专利名称：Mtdh基因疫苗及其在制备乳腺癌生长抑制剂中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及MTDH基因疫苗，以及MTDH基因疫苗在制备乳腺癌生长抑制剂中的应用。
背景技术：
乳腺癌是女性中非常常见的癌症类型之一，据报道，其死亡率在所有肿瘤中为第一位。2009年，在美国约有192370人被诊断出患有乳腺癌，其中40170人死于乳腺癌[1]。 还有报道，超过40%的乳腺癌女性患者被诊断出肿瘤转移[2]。目前乳腺癌的治疗方案包括手术切除原发病灶，区域淋巴结清扫术，激素治疗以及放化疗等等。然而，即使手术成功的切除原发病灶并辅以化疗后，乳腺癌的复发率和死亡率仍然很高，研究分析认为可能是由于手术未能完全切除转移灶以及肿瘤对化疗药物产生耐药性等原因造成。因此，乳腺癌转移和化疗耐药性是导致乳腺癌发病和死亡的最主要原因。基于目前已有的治疗乳腺癌的手段及效果有限，本领域研究者认为迫切需要开发新的针对乳腺癌转移和耐药的治疗策略和药物。现有技术公开了基因疫苗(DNA vaccine)又称核酸疫苗或DNA疫苗，是将编码某种抗原的基因片段克隆到真核表达质粒，再用该质粒免疫动物，抗原编码基因在宿主体内表达后，刺激机体产生体液免疫和细胞免疫应答。基因疫苗最早是在小鼠肌肉组织内注射质粒DNA后，质粒及其携带的基因被小鼠肌细胞摄取，并在肌细胞内进行表达，小鼠可对此外源蛋白产生专一的免疫反应。之后基因疫苗受到了广泛的关注并且发展迅速。最近几年，基因疫苗在全世界范围内受到越来越多的重视，成为国内外研究的热点。与传统的抗癌免疫治疗相比，基因疫苗具有安全、有效、易制备、费用低廉、体内免疫记忆时间持久、保存运输便捷等优点。研究显示，肿瘤基因疫苗可通过激活T细胞和/或抗体介导的针对肿瘤自身抗原的免疫反应，从而抑制肿瘤的生长[3]。根据该机制，目前已开发出若干种针对肿瘤特异性抗原(tumor-specific antigens,TSA)或者肿瘤相关抗原(tumor-associated antigens, TAA)的基因疫苗[3]。基因疫苗载体表达的肿瘤抗原通常与免疫增强子偶联，通过选择不同的免疫增强子，帮助抗原激活不同类型的免疫反应。针对肿瘤的基因疫苗已经被报道对几类癌症有效，包括乳腺癌、黑色素瘤、肺癌、神经母细胞瘤等等W-7]，也有一些疫苗已进入临床试验阶段[3]，如针对黑色素瘤、结肠癌和前列腺癌的疫苗等等。然而，目前已知的许多潜在的肿瘤抗原，一般在正常细胞中都有表达。因此，通常针对这些抗原的基因疫苗在体内只能诱导很微弱的免疫反应，或者导致机体产生针对表达这些抗原的正常细胞的自身免疫反应。基于以上原因，肿瘤抗原的选择对开发抗肿瘤基因疫苗来说至关重要。MTDH(Metadherin)/AEG-I (Astrocyte Elevated Gene-1)是一种细胞膜表面蛋白。Brown等通过噬菌体扫描技术发现该基因，并且发现该基因带有肺定位区(Lung Homing Domain)，能够促进乳腺肿瘤的肺转移，如图1所示[8]。乳腺癌组织中高表达该种基因而且能够特异性的定植于肺，而体内预先应用MTDH抗体后，乳腺癌细胞肺转移灶显著减少，提示该基因在乳腺癌的肺转移中起着重要的作用。
与本发明相关的现有技术有如下参考文献1. Jemal A,Siegel R,Ward Ε,Hao Y,Xu J，Thun M J(2009)Cancer statistics, 2009. CA Cancer J Clin 59:225-2492.Berkowitz N,Gupta S,Silberman G(2000)Estimates of the lifetime direct costs of treatment for metastatic breast cancer. Value Health 3 :23-303. Rice J, Ottensmeier C H, Stevenson F K(2008)DNA vaccines :precision tools for activating effective immunity against cancer. Nat Rev Cancer 8 108-1204. Xiang R, Lode