表达情况。
[0053] 本发明基于细胞、分子水平药物筛选模型建立的抗滤过道癒痕化的药物高通量筛 选体系，可弥补传统药物筛选体系的缺陷，已逐渐成为药物筛选的主要方法。另外，其独特 的优势在于，可W 了解药物复方成分中的几乎全部有效成分，对于质量控制具有很大的指 导意义，易将研究成果转化为产品，实现新药的创制。
【附图说明】
[0054] 图1为本发明实施例1中报告质粒p4C0LlA2-ZsGreenlDR的构建流程图。
[0055] 图2为本发明实施例1中含2 X C0L1A2基序的哑铃型DNA双链。
[0化6] 图3为本发明实施例1中p4C0LlA2-ZsGreenlDR载体的酶切鉴定结果。
[0化7] 图4为本发明实施例1中经G418干预2周的TCFS-ZsGreenlDR细胞形态。
[0化引图5为本发明实施例1中扩大培养的TCFS-ZsGreenlDR细胞形态。
[0059] 图6为本发明实施例1中扩大培养的TCFS-ZsGreenlDR细胞的弱巧光。
[0060] 图7为本发明实施例1中TCFS-ZsGreenlDR细胞与TWS细胞(对照）的PCR产物电泳 鉴定结果。
[0061 ] 图8为本发明实施例1中TCFS-ZsGreenlDR在不同时相的ZsGreenl-DR巧光平均光 密度值。
[0062] 图9为本发明实施例1中TCFS-ZsGreenlDR在化时相发出的巧光。
[0063] 图10为本发明实施例1中TCFS-ZsGreenlDR在4h时相发出的巧光。
[0064] 图11为本发明实施例1中TCFS-ZsGreenlDR在1化时相发出的巧光。
[0065] 图12为本发明实施例1中CFS-ZsGreenlDR在2地时相发出的巧光。
[0066] 图13为本发明实施例1中TCFS-ZsGreenlDR经冻存、复苏、传代后在不同时相的 ZsGreenl-DR巧光平均光密度值。
[0067] 图14为本发明实施例1中TCFS-ZsGreenlDR在化时相发出的巧光。
[0068] 图15为本发明实施例1中TCFS-ZsGreenlDR在4h时相发出的巧光。
[0069] 图16为本发明实施例1中TCFS-ZsGreenlDR在1化时相发出的巧光。
[0070] 图17为本发明实施例1中TCFS-ZsGreenlDR在2地时相发出的巧光。
[0071] 图18为本发明实施例2中TCFS-ZsGreenlDR细胞在24孔板内的分组情况;其中，1-4 孔，空白孔;5-8孔，阴性对照:饲养TCFS-ZsGreenlDR细胞，不加入TGF-m与青光安组分;9-12孔，阳性对照：饲养TCFS-ZsGreenlDR细胞，只加入TGF-m ; 13-24孔，加药筛选孔：饲养 TCFS-ZsGreenlDR细胞，先加入TGF-化，后加入中药组分。
【具体实施方式】
[0072] W下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例 均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（Sambrook J&Russell DW, Molecular cloning:a Iaboratoiy manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
[0073] 实施例1抗滤过道癒痕化的药物高通量筛选体系的构建
[0074] (一)基于TGF-e/Smad3的抗滤过道癒痕化药物高通量筛选体系的建立 [00巧]l、Smad3反应性ZsGreenlDR报告基因载体的构建
[0076] (1)载体 PSV40-EGFP 的构建
[0077] 采用PCR方法扩增pGL2-control中的SV40启动子，并用其替换祀GFP-Nl中的CMVie 启动子，构建PSV40-EGFP质粒。具体为：
[0078] 根据pGL2-contro 1质粒中SV40启动子序列用设计一对引物：
[0079] Pl:5'-CGGATTAATGGTACTGTAACTGAG-3'（下划线表示Ase I酶切位点）P2: 5'-CCCAAGCTTTTTGCAAAAGCCTA-3'（下划线表示Hind III酶切位点）
[0080] WpGL2-control为模板，PCR扩增目的片断，纯化PCR产物。
