专利名称：刺激促生长素抑制素和胰岛素产生的化合物的筛选方法
背景技术：
发明领域本发明涉及生物化学内分泌学、分子生物学和蛋白质化学。更具体地，本发明涉及测定刺激促生长素抑制素和胰岛素产生的化合物的方法。
相关技术描述葡萄糖的体内稳态需要多种神经内分泌系统的协同作用。然而，胰岛被认为是哺乳动物体内主要的“葡萄糖感受器”。胰岛包含四种细胞，它们被称为前胰岛素原(primansulin)、胰高血糖素、促生长素抑制素或胰多肽。其中产生胰岛素的β细胞占主要地位。血清中葡萄糖的增加刺激了胰岛素的分泌和产生，而该步骤可使某些组织随后吸收葡萄糖。因此，β细胞的功能异常或破坏将导致血清葡萄糖含量的升高，最终导致糖尿病。
遗传连锁分析表明遗传因子对获得糖尿病的易感性有很大影响。例如，至少18个基因座与胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)有一定的关联。一个称为IDDM2的疾病感受型基因座包括人的胰岛素基因，并与胰岛素启动子功能的改变的转录调节有关。因此，调节胰岛素基因表达步骤的破坏将部分导致糖尿病原性疾病。与这种假设一致的是，β细胞功能的损失是糖尿病的一个非常普遍的特征。
非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)被认为是外界影响和复杂的遗传影响两者共同的结果。令人感兴趣的是，胰岛素基因座本身的等位基因变异与糖尿病有关。这些变异表现出含有正常的胰岛素基因，但是表现出改变了与转录调节有关的性质。
调查表明有多达2千万的美国人患有II型糖尿病。疾病的发展需要环境因素和某些还未被充分鉴定的可能使II型糖尿病有外周胰岛素抗性的糖尿病易感性基因(diabetes susceptibility gene)，在II型糖尿病中组织就不能响应胰岛素信号来适当地利用葡萄糖。或者，在这些患者中，遗传因子可能是造成产生胰岛素的胰β细胞的葡萄糖易感性减少的原因。这两种生理状态的最终结果是显著的高血糖，而高血糖是糖尿病的主要特征。
胰岛素基因的转录调控是通过与细胞特异性的、对葡萄糖敏感的信号分子相互作用的短区域侧翼DNA来实现的。尽管已经普遍认为含有碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)和同源异型域的因子是控制β细胞特异性表达胰岛素的转录机理的关键成分，但是该调节组织的确切特征仍然知之甚少。对胰岛有特异性的碱性螺旋-环-螺旋复合体与近侧的分别称为Nir、IEB1或ICE的E-框(E-box)相互作用；该元件存在于鼠的胰岛素I基因中，但在鼠胰岛素II和人胰岛素基因中只出现一次。
在产胰岛素的细胞系中的瞬时测定(transient assay)表明，与E框结合的因子可与对β细胞有特异性的蛋白质发生协同作用，该蛋白质与邻近的称作FLAT的富含AT的序列结合，FLAT则具有与同源异型域识别序列的特征。与FLAT结合的因子包括Isl-1、lmx-1、cdx-3和STF-1。此外，其中的后者与称作P元件的进化上保守而富含AT的序列有首要的结合活性。Isl-1与FLAT元件的结合很弱，而且用产胰岛素的细胞抽提物检测时，似乎不存在于结合FLAT的复合体中。现有的数据支持了Isl-1在神经生长中所起的更重要的作用。同源异型域因子lmx-3和cdx-3在异源细胞中有令人感兴趣的胰岛素启动子功能的反式激活性质，但是它们在β-细胞内的细胞分布和与FLAT结合的活性仍是不清楚的。另外，直接表明这些因子在β细胞系中的功能的数据也很少。