H N, Chao T H, Ruehlmann J M, Dolman C S, Rodriguez F, Whitton J L, Overwijk W W,Restifo N P, Reisfeld R A(2000)An autologous oral DNA vaccine protects against murine melanoma. Proc Natl Acad Sci U S A 97 :5492-54975. Luo Y, Zhou H, Mizutani M, Mizutani N, Reisfeld R A, Xiang R(2003) Transcription factor Fos-related antigen lis an effective target for a breast cancer vaccine. Proc Natl Acad Sci U S A 100 :8850-88556. Pertl U, Wodrich H, Ruehlmann J M, Gillies S D, Lode H N, Reisfeld R A (2003)Immunotherapy with a posttranscriptionally modified DNA vaccine induces complete protection against metastatic neuroblastoma. Blood 101 :649-6547. Xiang R, Mizutani N, Luo Y, Chiodoni C, Zhou H, Mizutani M, Ba Y, Becker J C,Reisfeld R A(2005)A DNA vaccine targeting survivin combines apoptosis with suppression of angiogenesis in lung tumor eradication. Cancer Res 65 :553-5618. Brown D M, Ruoslahti E(2004)Metadherin, a cell surface protein in breast tumors that mediates lung metastasis. Cancer Cell 5 :365-3749. Hu G, Wei Y, Kang Y (2009)The multifaceted role of MTDH/AEG-lin cancer progression. Clin Cancer Res 15 :5615-562010. Hu G，Chong R A,Yang Q, Wei Y, Blanco M A,Li F, Reiss M，Au J L, Haffty B G, Kang Y(2009)MTDH activation by 8q22genomic gain promotes chemoresistance and metastasis of poor-prognosis breast cancer. Cancer Cell 15 :9-2011. Yoo B K, Emdad L, Su Z Z, Villanueva A, Chiang D Y, Mukhopadhyay N D, Mills A S, Waxman S, Fisher R A, Llovet J M, Fisher P B, Sarkar D(2009)Astrocyte elevated gene-lregulates hepatocellular carcinoma development and progression. J Clin Investll9 :465-47712. Yu C, Chen K, Zheng H, Guo X，Jia W, Li M, Zeng M, Li J, Song L (2009) Overexpression of astrocyte elevated gene~l(AEG-I) is associated with esophageal squamous cell carcinoma(ESCC)progression and