[0081 ] 将载体祀GFP-N巧日SV40启动子PCR产物均应用AseI、Hind虹双酶切，使用凝胶回收 试剂盒纯化酶切产物。将目的片断和载体按10:1的体积比混合，将上述2个纯化的酶切产物 进行连接反应。将连接产物转化到宿主细菌中，后进行重组子筛选，筛选后进行酶切鉴定和 DNA测序鉴定。
[0082] (2)载体 P4C0L1A2-EGFP 的构建
[0083] 将合成的4 X CAGACA基序插入到PSV40-EGFP的趾〇1、Bgl n两酶切位点之间，构建 P4C0L1A2-EGFP载体。具体为：
[0084] 人工合成4XC0L1A2基序：
[00化]正义链：5 ' -TCGA(GTGGGGCGGAC) X 4GA-3 '
[0086] 反义链:5 ' -GATCTC(GTCCGCCCCAC) X 4-3 '
[0087] 经退火后形成寡核巧酸双链，5 '、3 '侧分别有趾O巧日Bgl n粘性末端，重复4次的 CAGACA为Smad3转录因子作用的C0L1A2基序及其两端的几个碱基。
[008引载体PSV40-EGFP分别应用趾oI、Hind虹W及Bgin、Hind虹双酶切。前者记为A组， 后者记为B组。然后纯化酶切产物，A组回收含EGFP的载体大片段，B组回收含SV40的小片段。 按C0L1A2基序、SV40片段、pEGFP-Nl载体为10:7:1的体积比混合，将上述2个纯化的酶切产 物、新合成基序进行连接反应。将连接产物转化到宿主细菌中，后进行重组子筛选，筛选后 进行酶切鉴定和DNA测序鉴定。
[0089] (3)报告质粒 p4C0LlA2-ZsGreenlDR 的构建
[0090] 酶切pZsGreenl-DR质粒（购自CL0NTECH公司）并回收ZsGreenlDR片段，置换 P4C0L1A2-EGFP 中的 EGFP 片段，构建成 p4C0LlA2-ZsGreenlDR 载体。具体为：
[0091] 载体 pZsGreenlDR-Basic 和 P4C0L1A2-EGFP 均采用 EcoRI 和 HpaI 双酶切，使用凝胶 回收试剂盒纯化酶切产物。按ZsGreenlDR片段、pEGFP-Nl载体为7:1的体积比混合，将上述2 个纯化的酶切产物、新合成基序进行连接反应。将连接产物转化到宿主细菌中，然后进行重 组子筛选，筛选后提取质粒，进行酶切鉴定和DNA测序鉴定，即得报告质粒P4C0L1A2-ZsGreenlDR。构建流程如图1所示。
[0092] 2、将构建好的基因载体转染至TCFS，建立高通量筛选体系
[0093] 用报告质粒p4C0LlA2-ZsGreenlDR转染Tenon囊成纤维细胞（Tenon ' S Capsule Fibroblasts，TCFS)，经G418筛选获取克隆细胞，并进行鉴定。
[0094] (1)细胞培养
[00M]取健康家兔，麻醉后无菌条件下取兔眼结膜下组织，在含双抗的D-化nks液中浸 洗，剪成碎块，接种在25cm2培养瓶中。向培养瓶中加入IOml 10%培养液，置37°C条件下培 养。常规膜蛋白酶-EDTA法消化，m : 3或1:4的比例传代，即得兔TCFS。
[0096] (2) Smad3反应性ZsGreenlDR报告细胞株的建立
[0097] G418浓度的确定:将TCFS细胞接种于24孔板中，采用含20%NCS的DMEM进行培养， 分别加入梯度浓度6418(200、300、400、500、600、700、800旨/1)，并^未加6418组为对照。培 养2周，选择能全部杀死细胞所用G418的最低浓度。
[0098] 转染TCFSW及G418筛选:碱裂解法大量抽提p4C0LlA2-ZsGreenlDR载体，然后酶切 鉴定，结果见图3。取化1抽提的DNA溶液，溶于9如1 d地2〇中，用紫外分光光度计测定其浓 度，连续测定3次，取平均值，pC0LlA2-ZsGreenlDR质粒DNA的测定浓度为675. Ong/山，0〇26〇/ 0〇28〇 = 1.778。
[0099] 转染前2地，Wo. 25%膜酶+0.02%抓TA消化。进行TCFS细胞传代，并W细胞密度4 XioVUml无抗生素 DMEM+15%NCS)，接种6孔板。次日，待细胞融合度>90%时进行转染。取 出细胞培养板，吸出原有的培养液，用无抗生素 DMEM浸洗细胞培养板2次，吸出所有残液，将 混合好的50化1 DNA-Lipofectamine ?2〇〇〇复合物加入6孔板中的巧L，悬空滴加，边滴加便 轻轻摇晃培养板，摇匀后于37°C5%C02培养箱中解育。