在有与胰岛素启动子结合活性的因子组中，STF-1可能是最有前途的胰岛素启动子功能的真正调控器。在小鼠中，于胚胎期8.5天在形成胰脏的原基细胞核中首先检测到有STF-1，略早于该区域内最早测到有胰岛素表达之前。随后通过内分泌胰的生长，STF-1和胰岛素大量共表达。另外，在产胰岛素细胞系的抽提物中，STF-1是当胰岛素启动子中同时有FLAT和P元件时有内源DNA结合活性的成分。STF-1也与与E-框结合的因子Pan-1(估计可从与FLAT结合的因子中获得)有强的协同作用。然而，DNA结合测定法表明，来自β细胞抽提物的其它未知因子也对检测到的FLAT结合活性有较大的贡献。FLAT介导的胰岛素启动活性是否需要全部这些检测到的种类、或仅仅需要一个亚型(subset)仍是不清楚的。
成熟的胰脏包括内分泌和外分泌两种成分，它们被认为是从生长的肠的普通前体细胞中产生的。该前体细胞表达出称作STF-1(14，20)(或IPF-1(19)，IDX(17)或X1Hbox 8(22))的同源异型域蛋白，其重要性在“剔除”研究中有所描述，“剔除”研究是指寻靶破坏STF-1基因将导致胰的先天性缺失。尽管STF-1最初是由生长的胰的内分泌细胞和外分泌细胞表达的，但是STF-1的产生逐渐局限于产生胰岛素和促生长素抑制素的胰岛细胞(7)。在这些细胞中，STF-1的作用对于维持促生长素抑制素和胰岛素基因的高水平表达显得很重要(14，17，19，20，22)。
STF-1可识别两种确切的胰岛素启动子上的称作FLAT和P的胰岛特异性元件。当与这些位点结合时，STF-1与E47协同刺激胰岛素的转录，E47是可识别两种称作Far和Nir的E基因框元件的螺旋-环-螺旋蛋白质。同样的，STF-1通过两个胰岛特异性元件(称为TSEI和TSEII)来调控胰岛细胞中促生长素抑制素的表达(14，17)。
除了对某些基因有转录刺激作用，发现同源异型域蛋白质如STF-1在确定细胞或节段身份(segmental identity)的研究中有重要作用。与它们在体内的特异性和显著的活性相反，许多同源异型域蛋白质在体外表现出较低的与重叠DNA结合的特异性。然而，目前的研究暗示，某些蛋白质辅因子可作为体内同源异型域DNA结合特异性的决定簇(8，13)。例如在果蝇属中，外小齿(extradenticle)(exd)可调节同源异型蛋白质的活性而不改变它们的表达方式(21，24)。另外，外小齿表现出通过增强某些同源异型域蛋白质的DNA结合特异性lai促进靶基因的选择(2，25)。实际上，外小齿在脊椎动物中是高度保守的，其与人原癌基因Pbxl有71％的延伸序列相同(23)。
已有技术缺少有效的增强同源异型域蛋白如STF-1的结合的方法。本发明满足了该领域中这一长期存在的需要。
发明概述许多同源异型域蛋白表现出可通过刺激特异靶基因的转录来调节细胞生长。与它们在体内的显著活性相比，许多同源异型域蛋白在体外与蛋白质靶部位的结合是无特异性的，这表明有识别靶部位选择性的辅因子参与。一种辅因子称为外小齿(exd)，它可通过与某些同源异型域蛋白协同结合到靶调节元件上来影响果蝇属中的节段形态发生(segmental morphogensis)。本发明证明了STF-1(一种哺乳动物中胰生长所需要的孤独同源异型域蛋白)通过与Pbx(哺乳动物中外小齿的同源物)协同结合到DNA上来刺激胰岛激素基因促生长素抑制素的转录。与Pbx的协同结合需要五肽基序(pentapeptide motif)(FPWMK)，它在同源异型域蛋白的亚型中是高度保守的。FPMWK基序不足以使其它同源异型域蛋白具有Pbx协同性，然而，STF-1同源异型域的N末端臂也是必须的。当与Pbx的协同结合发生在仅一个潜在STF-1靶部位亚型上时，本发明表现出Pbx可通过和STF-1形成异二聚复合体来选择性识别胰生长中的靶基因。实际上，本发明证明了促生长素抑制素启动子的TSEII元件可识别胰岛细胞中的由STF-1和Pbx组成的异二聚复合体。因此，胰中STF-1作用的特异性部分受潜在靶启动子部位识别STF-1 Pbx异二聚复合体的能力的支配。