pathogenesis. Carcinogenesis30 894-90113. Liu H, Song X, Liu C, Xie L, Wei L, Sun R(2009) Knockdown of astrocyte elevated gene-linhibits proliferation and enhancing chemo-sensitivity to cisplatin or doxorubicin in neuroblastoma cells. J Exp Clin Cancer Res 28:1914. Kikuno N,Shiina H,Urakami S,Kawamoto K,Hirata H,Tanaka Y,Place R F,Pookot D,Majid S，Igawa M，Dahiya R(2007)Knockdown of astrocyte-elevated gene-1 inhibits prostate cancer progression through upregulation of F0X03a activity. Oncogene 26 :7647-765515.Emdad L, Sarkar D，Su Z Z, Randolph A, Boukerche H, Valerie K, Fisher P B (2006)Activation of the nuclear factor kappaB pathway by astrocyte elevated gene-1 implications for tumor progression and metastasis.Cancer Res 66 1509-151616. Lee S G，Su Z Z，Emdad L，Sarkar D，Fisher P B (2006) Astrocyte elevated gene-1(AEG-I) is a target gene of oncogenic Ha-ras requiring phosphatidyl inositol3-kinase and c-Myc. Proc Natl Acad Sci USA 103 17390-1739517. Lee S G，Su Z ZiEmdad L,Sarkar DiFranke T FiFisher P B (2008)Astrocyte elevated gene—lactivates cell survival pathways through PI3K_Akt signaling. Oncogene 27 :1114-112118. Sarkar DiPark E SiEmdad LiLee S G，Su Z Z，Fi sher P B (2008)Molecular basis of nuclear factor-kappaB activation by astrocyte elevated gene-1. Cancer Res68 :1478-148419. Darji A, Guzman C A, Gerstel B, Wachholz P, Timmis K N, Wehland J, Chakraborty T，Weiss S(1997)Oral somatic transgene vaccination using attenuated S. typhimurium. Cell 91:765-77520. Reisfeld R AiNiethammer A GiLuo YiXiang R(2004)DNA vaccines suppress tumor growth and metastases by the induction of anti-angiogenesis. Immunol Revl99 :181-19021.Xiang R，Luo Y，Niethammer A G，Reisfeld R A(2008)Oral DNA vaccines target the tumor vasculature and microenvironment and suppress tumor growth and metastasis. Immunol