[0100] 重复W上操作，Wl号培养孔为空白对照孔，滴加50化1无抗生素 DMEM;将2号-6号 培养孔中均滴加50化1 DNA-Lipof ectamine?2000复合物。
[0101] 细胞培养板放入37°C5%C化培养箱中解育5小时；5小时后，吸出SOOiilDNA-Lipofectamine ?2〇〇〇复合物，用无抗生素 DMEM洗涂1次，加入10%NCS的DMEM完全培养液， 继续培养2地。
[0102] 转染结束后，更换含20 %NCS的DMEM完全培养液，继续在6孔板中培养2地，然后用 含G418(800iig/ml)的DMM完全培养液继续培养2周，每隔3-4天换液一次；2周后，用含G418 (200iig/ml)的DMEM完全培养液继续培养4周，观察G418抗性克隆细胞的生长情况(若需要传 代时，按照1:6的比例传代，即巧L细胞传代至1块6孔板）。
[0103] 在倒置显微镜下挑选生长良好的克隆并做好标记，弃去上清，W无菌克隆环薩取 少量灭菌凡±林分隔细胞，向克隆环中滴加少量0.25%膜酶+0.02%抓TA消化细胞3-5min， 吸取消化液并加入少量完全培养液洗吸克隆，收集并离屯、后将细胞转入24孔板中培养，37 °C5 %C〇2环境下，W含G418(200iig/ml)的DMEM完全培养液继续培养。待细胞长满孔底后，转 入细胞培养瓶中，37°C5 %C〇2环境下，W含G418(200iig/ml)的DMEM完全培养液扩大培养。该 培养的克隆细胞即为TCFS-ZsGreenlDR细胞株。
[0104] 报告细胞株的鉴定:取TCFS-ZsGreenlDR细胞株及TCFS细胞各1瓶，弃去培养液，用 PBS液冲洗，用细胞刮将培养瓶中细胞尽量全部刮下，PBS收集后，分装2支EP管，短暂离屯、， 各加化ipure Iml，吹打，室溫放置5分钟(裂解蛋白）；加0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒，室溫放 置2-15min，12000巧m，4 °C离屯、15min;离屯、后可见管中溶液分为3层，取下层DNA，加0.3ml无 水乙醇，混匀，室溫放置2-3min，200化pm，4 °C离屯、15min;弃上清，加 Iml巧樣酸钢，室溫放置 30min，重悬，2000rpm，4°C离屯、5min ;再次弃上清，加 Iml巧樣酸钢，室溫30min，重悬， 2000巧m，4°C离屯、5min; 1.5-2. Oml 75 % 乙醇沉淀DNA; 2000rpm，4°C离屯、5min，弃上清，弃多 余乙醇；调抑值为7-8。
[0105] PCR鉴定：W上述细胞株基因组DNA为模板，W前述用于扩增SV40启动子的下游引 物和4 X COLl A2寡脱氧核巧酸链的正义链为一对引物，进行PCR鉴定。
[0106] (二)筛选体系的反应性、特异性、稳定性评价
[0107] 1、抗癒痕增生药物高通量筛选体系对Smad3活性变化的监测效果评价一TGF-Pl诱 导表达实验
[0108] 取扩大培养的TCFS-ZsGreenlDR细胞接种于6孔板中培养，TCFS-ZsGreenlDR细胞， 待其生长达70 %生长融合时，在2-6号孔中加入TGF-Pl (12.5ng/ml)，每孔培养液2ml，即加 入TGF-化储存液25iil。
[0109] 取滴加 TGF-Pl后0、4、12、24h共4个时相点，于巧光显微镜下观察细胞巧光，随机选 取4个视野，并予W巧光图像摄像。
[0110] 2、特异性评价一Smad3转录因子圈套(Smad3TFD)抑制表达实验
[0111] 设计并合成针对S m a d 3的寡核巧酸单链：5 ' -CGTTGTCTGCATTTTTTTAATGCAGACAACGTGATGCAGACA ACTTTTTGTTGTCTGCATCA-3 '
[0112] 下划线为C0L1A2基序，退火后形成含2 X C0L1A2基序的哑铃型DNA双链，如图2所 示，同时设计并合成5 '端标记6-簇基巧光素(FAM)的Smad3T抑W测定其转染效率。
