专利名称：灵芝酸在制备癌转移抑制剂中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及灵芝酸的一种新用途，尤其涉及灵芝酸Me(Ganoderic acidMe)和灵芝酸T(Ganoderic acid T)在制备癌转移抑制剂中的应用。
背景技术：
癌细胞的浸润转移性是引起癌症患者死亡的主要原因，也是恶性肿瘤区别于良性肿瘤的重要标志，同时也是决定肿瘤患者预后的重要因素。抑制肿瘤细胞的转移是抗肿瘤治疗的重要组成部分。开发抗肿瘤细胞转移的药物对延长患者生存期、提高生活质量具有重要意义。癌细胞的浸润转移是一个极其复杂的动态过程，在转移过程中，癌细胞自身的移动能力起主要作用。因此，抑制肿瘤细胞的转移是开发抗肿瘤治疗药物的重要组成部分。
灵芝(Ganoderma lucidum)为担子菌纲、多孔菌科、灵芝属真菌，自古以来就是我国名贵药用真菌，具有抗肿瘤、降低血液中胆固醇含量、抗炎症等药效。现代医学研究发现灵芝中主要生理活性成分是灵芝多糖和灵芝酸。灵芝酸(Ganodenic acid)是一种三萜类物质，具有较强烈的药理活性。各种灵芝中已分离到的灵芝酸已达100多种，许多目前尚未鉴定其有效功能。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是公开灵芝酸在制备癌转移抑制剂中的应用，以满足临床应用的需要。
本发明所说的灵芝酸为灵芝酸Me(Ganoderic acid Me，缩写GA-Me)或灵芝酸T(Ganoderic acid T，缩写GA-T)。
发明人发现，灵芝真菌发酵提取物中纯化得到灵芝酸T和灵芝酸Me，小剂量即产生抑制肿瘤细胞转移的作用且具有剂量依赖性。因此可将它们作为治疗肿瘤转移的药物，应用于肿瘤的化学治疗中。
所说的小剂量指的是低于1～10mg/(公斤体重·天)的剂量，所说的大剂量指的是高于10～100mg/(公斤体重·天)的剂量。
本发明还涉及一种组合物，包括治疗有效量的芝酸Me或灵芝酸T和医药学上可接受的载体。
可以将灵芝酸Me或灵芝酸T与医药学上可接受的载体以组合物的形式，施加于需要治疗的患者，一般的剂量为1～100mg/(公斤体重·天)，具体可根据患者的年龄、病情等进行变化。
所说的载体是指药学领域常规的药物载体，如稀释剂、赋形剂如水等，填充剂，如淀粉、蔗糖等，粘合剂，如纤维素衍生物明胶、聚乙烯吡咯烷酮等，润滑剂，如滑石粉等。本发明的癌转移抑制物质，作为剂型通常能与不影响药理学作用的辅助料配合制成经口和非经口给药的制剂。
本发明的灵芝酸Me或灵芝酸T与上述载体构成的组合物，可以通过口服、鼻吸、静脉注射或皮下注射的形式施加于需要这种治疗的患者。
用于口服时，可以将其制备成为常规的片剂、粉剂或口服液；用于注射时，可以将其采用本领域常规的方法，制备成为注射液；本发明的灵芝酸Me或灵芝酸T的各种制剂，包括散剂，丸剂，片剂，胶囊剂等固型制剂，软膏，贴敷剂，注射剂等可以采用药学领域常规的方法进行制备；制剂中，灵芝酸Me或灵芝酸T的重量含量为0.1～99.9％，优选的含量为0.5～99.9％。
本发明提供的肿瘤转移治疗药物灵芝酸T和灵芝酸Me，低浓度情况下具有抑制肿瘤细胞转移的作用，而此时对于正常细胞的毒性作用并不强，因而可以发挥更进一步更大程度治疗肿瘤转移的效果。所说的低浓度指的是低于1～10mg/(公斤体重·天)的剂量。
所说的灵芝酸Me(GA-Me)或灵芝酸T(GA-T)分别由灵芝菌丝体发酵中提取，可采用文献(Chem.Pharm.Bull.，34(5)，2282-2285，1986；Agric.Biol.Chem.，51(2)，619-622，1987)公开的技术进行制备提取，纯度大于99％，其最先被分离鉴定于1983年(Tetrahedron Lett.，24(10)，1081-1084，1983)和1987年(Agric.Biol.Chem.，51(2)，619-622，1987)。
本发明的癌转移抑物质，低毒，适合于人和哺乳类动物经口和非经口给药。
本发明提供的肿瘤转移治疗药物灵芝酸T和灵芝酸Me，与传统的灵芝相比，因为有效成分明确，药理药效更有针对性。