Rev 222 :117-12822. Luo Y，0，Hagan DiZhou H, Singh MiUlmer JiRei sfeld R A James Primus F， Xiang R(2003)Plasmid DNA encoding human carcinoembryonic antigen (CEA) adsorbed onto cationic microparticles induces protective immunity against colon cancer in CEA-transgenic mice. Vaccine 21 :1938-194723. Luo Y，Zhou HiMizutani MiMizutani NiLiu CiXiang R，Reisfeld R A(2005)A DNA vaccine targeting Fos-related antigen lenhanced by IL_18induces long-lived T—cell memory against tumor recurrence.Cancer Res 65:3419—342724. Luo Y，Zhou H，Krueger J，Kaplan C，Lee S H，Dolman C，Markowitz D，Wu W, Liu C，Reisfeld R A，Xiang R(2006)Targeting tumor-associated macrophages as a novel strategy against breast cancer. J Clin Invest 116 :2132-214125. Cefai D， Morrison B W， Sckell A， Favre L, Balli M， Leunig M， Gimmi C D (1999)Targeting HER-2/neu for active-specific immunotherapy in a mouse model of spontaneous breast cancer. Int J Cancer 83 :393-400
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发明内容
本发明的目的是提供一种抑制肿瘤，尤其是乳腺癌细胞生长的基因疫苗。具体涉及MTDH基因疫苗及其在制备乳腺癌生长抑制剂中的应用。目前已经有多种生物疗法用于乳腺癌的临床治疗，例如细胞疫苗[25]，重组蛋白疫苗[26]，细胞移植免疫治疗[27]以及基因疫苗[28]。费用低廉和体内记忆时间长是基因疫苗与其他生物疗法相比具有的明显优势。抗人乳头状瘤病毒基因疫苗Gardasil在2006 年被美国FDA批准。也有一些针对其他癌症的基因疫苗目前已经进入临床研究[3]。然而， 基因疫苗仍面临着诸如肿瘤特异性抗原的选择，有效佐剂的选择，免疫原性的提高以及体内所引起的副作用等等一系列的挑战。此外，疫苗通常应用于预防疾病，目前大多数肿瘤疫苗应用于临床治疗肿瘤患者尚未成功。因此，治疗型疫苗是将来基因疫苗的一个很有临床应用价值的研究方向。另外，肿瘤疫苗与化疗药物联合应用之前已有报道[29]。肿瘤的复发和对化疗药物的耐受是目前乳腺癌复发和死亡的重要原因。现在普遍认为，肿瘤干细胞是肿瘤复发与广泛耐药的重要原因之一。到目前为止，已经有一系列的肿瘤干细胞特异性标志物被鉴定出来。CD44+CD24-细胞亚群属于人乳腺癌的肿瘤干细胞 [30]。CD133+细胞亚群在人脑肿瘤中具有肿瘤干细胞的性质[31]。醛脱氢酶(ALDH)是参与干细胞自我保护的一类酶，也被认为属于肿瘤干细胞标记物，能够提高肿瘤细胞的化疗耐药性[32，33]。ALDH3A1编码的醛脱氢酶具有保护细胞免受氧化损伤和清除自由基的能力[34]。它已作为一种临床上确定肿瘤对环磷酰胺(在乳腺癌治疗中传统的化疗药物之一)的敏感性的重要指标[35]。胡国宏等人认为，MTDH上调ALDH3A1和MET在乳腺癌细胞中的表达；将ALDH3A1基因表达沉默后，能够抑制MTDH介导的耐药能力[10]。由于MTDH上调ALDH3A1的表达，而ALDH3A1是肿瘤干细胞的标志物，因此靶向MTDH可能可以消除癌症患者体内的肿瘤干细胞。