联合表达microRNAs抑制乳腺癌细胞增殖的载体及其构建方法和应用
【专利摘要】本发明为联合表达microRNAs抑制乳腺癌细胞增殖的载体及其构建方法和应用，公开了一种核酸构建载体。本发明还公开了核酸构建载体用于制备抑制乳腺癌细胞增殖的组合物方面的应用。本发明还公开了一种真核联合表达载体pEGFPC3?miR145/16，本载体可以同时表达两个成熟的microRNA分子：miR145?5p和miR16?5p，其表达效率不受插入位置(即距离启动子远近)的影响，并且靶向miR155?5p高水平表达的乳腺癌细胞系具有很强的协同抑制肿瘤生长作用。本发明的microRNAs联合表达载体可显著抑制乳腺癌细胞的增殖并表现特异性。本发明为建立靶向治疗特定种类乳腺癌的miR145?5p和miR16?5p联合治疗核酸药物提供了实验基础和理论依据。
【专利说明】
联合表达m i croRNAs抑制乳腺癌细胞増殖的载体及其构建方 法和应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物医药领域，具体设及联合表达microRNAs抑制乳腺癌细胞增殖的 载体及其构建方法和应用；具体构建用于联合表达miR145-5p和miR16-5p的抑制乳腺癌细 胞增殖的真核表达载体，在乳腺癌细胞中验证其作用效应和治疗用途。
【背景技术】
[0002] 近年来，乳腺癌发病率呈现快速上升的趋势。我国女性乳腺癌发病率正W每年3% ~4 %的比例急剧增加，而中国城镇中年人口中，乳腺癌发病率在过去数十年增长了 20 %~ 30%，成为我国发病率增幅最快的恶性肿瘤之一。由于乳腺癌发病率高、危害性大，已经成 为严重危害人民健康、制约经济发展的重要疾病。然而，迄今为止，国际上对于乳腺癌治疗 的特效药物并不多，针对各类型乳腺癌的治疗方法并不完全有效，探索乳腺癌的发病机制 和防治方法是应用基础和临床研究领域的重要课题。
[0003] MicroRNAs为一种新型的基因调控因子，它能在转录后水平抑制祀基因的表达或 蛋白翻译，从而参与生物体内多种生理、病理过程的调节，如细胞分化、增殖、调亡、迁移和 侵袭等。乳腺癌组织/细胞特异性高水平表达的microRNAs有几大类，如miR21、miR155、 miR301、miR375 等，特异性低表达的 microRNAs 有:11111?145、11111?12513、11111?16、161-7日等。关于 microRNAs与肿瘤的关系已经有很多文献报道，正常细胞和肿瘤细胞中的microRNAs表达水 平的差异，表明microRNAs的异常表达与肿瘤发生之间具有特定的相关性。MicroRNAs作为 有前景的肿瘤治疗的核酸药物，其体外转染给药和其表达丰度对肿瘤的祀向治疗尤为重 要。如何将体外microRNAs运送到祀组织，保持其效能与祀向性成为此项技术的关键点之 O
[0004] MicroRNAs种类及其作用的祀基因众多，考虑到单种microRNA分子对肿瘤细胞的 作用有限，因此常将抑癌的microRNAs与肿瘤抑制剂联合使用。此外，还可考虑联合两种或 多种microRNAs的表达及其协同作用获得增强的抗肿瘤效应，有研究报道将共表达（CO-expressed)的miR145和miR143的分子簇(miR143/145cluste;r)转染细胞后，共同作用于肿 瘤细胞，具有良好的协同作用。但有研究发现将两个microRNAs分子依次插入在同一个表达 载体上转染细胞其表达水平存在差异，即表达效率受插入位置的影响：靠近启动子的 microRNAs表达效率要高于远离启动子的microRNAs分子。因此，研究不受插入表达载体位 置（即距离启动子远近）的影响从而满足高效表达，又同时可发挥几种microRNAs协同作用 的基因药物成为此项技术的另一个关键点。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的第一个技术问题是提供了一种核酸构建载体，用真核表达载体 高效表达microRNAs，使得插入的目的microRNAs的表达不受插入位置的影响，即所表达的 mi croRNAs表达效率相互不影响；