所说的肿瘤为医学上所属的各类肿瘤，包括良性肿瘤和恶性肿瘤。而所说的恶性肿瘤包括恶性黑色素瘤，恶性淋巴瘤，消化器官的肿瘤(胃癌，肠癌，肝癌，胆囊癌，胆道癌，胰腺癌)，肺癌，乳癌，睾丸癌，卵巢癌，子宫癌，前列腺癌，上颚癌，舌癌，口腔癌，咽喉癌，甲状腺癌，脑部肿瘤，各类肉瘤，骨肉瘤，白血病，神经系统肿瘤，膀胱肿瘤，皮肤癌，皮肤附属器官癌和皮肤转移癌。
动物试验证明，本发明的癌转移抑制剂，低毒，适合于人和哺乳类动物经口或非经口给药。
本发明的显著的优点和技术上的进步本发明的癌转移抑制剂灵芝酸T和灵芝酸Me，在体外和体内实验中都能有效影响肿瘤的浸润转移能力。
本发明的癌转移抑制剂灵芝酸T和灵芝酸Me，是灵芝真菌发酵后由高效液相色谱法分离得到的纯品，与初步发酵产品相比，其化学性质更稳定，同时针对性也更强。
图1为灵芝酸对肿瘤细胞存活率的影响。
图2为灵芝酸对肿瘤细胞移动能力的影响。
图3为灵芝酸对肿瘤细胞粘附能力的影响。
图4为灵芝酸对荷瘤小鼠的瘤重抑制率(x±s)。
图5为灵芝酸Me和灵芝酸T对Lewis肺癌小鼠肺转移抑制作用(x±s)。
图6为GA-Me和GA-T对KB，HeLa和95-D肿瘤细胞以及HLF人正常细胞的毒性作用。
附图中，除另有说明外，1为灵芝酸Me，2为灵芝酸T。
具体实施例方式
实施例1灵芝酸T和灵芝酸Me对细胞生长抑制的试验将含有不同浓度的灵芝酸T和灵芝酸Me的培养液溶液加入事先接有相同细胞量的96孔板中，在培养箱中连续培养24h，用MTT法考察细胞的存活率，由此来研究灵芝酸T和灵芝酸Me对于各种细胞杀伤作用的强弱，并测定灵芝酸T和灵芝酸Me对细胞存活率产生半数抑制时的浓度(IC50)。
肿瘤细胞95D(人高转移性肺癌细胞)从图1可以看出，在经含有灵芝酸T和灵芝酸Me的培养液培养24h后，各肿瘤细胞的存活率明显下降，量效关系明。经过比较可以看出，灵芝酸T的IC50＝24.2μM，灵芝酸Me的IC50＝58.4μM，均能有效抑制95D的生长。
实施例2灵芝酸T和灵芝酸Me对癌细胞转移能力的抑制试验将处于对数生长期的肿瘤细胞接种于24孔培养板中，培养待细胞长成单片后，造一道划痕，用目镜测微尺测量划痕宽度后，每孔加入一定浓度的药物处理，每浓度平行4孔，对照组加等量体积的培养液，孵育24小时后，用目镜测微尺测量划痕宽度。实验重复三次，取平均值。
细胞迁移迁移的距离＝药物处理前的划痕宽度-药物处理后的划痕宽度结果如图2所示，随着灵芝酸浓度的增大，肿瘤细胞的移动能力逐渐被抑制。灵芝酸T对于95D半数有效浓度(EC50)为10.97μM。灵芝酸Me对于95D半数有效浓度(EC50)为40μM。这两个浓度都没有超过药物对于95D的IC50，可见，灵芝酸可针对性的抑制癌细胞的移动能力，并且这种效果是可剂量依赖性的。
实施例3灵芝酸T和灵芝酸Me对癌细胞黏附能力的抑制试验将Matrigel(人工基底膜胶)、LN、FN铺于96孔细胞培养板中，然后加入肿瘤细胞，经过一定时间孵育后，冲洗掉未粘附的细胞。粘附于板上的细胞数量用MTT方法测定的吸光值来反映。
从图3可以看出，随着灵芝酸浓度的增大，粘附的细胞比率减少，说明灵芝酸可以有效的抑制肿瘤细胞粘附到基底膜上的能力。灵芝酸T对于95D的半数有效浓度(EC50)分别为12.6μM，而灵芝酸Me对于95D半数有效浓度(EC50)为50μM。两种成分都能有效抑制肿瘤细胞的粘附能力，其中灵芝酸T比灵芝酸Me的效果更为明显。
实施例4灵芝酸T和灵芝酸Me体外对肿瘤转移能力的抑制通过Lewis肺癌动物模型的建立，观察灵芝酸对荷瘤动物肿瘤的抑制及抗癌细胞转移的作用。
从Lewis肺癌种鼠中无菌抽取肿瘤，无菌条件接种小鼠。小鼠为6周龄C57BL/6，雄性，于SPF动物房自由进食与饮水。