2009年，胡国宏等人的结果表明，MTDH基因在乳腺癌转化、侵袭、转移和耐药等过程中具有重要作用，提示该基因是一个极有潜力的肿瘤治疗的靶点[9]。已经证实，MTDH基因在乳腺癌、前列腺癌、神经母细胞瘤、肝癌、食管鳞状细胞癌等肿瘤中高表达，并与其不良预后密切相关[10-14]。MTDH基因定位于人染色体8q22区，编码蛋白为582个氨基酸，富含赖氨酸和丝氨酸残基，翻译后可被其他蛋白修饰，如赖氨酸残基的乙酰化、泛素化修饰和丝氨酸、苏氨酸残基的磷酸化修饰。通过PII-Akt信号通路，原癌基因Ha-Ras能够增强MTDH 基因的表达，这种调节主要是通过GSK3 β的磷酸化失活而稳定c-Myc基因的表达并促进其结合到MTDH的启动子上而实现的(Hu et al.，Clinical Cancer Research，2009)。在此基础之上MTDH基因参与多条信号通路的调节，包括PII-Akt、NF- κ B、ffnt/ β -catenin等等信号通路，因而MTDH能够调控细胞增殖、细胞存活、细胞浸润以及增加细胞对化疗药物的耐受能力等[9，11，15-18]。NF-κ B通路的激活是通过MTDH蛋白与p65和转录激活因子 CBP的相互作用来实现的。MTDH通过增强MAPK家族的ERK和p38的活性，磷酸化GSK3 β 并稳定β-catenin，从而激活Wnt/β-catenin信号通路；同时，MTDH能够增强β-catenin 的转录辅助因子LEF-I的表达。另外，MTDH通过与一种未知内皮细胞受体相结合，增强肿瘤细胞粘附在内皮细胞上的能力，从而促进肿瘤的转移。而且，MTDH通过调控一系列下游耐药基因如ALDH3A1与MET，能够增强肿瘤细胞对化疗药物的耐药性。本发明提供了一种抑制肿瘤生长的基因疫苗，该基因疫苗表达细胞膜表面蛋白Metadherin。该基因疫苗含有Metadherin编码基因。MTDH(Metadherin)/ AEG-I (AstrocyteElevated Gene-I)是一种细胞膜表面蛋白。本发明的基因疫苗可以采用MTDH基因及其同源度70%以上具备且相同同功能的核酸序列。由于密码子的简并性，因此同源度85甚至70%以上的DNA序列会编码同样的多肽。例如，本发明的基因疫苗可以采用NCBI数据库中Gene ID 92140的序列。本发明的基因疫苗可以减毒沙门氏菌为减毒菌株载体。本发明开发了一种新的基因疫苗，通过口服携带有MTDH基因的减毒沙门氏菌 (Salmonellatyphimurium, danTand AroAO达到抑制乳腺癌转移的效果。该减毒沙门氏菌的dam—与AroA-基因突变，导致其毒性大大降低，利用它作为载体原核表达各种外源抗原已得到广泛的研究并取得良好的免疫效果，已成为新型疫苗的重要免疫介质之一。该减毒沙门氏菌通过口服免疫小鼠后，可通过肠上皮细胞屏障，定位于派伊尔淋巴集结(Peyer patches)中。通过减毒沙门氏菌介导的EGFP基因疫苗可以定位到小鼠派伊尔淋巴集结 (Peyer patches) 0小鼠口服免疫携带EGFP基因的沙门氏菌后，在派伊尔淋巴集结(Peyer patches)中可观察到绿色荧光(Reisfeld et al. , Immunological Reviews, 2004)。一般情况下，减毒沙门氏菌到达派伊尔淋巴集结后，聚集在此的(antigen presenting cells, APCs)吞噬侵入的沙门氏菌后被激活，活化的APC迁移至脾脏等淋巴组织，此时载体菌裂解，表达抗原基因的DNA载体进入胞液，然后进入抗原递呈细胞的细胞核，表达目的抗原。之后，特异的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphcocyte, CTL) 被激活，裂解表达抗原的抗原递呈细胞，抗原递呈细胞内的抗原激活辅助T细胞并诱导抗体反应，至此细胞免疫和体液免疫均被激活(Reisfeld et al.，Immunological Reviews, 2004)。此外，减毒沙门氏载体菌的成分如脂多糖和DNA疫苗载体上的免疫刺激序列还可作为佐剂加强免疫应答。另外有报道证实，选择泛素作为DNA疫苗载体上的免疫刺激序列时， 可以特异性地激活CD8+细胞毒性T淋巴细胞介导的免疫反应。