[0006] 本发明还要解决的技术问题是提供一种核酸重组表达载体。本发明的目的是提供 一种microRNAs表达载体，所构建的microRNAs表达载体只在miR155-5p高表达的乳腺癌肿 瘤细胞中高表达，而在miR155-5p低表达的正常细胞中表达很弱，从而达到祀向抑制特定乳 腺癌细胞的作用。
[0007] 本发明最后要解决的技术问题是根据乳腺癌细胞中两种microRNAs的表达的特异 性，通过上述的核酸重组表达载体在乳腺癌细胞/组织内表达期望的microRNAs,从而实现 协同抑制乳腺癌细胞的增殖达到抑癌方面的应用。
[0008] 为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
[0009] 本发明提供了一种核酸构建载体，其包括至少一种编码microRNAs的核酸分子，和 一种编码结合沉默复合物的核酸序列，和一种编码间隔microRNAs的核酸序列，和一种编码 减少通读现象的核酸序列;其中所述的核酸构建载体使得所述的microRNAs的核酸分子，和 结合沉默复合物的核酸序列，和间隔microRNAs的核酸序列，和编码减少通读现象的核酸序 列能够共顺反子的表达。
[0010] 其中，上述的编码microRNAs的核酸分子是miR145-5p和miR16-5p，其核巧酸序列 分别如SEQ ID NO: 1和核巧酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0011] 其中，上述的一种编码结合沉默复合物的序列是miR155-5p的反义链，其核巧酸序 列如沈Q ID NO:3所示。
[0012] 其中，上述的一种编码间隔microRNAs的序列是6bp的核酸序列，其核巧酸序列如 沈Q ID NO:4所示。
[0013] 其中，上述的一种编码减少通读现象的序列是一个短的POlyA序列，其核巧酸序列 如沈Q ID NO:5所示。
[0014] 上述的核酸构建载体用于制备抑制细胞增殖的组合物方面的应用。
[0015] -种重组载体，其含有上述的核巧酸序列。
[0016] 上述的重组载体，包括编码microRNAs的核酸分子，编码miR155-5p的对应反义链 核酸序列，编码间隔microRNAs的核酸序列，编码减少通读现象的核酸序列中的一种或几 种，并且编码microRNAs的核酸分子两边都是miR155-5p反义链，编码microRNAs的核酸分子 与miR155-5p反义链之间由化P间隔序列连接，所述编码microRNAs的核酸分子包括miR145-5p和miR16-5p;其中所述重组载体使得所述编码microRNAs的核酸分子能够共顺反子地表 达。
[0017] 一种真核联合表达载体pEGFPC3-miR145/16,所述载体同时表达两个成熟的 microRNAs 分子:miR145-5p 和miR16-5p。
[0018] 上述的重组载体在制备乳腺癌药物方面的应用。
[0019] 上述的重组载体在乳腺癌导管癌细胞内表达期望的microRNAs协同抑制增殖药物 方面的应用。
[0020] 本发明构建的microRNAs表达载体，表达的两种microRNAs为miR145-5p和miR16-5p的成熟序，列具有抑癌作用、协同作用；该表达载体含有可W特异性结合癌细胞中的 miR155-5p的序列:miR155-5p反义链。
[0021] 本发明构建的microRNAs表达载体的目的片段两侧都是miR155-5p反义链。
[0022] 本发明构建的microRNAs表达载体，表达的序列在吸附miR155-5p后，会被沉默复 合物剪切，将miR155-5p反义链从表达序列上切下。
[0023] 本发明构建的microRNAs表达载体，在miR155-5p反义链被切掉之后，即形成 miR145-5p和miR16-5p的成熟序列。
[0024] 发明人构建了联合表达miR145-5p和miR16-5p并特异性祀向乳腺癌细胞的真核表 达载体，实现特异性高效表达目的microRNAs，并有效的抑制乳腺癌肿瘤细胞生长。
[0025] 本发明的具体方法如下：
[0026] 一、MicroRNAs协同作用的筛选