[0113] Smad3TFD转染效率的测定:将TCFS-ZsGreenlDR细胞接种于6孔培养板，用脂质体 Lipof ectamine?2〇〇〇将5 ' 端标记有6-FAM 的 Smad3T 抑（Img/L)转染 TCFS-ZsGreenlDR 细胞， 继续培养12h后，观察细胞巧光并进行流式细胞检测，确定转染效率。
[0114] Smad3TFD 抑制ZsGreenlDR 表达：将51113(131。0^0、0.5、1和2111旨几剂量分别转染 TCFS-ZsGreenlDR细胞，并WTCFS细胞作为阴性对照，半小时后加入12.5ng/ml TGF-Pl，继 续培养12h后，观察细胞巧光并用流式细胞观测阳性细胞率及细胞巧光强度。每孔重复3次， 并W转染Smad3TFD后未加 TGF-Pl的阳性细胞率及巧光强度为基准，计算相对阳性细胞率及 相对巧光强度。
[0115] 3、TCFS-ZsGreenlDR细胞株稳定性的鉴定
[0116] (1)细胞的冻存
[0117] (2)复苏 [011引（3)加药观察
[0119] 待其生长达70 %生长融合时，在2-6号孔中加入TGF-m (12.5ng/ml)，每孔培养液 2ml，即加入TGF-化储存液。
[0120] 取滴加 TGF-Pl后0、4、12、24h共4个时相点，于巧光显微镜下观察细胞巧光，随机选 取4个视野，并予W巧光图像摄像。
[0121] 4、结果
[0122] (I)TCFS-ZsGreenlDR 细胞形态
[0123] 用含G418(800μg/ml)的DMEM完全培养液继续培养2周后，TWS细胞大量被G418杀 死，仅留下少量细胞存活，生长缓慢，存活的细胞形态同未转染的TCFS，如图4所示。
[0124] 挑选生长良好的克隆并扩大培养后，TCFS-ZsGreenlDR细胞逐渐生长，形态同未转 染的TCFS，细胞如多边形或梭性，如图5所示。
[01巧]TCFS-ZsGreenlDR细胞在扩大培养之后，W巧光显微镜观察，100倍、200倍巧光显 微镜下观察未见绿色巧光，但在400倍显微镜下观察可见弱巧光，如图6所示。
[01%] (2)报告细胞株TCFS-ZsGreenlDR的PCR鉴定结果
[0127] 实验已成功获取Smad3反应性ZsGreenl-DR报告细胞株TCFS-ZsGreenlDR,对PCR产 物进行电泳鉴定，结果如图7所示。
[0128] (3)TCFS-ZsGreenlDR的TGF-化诱导表达实验结果
[01巧]加入TGF-Pl前及加入TGF-Pl在Oh时，TCFS-ZsGreenlDR细胞仅在400倍巧光显微镜 下观察可见少量带弱巧光的细胞;加入TGF-Pl在4h时TCFS-ZsGreenlDR细胞在100倍显微镜 下即可见绿色巧光，可见较多处发光点；在1化达到高峰，细胞巧光强亮，且发光点多；在24h 时细胞平均光密度明显下降(表1，图8-12)。
[0130] 表1TCFS-ZsGreenlDR在不同时相的ZsGreenl-DR巧光平均光密度值
[0131]
[0132] (4)TCFS-ZsGreenlDR细胞株稳定性评价
[0133] 将TCFS-ZsGreenlDR细胞株冻存30天，复苏并传代培养30天，加入TGF-m在Oh时， TCFS-ZsGreenlDR细胞仅在400倍巧光显微镜下观察可见少量带弱巧光的细胞;加 TGF-Pl诱 导4h后TCFS-ZsGreenlDR细胞可见较亮绿色巧光；1化时，细胞巧光强亮;24h时细胞平均光 密度明显下降；说明TCFS-ZsGreenlDR细胞株经冻存、复苏、传代后仍能有效反映 TGF-Pl对 Smad3的诱导激活作用(表2，图13-17)。
[0134] 表2TCFS-ZsGreenlDR在不同时相的ZsGreenl-DR巧光平均光密度值
[0135]
[0136] 实施例2利用本发明的药物高通量筛选体系进行青光安中药组分库的筛选
[0137] UTCFS-ZsGreenlDR 复苏
[0138] 将TCFS-ZsGreenlDR细胞株经冻存管从液氮罐中取出后，立即投入42°C水中，待冻 存管中液体全部融化后，将冻存管中液体转移至24孔培养板中，继续W无抗生素 DMEM+10% 胎牛血清培养。
[0139] 2、种植反应性细胞株W及分组
[0140] 将24孔板中的TCFS-ZsGreenlDR按照图18进行分组培养（细胞只在5-24孔中存 在），具体分布如图18所示。