实验结果表明，MTDH基因疫苗能够诱导机体产生⑶8+细胞毒性T淋巴细胞介导的针对乳腺癌的免疫反应。该疫苗不仅能有效预防乳腺癌肺转移，而且给已移植乳腺肿瘤的小鼠接种后，能够增强肿瘤对化疗药物阿霉素的敏感性；在该疫苗与化疗相结合治疗荷瘤小鼠后，可以显著延长小鼠的生存期。值得注意的是，MTDH基因在小鼠肝中高表达，因而 MTDH基因疫苗可能造成肝脏的损伤。然而众所周知，肝的再生能力很强，在末次免疫1周后，肝脏可能已经完成自我修复，所以没有观察到MTDH疫苗治疗组的小鼠肝脏较对照组相比有明显损伤。因此，MTDH基因疫苗有希望在将来可以作为预防和治疗乳腺癌的新的选择。综上所述，MTDH基因疫苗与化疗相结合可以作为预防和治疗乳腺癌的一种新的策略和手段。本发明提供了上述MTDH基因疫苗的制备方法，首先将Metadherin基因编码序列克隆到表达载体；然后，用重组表达载体转化减毒菌株，筛选获得所述的基因疫苗。具体操作方法可以采用本领域常规的操作或者按照实施例进行。所述的表达载体可以采用原核表达载体，例如pcDNA3. l/W3-MyC。所述的减毒菌株可以是减毒沙门氏菌株 S. typhimurium(dam-and AroA-) RE88。本发明的疫苗可用于制备抑制肿瘤生长药剂，尤其是针对乳腺癌及乳腺肿瘤的肺转移。本发明还提供了一种抑制肿瘤生长的组合物，该组合物包括上述MTDH基因疫苗和阿霉素。MTDH基因疫苗和阿霉素联用以抑制乳腺癌肺转移，也可以用于抑制乳腺肿瘤的生长，延长个体生存期。本发明提供了 MTDH基因疫苗，小鼠在预先接种MTDH基因疫苗后，能显著抑制4T1
8乳腺癌在原发部位的生长，并且能显著抑制肺转移；给荷瘤小鼠接种MTDH基因疫苗后，可以增强肿瘤对阿霉素的药物敏感性，从而抑制肿瘤的生长以及肺转移，并能提高化疗后小鼠的存活时间。综上所述，本发明提供了一种通过口服免疫的MTDH基因疫苗，并检测其抑制乳腺癌转移的效果。该疫苗可激活CD8+细胞毒性T细胞对表达MTDH抗原的乳腺癌细胞4T1的免疫反应。而且，MTDH基因疫苗在预先接种后，能抑制乳腺肿瘤的生长和肺转移。更重要的是，MTDH基因疫苗与阿霉素联用后，能抑制乳腺肿瘤的肺转移，起到治疗的效果，并能延长荷瘤小鼠的寿命。因此，免疫疗法与化学疗法相结合可以为改进目前乳腺癌的治疗方法提供新的思路与途径。
图1 :MTDH的肺定位序列。图2-图3 :MTDH基因在小鼠各器官和小鼠乳腺癌细胞系4T1中的表达谱分析。图 2:蛋白免疫印迹分析MTDH基因在小鼠器官和4T1细胞中的表达谱(上)，β-actin作为内参对照(下)。图3:实时定量PCR分析MTDH基因在小鼠器官和4T1细胞中的表达谱，与图 2相对应。图4-图5 :MTDH基因疫苗载体的构建及其蛋白表达情况的检测。图4:以 pcDNA3. l/W3-MyC载体作为MTDH基因疫苗表达载体的图谱。图5 :MTDH疫苗质粒转染 HEK293T细胞后，裂解细胞，通过抗c-myc的抗体免疫印迹检测MTDH表达情况。图6-图8 :MTDH基因疫苗在预防接种后对4T1乳腺肿瘤的生长与肺转移具有抑制作用。雌性BALB/c小鼠(6-8周龄)分为两组(n = 6)，每隔一周用IO8的pW^-MTDH或者 PUb疫苗口服免疫，一共免疫3次。第3次免疫结束一个星期后，给小鼠乳房的脂肪垫内注射104T1乳腺癌细胞，诱发乳腺癌自发性肺转移。接种观天后，处死实验组和对照组小鼠， 取肺，统计肿瘤细胞肺转移的节点数目。图6:实验操作流程图。图7:原位肿瘤重量统计， 以克为单位。图8 对两组小鼠肺转移节点的数目统计结果。图9-图12 :MTDH基因疫苗与阿霉素联合使用能够增强阿霉素对4T1荷瘤小鼠的乳腺癌肺转移的疗效。雌性BALB/c小鼠(6-8周龄)随机分为4个实验组(n = 6)，将 1054Τ1细胞接种到雌性BALB/c小鼠的脂肪垫内，记为第0天。之后，小鼠于第3、7、11天分别口服沙门氏菌疫苗免疫3次；于第4、8、12天按5毫克/公斤体重的剂量尾静脉注射阿霉素；第13天切除乳腺原位肿瘤。第37天处死小鼠，统计乳腺癌肺转移的节点数目。图9: 实验操作流程图。图10 小鼠原位肿瘤切除后的重量统计。图11 各组老鼠的肺标本照片。 图12 对各组小鼠肺转移节点的数目统计的结果。