[0027] 筛选的microRNA mimics药物购于广州锐博生物科技有限公司:miR145-5p mimic (micrON? hsa-miR-145-5p agomir)，miR125b-5p mimic(micr0N? hsa-miR-125b-5p agomir)，miR16-5p mimic(micr0N? hsa-miR-16b-5p agomir)，let-7a mimic(micr0N? hsa-let-7a-5p agomir) ,Negative control mimic ( niicrON 蛋.microRNAs mimic control)。
[002引选取4种文献报道的乳腺癌中低表达的microRNAs分子（miR145-5p mimic,、 miR12f5b-5p mimic、miR16-5p mimic、let-7a mimic)，两两一组分别共转染T47D细胞，MTT 增殖实验结果显示，miR145-5p和miR16-5p具有最佳协同作用（图1-A、图1-B)。
[00巧]二、MicroRNAs真核表达载体的构建
[0030] 为了实现本发明的目的，发明人设计联合表达miR145-5p和miR16-5p的真核表达 载体的构建方法，在于:用同尾酶将目的片段连接到真核表达载体祀GFPC3上。
[0031] 本发明使用的祀GFPC3载体(Clontech公司，美国）是非病毒性哺乳动物细胞表达 载体，启动子是CMV，载体大小4727bp，载体标签:N-EGFP，载体抗性:卡那霉素，载体筛选标 记:新霉素。多克隆位点(MCS)区在1328-1413bp，如图2-A所示。
[0032] 本发明构建的所有载体，选择插入目的片段的限制性内切酶位点为多克隆位点区 (MCS)的Bgl H和EcoR I(原始载体 1335bp和 1360bp之间），如图2-A所示。祀GFPC3-miR145/ 16、口66。？〔3-11111?16/145、966。？〔3-11111?145、祀6。？〔3-11111?16和祀6。？〔3-11111?^等载体的构建 按图2-B所示将各个片段依次插入祀GFPC3。各插入片段由深圳华大基因科技服务有限公司 合成：
[0033] miR145-5p，其核巧酸序列如沈Q ID N0:1所示。
[0034] miR16-5p，其核巧酸序列如沈Q ID N0:2所示。
[00巧]11111?155-59的反义链，其核巧酸序列如沈9 10^:3所示。
[0036] 6bp间隔microRNAs的核酸序列，为限制性内切酶连接形成的序列。其核巧酸序列 如沈Q ID NO:4所示。
[0037] 短的POlyA序列，其核巧酸序列如SEQ ID NO: 5所示。
[0038] miRNC(无意链序列，即序列不祀向任何一个基因），其核巧酸序列如SEQ ID N0:6 所示。
[0039] 所有合成序列5'端加入Bgin，3'端加入Bgin和EcoRI。
[0040] 所有合成序列都是同时合成两条互补双链。
[0041 ] =、McroRNAs真核表达载体对T47D细胞抑制率检测
[0042] 将构建的microRNAs真核表达载体转染T47D细胞，通过MTT增殖实验，检测不同载 体对T47D细胞的抑制率。如图3所示，在细胞水平证实了祀GFPC3-miR145/16具有最佳的抑 制T47D细胞增殖效果。
[00创四、McroRNAs真核表达载体的表达效率检测
[0044] 将构建的几种micoRNA真核表达载体或microRNA mimics转染T47D细胞，4化后，提 取总RNA，TARAKA公司试剂盒反转录第一链，实时巧光定量PCR检测各个载体的目的片段的 表达。如图4所示，在mRNA水平证实构建的真核表达载体能够成功表达miR145-5p、miR16-5p、miRNC等相应的目的片段。
[0045] 五、Mcr oRNAs真核表达载体对预测祀基因的mRNA水平的抑制
[0046] 将构建的几种micoRNA真核表达载体或microRNA mimics转染T47D细胞，4化后，提 取总RNA，TARAKA公司试剂盒反转录第一链，实时巧光定量PCR检测各个实验组的祀基因的 表达。如图5所示，在mRNA水平上证实了转染构建的各种microRNAs表达质粒或microRNA 111；[1]1；[。3后，切(31;[]1〇1(周期蛋白01)、(：-1]17(3(>-1]17(3禽骨髓细胞瘤病毒癌基因同源物）、化41/ 2(细胞外信号调节激酶)基因的表达下降，单独转染祀GFPC3-miR145或pEGFPC3-miR16,或 单独转染miR145-5p mimic或miR16-5p mimic后，B化2(B细胞慢性淋己细胞白血病/淋己瘤 2)的表达上调，共转染miR145-5p和miR16-5p的mimic或祀GFPC3-miR145/16后，B化2的表达 下降。