因此，本发明的一个方面是提供了一种DNA结合测定法来测定对于促进STF-1与STF-1接合部位的结合有效的化合物，其步骤包括使有末端标记的、有STF-1结合位点的双链DNA与STF-1一起混合，作为第一容器中的对照；使末端标记的、有STF-1结合位点的双链DNA与STF-1和测定化合物一起混合，作为第二容器中的样品；培育所述第一和第二容器；将所述对照和所述样品上样于电泳凝胶；对所述电泳凝胶施加一定电流以使所述对照和所述样品在所述凝胶中迁移；检测所述对照和所述样品；比较所述对照和所述样品的迁移，其中如果所述样品的迁移比所述对照慢，则所述测定的化合物是有效地促进了STF-1与所述STF-1结合位点的结合。
本发明的另一方面是提供了一种DNA结合测定法来测定可有效促进STF-1与STF-1接合部位的结合的化合物，步骤包括将组成型表达STF-1的第一表达质粒和在STF-1结合位点控制下表达受体基因的第二表达质粒转染入合适的细胞系中；将第三质粒转染入所述转染合适细胞系中，所述第三表达质粒可表达测定(trest)化合物；测定所述受体基因的转录量，其中如果所述转录发生，则所述测定化合物可有效促进STF-1与所述STF-1结合位点的结合。
本发明的其它方面、特征和优点可从下面公开给出的本发明的较佳实施例的描述中明显获得。
附图简述为使上述的本发明的特征、优点和目的被详细了解，本发明以上概述的详细描述可参照一些结合附图来描述的实施例。这些附图是说明书的一部分。然而，应当注意的是，附图描述了本发明的较佳实施例，因此它不能被认为是限制了它们的范围。
图1表示胰的同源异型框因子STF-1与遍在核因子一起协同结合到促生长素抑制素启动子中的细胞特异性调节元件上。图1A显示了胰岛Tu-6细胞的粗核抽提物用促生长素抑制素TSEII从-303延伸至-281的双链寡核苷酸进行的凝胶移位分析。其中指出了C1、C2和C3是蛋白质DNA复合体。渐增的条带表明核抽提物的量的增加。STF，只有重组STF-1蛋白质；Tu-6 Ne和Hela NE分别指Tu-6和Hela细胞的核抽提物。PI指预免疫抗血清。STF-1 Ab指抗STF-1蛋白质的C末端部分产生的抗血清。STF-1 Ab+Oct寡核苷酸指STF-1抗血清加上SV40的Oct1结合位点(Sph1基序)。Oct.Ab指抗Oct.1蛋白质产生的单克隆Oct 1抗血清(W.Herr赠与)。图1B显示了用如下所述的促生长素抑制素TSEII和Tu6核抽提物制得的复合体(预先与未标记的Oct1寡核苷酸培育，以只对C1和C2复合体分析)的解离速率(off-rate)分析。复合体C1和C2如图所示。每条泳道均显示了在加入1000倍过量的未标记TSEII竞争剂DNA后的时间(分钟表示)。PI指预免疫的血清；STF-1 Ab指加入凝胶移动测定中的STF-1抗血清。图1C显示了重组STF-1蛋白质的凝胶移位分析，其中用促生长素抑制素TES II寡核苷酸作为探针。STF-1结合活性在没有(-)或有(+)Jurkat细胞的异源核抽提物(用Western印迹法检测，不含可检测水平量的STF-1蛋白质)下测定。渐增条带表明重组STF-1蛋白质的量的增加。复合体C1和C2如图所述。图1D显示了含有重组STF-1加上Jurkat核抽提物的重建抽提物中复合体C1和C2的解离速率。每条泳道均显示了在加入未标记TSE II竞争剂(1000倍过量)后的时间点(分钟表示)。