图13-图14 :MTDH基因疫苗与阿霉素联合使用可以延长4T1荷瘤小鼠的寿命。雌性BALB/c小鼠(6-8周龄)随机分为4个实验组(n = 6)，将ΙΟΜΤΙ细胞接种到雌性BALB/c 小鼠的脂肪垫内，记为第0天。之后，小鼠于第3、7、11天分别口服沙门氏菌疫苗免疫3次； 于第4、8、12天按5毫克/公斤体重的剂量尾静脉注射阿霉素；第13天切除乳腺原位肿瘤。 图13 实验操作流程图。图14 各组小鼠生存曲线统计(*P < 0. 05)。图15-19 =MTDH基因疫苗通过⑶8+的细胞毒性T细胞介导抗肿瘤免疫反应。图 15 :MTDH疫苗免疫小鼠分离出的脾细胞与对照组相比可以显著裂解4T1细胞。图16 抗⑶4抗体预孵育后，T细胞的细胞毒性未受明显影响。图17 抗CD8抗体预孵育后显著抑制了 T 细胞对4T1细胞的细胞毒性作用。图18 抗CD8抗体检测原发肿瘤内CD8+T细胞的浸润情况。图19 =TUNEL染色检测细胞毒性T细胞诱导的原位肿瘤细胞凋亡。图20 :MTDH基因疫苗在小鼠体内没有引起明显的副作用。雌性BALB/c小鼠用 PUb-MTDH或者pWd疫苗免疫3次。第3次免疫结束1周后，取出小鼠下列组织和器官，包括心脏(a)，小肠(b)，肾(c)，肝脏(d)肺(e)和脾脏(f)，用石蜡包埋，切片后做苏木素-伊红(H組)染色。
具体实施例方式实施例1材料与方法一、动物、细菌株与细胞系来源6-8周雌性BALB/c小鼠购于上海实验动物中心。小鼠的饲养依据上海交通大学医学院关于实验动物使用的准则操作。减毒沙门氏菌株(Salmonella typhimurium, dam^and AroAO RE88 和小鼠 4T1 乳腺癌细胞系由 Ralph A. Reisfeld 教授(The Scripps Research Institute, La Jolla, CA)惠贝曾。二、细胞培养小鼠乳腺癌细胞系4T1用RMPI-1640培养基(HyClone，Logan，UT)添加10%胎牛血清(HyClone)，100 单位 / 毫升青霉素和 100ug/mL 链霉素(Invitrogen, Carlsbad, CA) 培养。人胚胎肾细胞系HEK293T用DMEM(HyClone)添加10%胎牛血清，青霉素和链霉素在 37°C,5% CO2培养箱中培养。三、基因疫苗载体构建、蛋白表达验证编码全长小鼠MTDH基因的质粒由Erkki Ruoslahti教授(The Burnham Institute, La Jolla, CA)惠赠。将该基因按PCR方法扩增后，克隆到pcDNA3. 1/Ub-Myc载体中W，7]，空载体作为对照。将该表达MTDH蛋白的疫苗质粒转染HEK293T细胞，收细胞蛋白做蛋白免疫印迹分析，用抗c-myc标签的抗体(Beyotime，Haimen, Jiangsu，China)检测 MTDH 蛋白表达情况，以 β-actin(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)作为内参对照。四、减毒沙门氏菌的转化按文献报道的方法，将基因疫苗质粒电转化到减毒沙门氏菌株 S. typhimurium (dam-and AroA-) RE88 中[4，5]。具体步骤如下(1)从长有沙门氏菌的LB板上挑单克隆，接到:3ml LB培养基中，37°C，250rpm培养至对数生长期。(2)用冰的 ddH20 洗 2 次，用 200ul ddH20 重悬。(3)取IOOul菌与2ug DNA混合后转入电转杯，冰上10分钟。(4)电转2. 5kV, 25uF, 200 Ω。(5)加200ul培养基，37°C复苏30分钟，涂板培养。五、预防模式疫苗与肿瘤接种在预防模式中，雌性BALB/c小鼠(6_8周龄)分为两个实验组(n = 6)，每隔一周用IO8带有pWD-MTDH或者PWD质粒的减毒沙门氏菌疫苗灌胃，一共免疫3次。第3次免疫结束一个星期后，给所有小鼠乳房的脂肪垫内接种1054T1乳腺癌细胞，诱发乳腺癌自发性肺转移。接种观天后，处死实验组和对照组小鼠，取肺，用波恩氏溶液(Bouin's solution) 浸泡，之后在解剖显微镜下统计肿瘤细胞肺转移的节点数目。