[0047] 六、MicroRNAs真核表达载体对预测祀基因的蛋白水平的抑制
[004引将构建的几种microRNA真核表达载体转染T47D细胞，加药处理4她后用全蛋白提 取试剂盒化GP2100，凯基生物)提取细胞总蛋白；然后用BCA法定量蛋白浓度，取50iig蛋白上 样跑SDS-PAGE电泳;如图6-A、图6-B所示，通过对4个祀基因的检测，发现几个祀蛋白在单独 转染pEGFPC3-miR145或祀GFPC3-miR16时无明显抑制作用，在转染祀GFPC3-miR145/16后， Erkl/2、CyC1 in Dl、C-myC、B化2都被敲降，Wb化2最为明显。
[0049] 有益效果:本发明所构建的表达载体用于目的microRNAs的表达不受插入位置(即 距离启动子远近)的影响，可同时高效表达两种抑癌microRNAs分子miR145-5p和miR16-5p; 本发明所构建的载体祀向miR155-5p高表达的乳腺癌细胞体现了显著的协同抑癌作用。发 明人构建新型生物载体的方法有望在临床上应用于治疗特定种类的乳腺癌，提高患者的存 活率和生存质量。
【附图说明】
[0050] 图1四种microRNAs两两组合对T47D细胞的抑制率（图1-A:单独加药处理的抑制 率;图1-B:组合加药处理的抑制率；）
[0051] 图2载体构建示意图。（图2-A:载体构建使用的原始载体PEGFPC3示意图；图2-B: 祀 GFPC3-miR145/16 联合表达载体、pEGFPC3-miR16/145 联合表达载体、pEGFPC3-miR145 表 达载体、祀GFPC3-miR16表达载体、pEGFPC3-miRNC表达载体等构建示意图；图2-C成功构建 的祀 GFPC3-miR145/16,祀 GFPC3-miR16/145,祀 GFPC3-miR145 或祀 GFPC3-miR16 或祀 GFPC3-miRNC测序图；）
[0052] 图3 MTT法检测构建载体抑制T47D细胞增殖的作用（图3 :MTT实验结果）；
[0053] 图4实时巧光定量PCR检测构建的质粒表达目的片段的效率（图4-A:miR145-5p和 miR16-5p含量的实时巧光定量PCR检测；图4-B:miRNC含量的实时巧光定量PCR检测）；
[0054] 图5实时巧光定量PCR检测4个预测祀基因表达；
[0化5] 图6 Western blot检测4个预测勒!基因的表达（图6-A:weste;rn blot结果图；图6-B:weste;rn blot条带灰度扫描结果柱状图）；
【具体实施方式】
[0056] 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会 理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。一般地，本说明书中 关于细胞核组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、基因、蛋白质和核酸化学、和杂交使 用的术语和技术是本领域众所周知并且通常使用的。一般地，除非另外指出，否则本发明方 法和技术都是根据本领域众所周知，并且在本说明书中所引用或讨论的各种一般性和专业 出版物中有介绍的标准方法来实施。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商 建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可W通过市购获得的常规产品。
[0057] 实施例1:四种抑癌的microRNAs两两组合对T47D细胞的抑制率。
[005引T47D细胞使用PRIM1640培养基加5%FBS培养，放在细胞培养箱生长。传代时将细 胞稀释成50000个/ml,在96孔板中每个孔加入10化1。