图2表示遍在同源异型框蛋白质Pbx与STF-1在促生长素抑制素TSEII元件上形成异二聚复合体。图2A显示了用TSE II寡核苷酸作为探针对Tu6 NE的凝胶移位分析。复合体C1、C2和C3如图所示。PBX Ab指反应中包含的Pbx抗血清。PI指预免疫血清。STF-1 Ab指STF-1抗血清。图2B显示了体外翻译的Pbx蛋白质(PBX)对于STF-1结合活性的影响。如每条泳道中所示，凝胶移位分析采用TSE II寡核苷酸加上STF-1和/或Pbx。TNT指对照的裂解液。图2C显示了PBX使STF-1与TSEII复合体的结合稳定。STF-1和STF-1 Pbx复合体的解离速率分析用促生长素抑制素TSE II寡核苷酸作为探针。加入过量未标记TSE II寡核苷酸后的时间(分钟表示)如图所示。如图所述，复合体C1和C2分别与STF-1单体和STF-1/PBX异二聚体对应。图2D显示在促生长素抑制素和胰岛素启动子序列上STF-1/Pbx异二聚体的形成的分析结果。TSEII指野生型TSE II寡核苷酸。图3D和3E显示了M1、M2和M3以及突变型TSEII寡核苷酸(TAAT基序发生突变)。P和FLAT是可高度亲和识别STF-1的胰岛素I元件。TSEI是与STF-1结合的促生长素抑制素启动子元件。PBX指加入结合反应中的体外翻译PBX蛋白；STF指全长重组STF-1蛋白质。图2E显示了图3B的凝胶移位分析中采用的野生型和突变型寡核苷酸。连括号表示诱变寻靶的共有序列TAAT基序。图2F显示了STF-1和Pbx协同作用在启动子位点的亚型上。每条线条下指出了用STF-1和E2A-Pbx效应质粒进行的GC细胞瞬时转染测定法。线条框图显示了从受体构建物获得的萤光素酶活性，受体构建物包括含有单个的最小生长激素(GH)的启动子(Luc)，两个拷贝的GH启动子上游的促生长素抑制素TSEII元件(TSEII-Luc)、或两个拷贝的胰岛素P元件(P-Luc)。使活性标准化以共转染入RSV-CAT对照质粒中。
图3表示STF-1中保守的五肽基序对于与Pbx的协同结合是关键的。图3A显示了野生型和截短重组的STF-1多肽形成的STF-1单体(复合体C1)和STF-1/Pbx异二聚体(复合体C2)的分析结果。每条泳道中指出了突变的STF-1多肽中缺失端点。例如，D1-70指出STF-1多肽缺少残基1-70。Hox140-215指STF-1的同源异型域多肽。图3B显示上述凝胶移位测定中所用的构建物的示意图。H.D.指STF-1同源异型域(氨基酸残基140-215)。全长STF-1蛋白质从氨基酸残基1延伸至284。图3C显示保守的五肽基序的诱变破坏了与有所示氨基酸数目的野生型和突变型STF-1蛋白质的Pbx序列协同性。图3D显示了单独的以及与体外翻译PBX或E.Jurkat核抽提物组合使用的野生型(WT)和突变型(MUT)STF蛋白的凝胶移位分析。
图4表示STF-1内的五肽基序(其对于STF-1与Pbx在促生长素抑制素TSEII位点上形成异二聚体是必须的)在多个同源异型框蛋白中是保守的。不同的同源异型框蛋白根据种类来分类并根据名字排列。对于每种蛋白质，与STF-1中基序对应的序列以单字母氨基酸码表示，右侧显示了N端至同源异型域的距离。