波恩氏溶液配制方法苦味酸饱和水溶液75ml ；福尔马林(40%甲醛)25ml ；冰醋酸5ml。六、治疗模式肿瘤与疫苗接种以及化疗药物联合使用在治疗模式中，雌性BALB/c小鼠随机分为4个实验组(n = 14)，然后将10 !!细胞接种到所有小鼠的脂肪垫内，记为第0天。之后，小鼠于第3、7、11天分别口服沙门氏菌疫苗免疫3次；于第4、8、12天按5毫克/公斤体重的剂量尾静脉注射阿霉素；第13天切除乳腺原位肿瘤。第37天，每组处死6只小鼠，统计乳腺癌肺转移的节点数目；统计其余小鼠 (每组8只)的生存时间。七、制备小鼠脾细胞(1)雌性BALB/c小鼠(6_8周龄)分为两个实验组，每隔一周用IO8带有pWD-MTDH 或者pWD质粒的减毒沙门氏菌疫苗灌胃，一共免疫3次。(2)第3次免疫结束五天后，尾静脉注射4T1细胞以进一步激活免疫系统。(3)颈椎脱位处死小鼠，置70%乙醇中浸泡5分钟，取脾脏剪碎。(4)70ym cell strainer置于含RPMI-1640的平皿中，用注射器芯研磨脾，至脾呈白色絮状，RPMI-1640冲洗过滤的脾细胞，收集细胞悬液于无菌离心管中，1500rpm，离心10 分钟。(5)用RPMI-1640洗1次，再用Iml红细胞裂解液重悬，室温1分钟。(6)加入10倍以上体积的RPMI-1640，混勻，1500rpm离心10分钟，弃上清，共洗3次。(7)用 RMPI-1640 培养基(HyClone)添加 10 % 胎牛血清(HyClone)，100 单位 / 毫升青霉素、100ug/mL链霉素(Invitrogen)和100活力单位/毫升白细胞介素-2 (R&D Systems, Inc. , Minneapolis, MN)培养。(8)同时，细胞培养皿底面铺有用毫升丝裂霉素C(Roche Applied Science,Mannheim,Germany)预处理20分钟的4T1细胞，与分离出的脾细胞在37°C，含5% 二氧化碳的培养箱共培养5天。八、T细胞毒性检测按文献所述[22]，用CytoToxe%非放射性细胞毒性检测试剂盒(ftOmega，Madi son, WI)检测脾细胞对4T1细胞的细胞毒性，具体操作步骤如下(1) 96孔分析板设置(IOOul/孔)
权利要求
1.一种MTDH基因疫苗，其特征在于，该基因疫苗表达细胞膜表面蛋白Metadherin。
2.如权利要求1所述的基因疫苗，其特征在于，该基因疫苗含有Metadherin编码基因。
3.如权利要求1所述的基因疫苗，其特征在于，该基因疫苗以减毒沙门氏菌为减毒菌株载体。
4.权利要求1所述基因疫苗的制备方法，其特征在于，其包括步骤首先将Metadherin 基因编码序列克隆到表达载体；然后，用重组表达载体转化减毒菌株，筛选获得权利要求1 所述的基因疫苗。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述的减毒菌株是减毒沙门氏菌株 S. typhimurium(dam-and AroA-)RE88。
6.权利要求1所述基因疫苗在制备乳腺肿瘤生长抑制剂中的应用。
7 权利要求1所述基因疫苗在制备乳腺肿瘤肺转移抑制剂中的应用。
8.一种抑制肿瘤生长的组合物，其特征在于，该组合物包括权利要求1所述的基因疫苗和阿霉素。
9.权利要求8所述的组合物在制备抑制乳腺癌肺转移药物中的应用。
10.权利要求8所述的组合物在制备抑制乳腺肿瘤的生长药物中的应用。
全文摘要
本发明属于生物技术领域，涉及一种抑制肿瘤生长的基因疫苗。该基因疫苗表达细胞膜表面蛋白Metadherin，称为MTDH基因疫苗。该疫苗通过口服免疫，可激活CD8+细胞毒性T细胞对表达MTDH抗原的乳腺癌细胞4T1的免疫反应。而且，MTDH基因疫苗能抑制乳腺肿瘤的生长和肺转移。而且，MTDH基因疫苗与阿霉素联用后，能增强阿霉素抑制乳腺肿瘤生长和肺转移的作用，并能延长荷瘤小鼠的寿命。更重要的是，MTDH基因疫苗对机体主要器官没有明显损伤。因此，本发明为改进目前乳腺癌的治疗方法提供新的途径。
文档编号A61K31/704GK102335437SQ20101023309
公开日2012年2月1日 申请日期2010年7月21日 优先权日2010年7月21日
发明者朱晗, 郭方 申请人:上海宜诺迪生物科技有限公司