[0141] 3、加入 TGF-化
[0142] 待细胞生长达70 %生长融合时，在9-12孔中加入TGF-m，浓度为12.5ng/ml。每孔 培养液Iml，即加入TGF-化储存液12.5iil。
[0143] 4、加入组分
[0144] 在加入TGF-m后4小时，将C〇2培养箱中将培养板取出，在13-24孔中加入组分。按 照事先组分库中的顺序，在13-24孔中加入1-12号组分，统一终浓度为lOOng/ml，由于24孔 板每孔中已经含有Iml完全培养液，即需要中药组分l(K)ng，即需要相应在每加药筛选孔中 滴加 IOyl。
[0145] 5、观察
[0146] 根据先前实验，滴加 TGF-m后，在12h时相点显微镜下细胞巧光最明显的结果，在 药物筛选中亦选择12h运个时相点进行观察。
[0147] 于巧光显微镜下观察细胞巧光，随机选取5个视野，并予W巧光图像摄像。巧光照 片采用MIAS-1000型高清晰度彩色病理图文分析系统中的巧光表达测量系统，W2.105WI1为 像素点长，在1.271 X IO6曲I2窗口面积下测量ZsGreenl-DR激发巧光的平均光密度值，进行半 定量分析。
[014引 6、结果判定
[0149] 将加药筛选孔（13-24孔)的平均光密度值与阳性对照(9-12孔）的结果进行对照， 进行方差分析，若与9-12孔的平均光密度值数据两两比较有显著性差异，并且平均光密度 值之间的差值要大于5% (即差值大于0.050)，则视为该中药组分有抑制TGF-m的效应，判 定为阳性中药组分。
[0150] 由此可见，利用该体系每次可筛选12种组分，重复操作4次，即进行4块24孔筛选操 作，可将中药小规模组分库筛选完成。
[0151] 7、反复多次筛选
[0152] 将每次筛选结果集合在一起，并提高结果判定水平，将"平均光密度值之间的差值 要大于5%"提高到"平均光密度值之间的差值要大于20%"，按照上述同样的筛选流程，进 行反复筛选。直到筛选出结果最优的约巧巾有效组分。
[0153] 反复多次筛选的必要性在于:①有利于判断阳性中药组分的抑制TGF-m效应的可 重复性、稳定性;②将筛选结果集中到5种左右的青光安有效组分，缩小了研究范围，减少了 不必要的研究开支，有利于对其进行进一步的动物模型验证，进而有利于决策该有效组分 是否值得开发。
[0154] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可W对之作一些修改或改进，运对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的运些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【主权项】
1. 报告质粒p4C0LlA2-ZsGreenlDR，其特征在于，所述报告质粒的构建方法如下： 1) 采用PCR方法扩增pGL2-con tro 1中的SV40启动子，并用其替换pEGFP-N 1中的CMVIE启 动子，构建PSV40-EGFP质粒； 2) 将合成的4XCAGACA基序插入到pSV40-EGFP的Xho I、Bgl Π 两酶切位点之间，构建 P4C0L1A2-EGFP 载体； 3) 酶切pZsGreenl-DR质粒，并回收ZsGreenlDR片段，置换p4⑶L1A2-EGFP中的EGFP片 段，构建成报告质粒p4C0LlA2-ZsGreenlDR。2. 含有权利要求1所述报告质粒的转基因细胞系。3. 含有权利要求1所述报告质粒的工程菌。4. 抗滤过道瘢痕化的药物高通量筛选体系的构建方法，其特征在于，用权利要求1所述 报告质粒p4C0LlA2-ZsGreenlDR转染Tenon囊成纤维细胞，经G418筛选获取克隆细胞，克隆 细胞经连续传代获得的细胞株即为抗滤过道瘢痕化的药物高通量筛选体系。5. 由权利要求3所述方法构建得到的抗滤过道瘢痕化的药物高通量筛选体系。6. 权利要求5所述高通量筛选体系在筛选用于抗滤过道瘢痕化的药物中的应用。
【文档编号】C12N15/85GK105861550SQ201610244659
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年4月19日
【发明人】彭清华, 姚小磊, 谭涵宇, 彭俊
【申请人】湖南中医药大学