[0059] 筛选的microRNA mimics药物（广州锐博生物科技有限公司）：miR145-5p mimic (micrON? hsa-miR-145-5p agomir)，miR125b-5p mimic(micr0N? hsa-miR-125b-5p agomir)，miR16-5p mimic(micr0N? hsa-miR-16b-5p agomir)，let-7a mimic(micr0N? hsa-let-7a-5p agomir),Negative control mimic( micrON某microRNAs mimic control)。
[0060] 处理浓度：50nmol microRNA mimic每孔，0.2山 Lipofectamine2000每孔，检测时 间7化。
[0061] 处理方式：将miR145-5p mimic、miR12f5b-5p mimic、miR16-5p mimic、let-7a mimic、四种microRNA mimicS单独组合或两两一组分别共转染T47D细胞，对照组用 Negative con化〇1 mimic等处理，检测处理72h后对T47D细胞的增殖的抑制率{抑制率= (1-实验组OD/对照组OD) X 100% }。
[0062] 图I-A(数据如表1所示)结果显示四种microRNAs单独作用T47D细胞抑制率。
[0063] 图I-B(数据如表2所示)显示miR145-5p mimic和miR16-5p mimic共转染组的抑制 率较预期高出最多，说明miR145-5p mimic和miR16-5p mimic具有最佳协同作用。（抑制率 预期为对应的两种microRNA mimic单独药物处理的抑制率之和）
[0064] 表 1
[00 化]
[0066]
[0067]表 2
[00681
[0069] 实施例2:MicroRNAs真核表达载体的构建
[0070] 准备材料:限制性内切酶Bgl n、BamHI、EcoRI;常规PCR体系;Annealing Buffer; 大肠杆菌扩增体系;W连接酶，连接缓冲液;凝胶电泳和成像系统;本发明使用的祀GFPC3载 体（Clontech公司，美国）是非病毒性哺乳动物细胞表达载体，启动子是CMV，载体大小 4727bp，载体标签:N-EGFP，载体抗性:卡那霉素，载体筛选标记:新霉素。多克隆位点(MCS) 是1328-14136口。原始载体如图2-4所示。
[0071] 本发明构建的所有载体，选择插入目的片段的酶切位点为多克隆位点(MCS)区的 Bgl n和EcoRI (原始载体1335bp和1360bp之间）；按图2-B所示将各个片段依次插入载体。 pEGFPC3-miR145/16，pEGFPC3-miR16/145，pEGFPC3-miR145 或祀 GFPC3-miR16 或 PEGFPC3-miRNC等载体的构建按图2-B所示将各个片段依次插入PEGFPC3。各插入片段由深圳华大基 因科技服务有限公司合成：
[0072] miR145-5p，其核巧酸序列如沈Q ID N0:1所示。
[0073] miR16-5p，其核巧酸序列如沈Q ID N0:2所示。
[0074] 11111?155-59的反义链，其核巧酸序列如沈9 10^:3所示。
[0075] 6bp间隔microRNAs的核酸序列，为限制性内切酶连接形成的序列。其核巧酸序列 如沈Q ID NO:4所示。
[0076] 短的POlyA序列，其核巧酸序列如SEQ ID NO: 5所示。
[0077] miRNC(无意链序列，即序列不祀向任何一个基因），其核巧酸序列如SEQ ID N0:6 所示。
[0078] 所有合成序列5'端加入Bgin，3'端Bgin和EcoRI。
[0079] 所有合成序列都是同时合成两条互补核巧酸双链。
[0080] 具体载体构建实验步骤：
[0081 ] 如图2-B所示，各个表达载体在EGFPC3质粒上的MCS区，从5 '端（Bgl n )到3 '端 化coRI)插入的外源核巧酸序列次序如下：
[0082] pEGFPC3-miR145依次插入的核巧酸序列为：SEQ ID N0:3+SEQ ID N0:1+SEQ ID N0:3+SEQ ID NO:5；
[0083] pEGFPC3-miR16依次插入的核巧酸序列为：SEQ ID N0:3+SEQ ID N0:2+SEQ ID N0:3+SEQ ID NO:5；