将接种后的小鼠随机分成6组肿瘤对照组按生理盐水0.5ml/只灌胃给药，图4和5中的3；阳性药物顺铂组(1mg/kg)，图4和5中的4；灵芝酸Me低剂量组(7mg/kg)，图4和5中的5，灵芝酸Me高剂量组(28mg/kg)，图4和5中的6；灵芝酸T低剂量组(7mg/kg)，图4和5中的7；灵芝酸T高剂量组(28mg/kg)，图4和5中的8；接种后72小时给药。用药第一、二日对阳性药物顺铂组(1mg/kg)进行腹腔注射0.1ml，其余灵芝酸组动物进行灌胃给药，每日一次，连续10天。第20天处死动物，摘取肿瘤，称量瘤重，固定肺组织，解剖显微镜下记数肺转移结节数。结果以均值±标准差(x±s)表示；差异显著性用配对t检验。与对照组比较，*p＜0.05，**p＜0.01。
从图4可知，分别在灵芝酸Me和灵芝酸T组中，对肿瘤的抑制随着灵芝酸浓度的增加而增加，并且灵芝酸Me高剂量和T高剂量组与肿瘤对照组有显著性差异(p＜0.05)。根据公式计算肿瘤抑制率肿瘤生长抑制率＝[(对照组平均瘤重-药物组平均瘤重)/对照组平均瘤重]×100％。结果表明灵芝酸Me高剂量和T高剂量组对于瘤重抑制率分别为43.23％和58.91％。上述结果表明灵芝酸Me和灵芝酸T可以抑制肿瘤的生长。
由图5可看出，与对照组相比，灵芝酸Me高剂量组和灵芝酸T高剂量组有显著性差异。根据公式计算转移抑制率转移抑制率＝(对照组肺转移数-药物组肺转移数)/对照组肺转移数×100％。小鼠服用灵芝酸T高剂量后，抗转移率达到73.68％。灵芝酸Me高剂量组的抗转移抑制率为54.89％。说明灵芝酸T可以有效抑制Lewis肺癌小鼠自发性转移，效果较为明显。
说明灵芝酸T和Me可以抑制肿瘤的生长，并能够抑制Lewis肺癌小鼠自发性转移。
实施例5将1重量份的GA-Me或GA-T与199份蒸馏水混合均匀，分装，即获得口服液。
实施例8将1重量份的GA-Me或GA-T与199重量份的注射用生理盐水混合均匀，即获得注射液。
实施例9采用噻唑蓝(MTT)快速比色法测定GA-Me和GA-T对KB，HeLa和95-D肿瘤细胞以及HLF人正常细胞的毒性作用。将对数生长期的各种细胞(106cell·ml-1)接种于96孔培养板，每孔0.2ml，分别加入50，100，150和200μg ml-1浓度的GA-Me和GA-T处理，每浓度平行4孔，对照组加等量体积的培养液，置37℃，5％CO2及饱和湿度的培养箱培养1-4天，实验终止前4小时每孔加入5mg·ml-1MTT 10μl，培养结束后每孔加入0.04N二甲基亚砜(DMSO)，每孔150μl，振荡10min，待MTT还原产物完全溶解，用BioRad 550型酶标仪，以550nm为实验波长，655nm为参照波长测定其吸收度，计算药物对细胞的抑制率，并以细胞的半数抑制浓度(IC50)作图。统计实验数据的结果如图6所示。
以上实施例说明，GA-Me和GA-T均对人体正常细胞株的毒性较小。
权利要求
1.灵芝酸在制备癌转移抑制剂中的应用，所说的灵芝酸为灵芝酸Me或灵芝酸T。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所说的肿瘤包括良性肿瘤或恶性肿瘤。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，而所说的恶性肿瘤包括恶性黑色素瘤、恶性淋巴瘤、消化器官的肿瘤、肺癌、乳癌、睾丸癌、卵巢癌、子宫癌、前列腺癌、上颚癌、舌癌、口腔癌、咽喉癌、甲状腺癌、脑部肿瘤、各类肉瘤、骨肉瘤、白血病、神经系统肿瘤、膀胱肿瘤、皮肤癌、皮肤附属器官癌或皮肤转移癌。
4.一种复合物，包括治疗有效量的权利1所述的灵芝酸Me或灵芝酸T和医药学上可接受的载体。
全文摘要
本发明公开的是以开发抑制癌细胞浸润转移为目的治疗药物，将灵芝中分离纯化获得的灵芝酸T(ganoderic acid T)和灵芝酸Me(ganoderic acid Me)应用于癌细胞浸润转移的治疗中。此两种分离纯化物，不仅能抑制肿瘤细胞增殖，同时具备有效抑制癌细胞浸润转移的作用。本发明提出该天然提取物可作为新型抗癌细胞浸润和转移的药物。
文档编号A61P35/04GK1823787SQ20051011230
公开日2006年8月30日 申请日期2005年12月29日 优先权日2005年12月29日
发明者钟建江, 刘建文, 沈莉芸, 陈年红, 王冠 申请人:华东理工大学, 上海颖兴生物科技有限公司