[0084] pEGFPC3-miRNC依次插入的核巧酸序列为：SEQIDN0:3+:沈QIDN0:6+:SEQID N0:3+SEQ ID NO:5；
[0085] 祀GFPC3-miR145/16依次插入核巧酸的序列为：SEQ ID N0:3+:沈Q ID N0:1+:SEQ ID N0:3+:沈Q ID N0:2+:沈Q ID N0:3+SEQ ID N0:5;
[0086] pEGFPC3-miR16/145依次插入核巧酸的序列为：SEQ ID N0:3+SEQ ID N0:2+沈Q ID N0:3+SEQ ID N0:1+SEQ ID N0:3+SEQ ID N0:5。
[0087] 所有表达载体每次插入一段新的核巧酸序列的实验方法步骤均如下面SI到S6所 述。
[008引Sl、取化g需要插入核巧酸序列的载体双酶切过夜：
[0089] 需要插入核昔酸序列的载体 1峭
[0090] S2、试剂盒（TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Code No. 9762)回收酶切产物，随后使用30iil灭菌水溶解吸附柱上的产物。
[0091] S3、按照前面说明的核巧酸序列插入顺序，将本次需要插入的核巧酸序列的两条 合成的互补链退火形成双链：
[0
[0
[0
[00巧]S5、转化、涂板:取S4产物扣1，Top 10感受态10化1，按照ToplO产品说明书转化感受 态细胞，转化完成后加入70化1 LB于37 °C摇床震荡45min，取涂布于培养皿，放37 °C生 化培养箱过夜。
[0096] S6、鉴定:取S5培养皿，挑取3个克隆，送测序，测序结果显示载体构建成功，将质粒 和菌液保种。
[0097] S7、按照图2所示的连接顺序，按照Sl到S6的操作顺序，依次将合成序列插入 祀GFPC3载体中，构建祀GFPC3-miR145/16，祀GFPC3-miR16/145，祀GFPC3-miR145，祀GFPC3-miR16 和祀 GFPC3-miRNC。
[009引 S8、将S6鉴定正确的5个目的质粒（如图2-C所示，pEGFPC3-miR145/16，PEGFPC3-miR16/145,祀GFPC3-miR145或祀GFPC3-miR16或祀GFPC3-miRNC)扩大培养，用去内毒素试 剂盒(PureLink? HiPure Plasmid DNA Purification Kits)纯化质粒，将纯化好的质粒浓 度调整为化g/yl。
[0099] 实施例3 :MTT增殖实验检测构建的载体对T47D细胞的增殖抑制。
[0100] T47D细胞使用PRIM1640培养基加5%FBS培养，放在细胞培养箱生长。传代时将细 胞稀释成50000个/ml，在96孔板中每个孔加入I(K)山；处理浓度：IOOng表达载体每孔，0. ^口(^6。1日11111162000每孔；检测时间：011、2地、4她、7211、9611。
[0101] 实验结果如图3(数据如表3所示)所示:祀GFPC3-miR145表达载体的抑制细胞增殖 的效果低于祀GFPC3-miR16表达载体。祀GFPC3-miR145/miR16表达载体的抑制率在72h的时 候具有显著效应。因此，pEGFPC3-miR145/miR16可W有效的抑制T47D乳腺癌细胞系的增殖。
[0102] 表3
[0103]
[0104] 实施例4:实时巧光定量PCR检测构建的质粒表达目的片段的效率。
[01化]T47D细胞培养条件：使用RPMI1640培养基加5 % FBS，置于37 r 5 % C〇2细胞培养箱 培养；细胞传代时种入6孔板，每孔10000个细胞，用1%FBS饥饿处理1天，分别转染各组 microRNAs表达载体或microRNA mimics，继续培养24h，用small RNA提取试剂盒提取总 RNA。
[0106] 实时巧光定量PCRUpplied Biosystems):反转录总RNA用量0.化g，染料采用SY服 Green^astStart Universal SYBR Green Master,Rox)。具体步骤如下：Sl、95°C15min解 开双链;S2、95 °C 15s变性;S3、60°C 25sec退火加延伸；S4、重复S2到S3共40个循环，伴随解链 数量分析。
[0107] MicroRNAs反转录与实时巧光定量引物根据文献给出的设计方法设计，核巧酸序 列如下：
[0108] miR145-5p 反转录引物：
[0109] GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAGGGATTC(沈Q ID N0:7)
[0110] miR16-5p反转录引物：
[0111] GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCGCCAATA(SEQ ID NO:8)
[0112] miRNC反转录引物：
[0113] GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTTTGTGCC(SEQ ID NO:9)
[0114] miR145-5p定量引物化rward:GTCCAGCTGGTCCAGTTTTCCCAGGA(SEQ ID N0:10)
[0115] miR16-5p定量引物化rwarcUGCGGCGGTAGCAGCACGTAAATAT(沈Q ID N0:11)
[0116] miRNC定量引物化rward:GATCC AATTACGATTAGCACTATCCCCAAGATCTG(SEQ ID NO: 12)
[0117] MicroRNA定量反向引物:GTGCAGGGTCCGAGGTATTC(沈Q ID N0:13)
[0118] 如图4-A(数据如表4所示)所示，检测转染表达载体后细胞内的目的microRNAs含 量，其中：miR145-5p和miR16-5p含量都升高，miR145-5p含量最高；从祀GFPC3-miR145/16和 祀GFPC3-miR16/145两个目的microRNAs位置互换的质粒中两个microRNAs分子的表达量来 看，不同插入位置对目的microRNAs的表达无影响(p〉0.5);加入miR155-5p的抑制剂，消减 了内源性miR155后，目的片段的表达大幅降低。
[0119] 表4 「01201
[0121] 图4-B(数据如图5所示）:miRNC含量的实时巧光定量PCR检测，实验方法如实施例4 中提到。定量结果显示加入一个22bp左右不祀向任何基因的miRNC短片段后，在miR155-5p 高表达的细胞中都有约460倍的表达效率。
[0122] 表5
[0125] W上实验结果显示，本载体的构建方式可W使插入的microRNAs不受位置影响高
[0123]
[0124] 效表达目的microRNAs ;在miR155-5p低表达的细胞中（正常细胞中），本载体的表达效率很 低。miR16-5p的实时巧光定量PCR检测出含量很少并不是质粒表达少，而是表达出的产物与 细胞内的祀基因结合后被大量降解。
[0126] 实施例5:实时巧光定量PCR检测转染质粒后4个预测祀基因的表达。
[0127] 细胞培养、种板、加药、收集、反转录W及定量的操作参照实施例4。实时巧光定量 PCR检测结果如图5(数据如表6所示）显示，转染构建的各种microRNAs表达质粒后，mRNA水 平上对切。1;[]1〇1(周期蛋白01)、(：-1]巧(3(>-1]巧(3禽骨髓细胞瘤病毒癌基因同源物）、化41/2 (细胞外信号调节激酶）基因都有抑制作用，但是单独转染pEGFPC3-miR145或PEGFPC3-miR16,或单独转染miR145-5p mimic或miR16-5p mimic都促进B化2(B细胞慢性淋己细胞白 血病/淋己瘤2)基因的mRNA的表达，然而在共转染miR145-5p和miR16-5p的mimic或 祀GFPC3-miR145/16后，B化2也被明显敲降，说明B化2有可能是Cyclin Dl、C-myc、化kl/2等 基因的补偿信号通路(backdoor)上的基因，而当miR145和miR16两个microRNAs分子同时作 用时，B化2运条补偿的信号通路也被抑制。结果说明，miR145-5p和miR16-5p可W协同抑制 乳腺癌T47D细胞系的BCL2基因的表达，从而抑制了 T47D细胞的增殖。
[012引 表6 [01291
[
[0131 ] 实施例6:Western blot检测预测祀基因的表达
[0132] T47D细胞使用PRIM1640培养基加 5%FBS培养，置于细胞培养箱生长。传代时将细 胞稀释成50000个/ml，在6孔板中每个孔加入1000 iil;处理浓度：1000 ng表达载体每孔， Lipofectamine2000每孔。加药处理4她后提取细胞总蛋白（全蛋白提取试剂盒KGP2100,凯 基生物）。然后用BCA法定量蛋白浓度，取50iig蛋白上样SDS-PAGE电泳。
[0133] 实验结果如图6-A，（数据如表7所示），图6-B显示，转染构建的各种microRNAs表达 质粒后，单独转染祀GFPC3-miR145或祀GFPC3-miR16对Cyclin Dl、C-myc、化kl/2、B化2蛋白 都没有明显抑制作用，但是在转染祀GFPC3-miR145/16后，切Clin Dl、C-myc、B化2蛋白都被 敲降，WBCL2蛋白最为明显，说明pEGFPC3-miR145/16联合表达载体能够同时表达两个 microRNAs，而当miR145和miR16两个microRNAs分子同时作用时，B(X2运个勒1分子受到最明 显抑制，另外S个预测祀分子的表达也受到抑制。结果说明，miR145-5p和miR16-5p可W协 同抑制乳腺癌T47D细胞系的BCL2等祀分子的表达，从而抑制了 T47D细胞的增殖。
[0134] 表7
[0135]
【主权项】
1. 一种核酸构建载体，其特征在于，其包括至少一种编码microRNAs的核酸分子，和一 种编码结合沉默复合物的核酸序列，和一种编码间隔microRNAs的核酸序列，和一种编码减 少通读现象的核酸序列;其中所述的核酸构建载体使得所述的mi croRNAs的核酸分子，和结 合沉默复合物的核酸序列，和间隔microRNA的核酸序列，和编码减少通读现象的核酸序列 能够共顺反子的表达。2. 根据权利要求1所述的核酸构建载体，其特征在于，所述的编码m i c r 〇 RN A s的核酸分 子是miR145-5p和miR16-5p，其核苷酸序列分别如SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2所示。3. 根据权利要求1所述的核酸构建载体，其特征在于，所述的一种编码结合沉默复合物 的核酸序列是miR155-5p的反义链，其核苷酸序列如SEQIDN0 :3所示。4. 根据权利要求1所述的核酸构建载体，其特征在于，所述的一种编码间隔microRNAs 的核酸序列是6bp的核酸序列，其核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示。5. 根据权利要求1所述的核酸构建载体，其特征在于，所述的一种编码减少通读现象的 核酸序列是一个短的polyA序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。6. 权利要求1-5中任一项所述的核酸构建载体用于制备抑制细胞增殖的组合物方面的 应用。7. -种重组载体，其含有权利要求1-6任一项所述的核酸序列。8. 根据权利要求7所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体包括编码microRNAs的 核酸分子，编码miR155_5p的反义链核酸序列，编码间隔mi croRNAs的核酸序列，编码减少通 读现象的核酸序列，并且编码mi croRNAs的核酸分子两边都是mi R155-5p反义链，编码 microRNAs的核酸分子与miR155_5p反义链之间由6bp间隔序列连接，所述编码microRNAs的 核酸分子包括miR145-5p和miR16-5p;其中所述重组载体使得所述编码microRNAs的核酸分 子能够共顺反子地表达。9. 一种真核联合表达载体pEGFPC3-miR145/16，其特征在于，所述载体同时表达两个成 熟的 111；[(31'〇1?嫩8核酸分子:11111?145-5。和11111?16-5卩。10. 权利要求9的重组载体在制备乳腺癌药物方面应用。
【文档编号】C12N15/85GK105861551SQ201610251107
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年4月21日
【发明人】曹新, 秦路洋, 魏钦俊, 姚俊, 鲁雅洁
【申请人】南京医科大学