图5表示与PBX相互作用的保守基序(Pim)对于促进PBX和同源异型框蛋白质间的协同结合是必须的，但量不足。图5A显示了下面凝胶移位测定中所用的重组GST-融合蛋白质的示意图。Isl1 H.D.指Isl1因子lim域的同源异型域。PBX相互作用基序-Isl1 H.D.指含有融合入Isl1同源异型域的STF-1 PBX相互作用基序区(氨基酸残基110-138)的STF-1-Isl1融合蛋白。cdx3 H.D.指胰同源异型框蛋白cdx3的同源异型域(氨基酸残基143-253)。PBX相互作用基序-cdx3指含有与cdx3同源异型域(氨基酸176-253)融合的STF-1 PBX相互作用基序区(氨基酸110-138)的融合蛋白。PBX相互作用基序-STF-1指含有与STF-1同源异型域(氨基酸残基140-215)融合的PBX相互作用基序区(110-138)的STF-1多肽。STF-1 H.D.指单独STF-1同源异型域而没有PBX相互作用基序区。图5B显示了用促生长素抑制素TSEII位点作为32P标记的探针进行的凝胶移位测定。-和+表示没有或含有用PBX RNA控制的网织红细胞裂解液。每条泳道显示了用同源异型域融合蛋白测得的PBX协同性。单体和异二聚复合体如标记所示。
图6表示STF-1同源异型域的N末端臂是与Pbx协同性所必需的。其显示了PBX相互作用基序-cdx3融合构建物的凝胶移位分析结果，该构建物含有STF-1PBX相互作用基序(氨基酸残基110-138)以及STF-1同源异型域的各个被cdx3的同源异型域取代的区域。图6A显示了STF-1/cdx3融合构建物的结构和活性。cdx3的序列为阴影部分，而STF-1的序列为白色部分。并指出了N末端臂(N)和Helices 1，2和3(H1，H2，H3)的相对位置。凝胶移位测定中与Pbx的协同结合在右侧表示成(+，-)。图6B显示了STF-1和cdx3(显示在下面)同源异型域的氨基酸排列，右侧显示了C端残基的氨基酸数。破折号表示STF-1和cdx3间的氨基酸身份。箭头所指地方是用于融合构建物的氨基酸端点(I，II，III)。图6C显示了重组的STF-1/cdx3融合蛋白的凝胶移位测定结果。构建物数字指上面示意图中所述的构建物。如图所示，体外翻译的Pbx(PBX)或未控制的网织红细胞裂解液(TNT)存在于结合反应中。C1、C2复合体分别与STF-1单体和Pbx/STF-1异二聚体对应。
发明详述人的基因组含有四簇称为Hox基因的同源异型选择者基因，它们是胚胎发育中轴体模式形成(axial body pattern formation)的关键决定簇(Krumlauf，1994，Cell78191-201)。四个簇各含有多达13个基因，而一个簇中的一个给定基因通常与其它三个家族中的一个有高度的同源性。这种对应的基因称为共生同源基因(paralog)；因此HoxA1，HoxB1，HoxC1和HoxD1均是紧密对应的共生同源基因，而每个在不同的簇的不同的染色体上。例如，HoxB复合体位于染色体17的长臂上，且HoxB1至HoxB9已被鉴定。
胰岛素基因的葡萄糖依赖性调控随着胰岛素分泌中葡萄糖介导的增加而产生。这可以部分地源于胞间钙的增加。另外，响应葡萄糖的胰岛素启动子功能可至少部分地通过调节FLAT结合蛋白的活性来产生。HoxB13与胰岛素启动子的有重要功能的FLAT元件高亲和性地结合。此外，HoxB13和胰岛素ICE/Nir元件-结合因子Pan-1在组合加入时大大地激活了胰岛素启动子。这与FLAT和Nir元件协同作用于产生胰岛素的细胞的结果是一致的。这些收集数据表明，钙依赖性信号途径可调节HoxB13的功能。
根据本发明，可采用常规的分子生物学、微生物学和重组DNA技术领域中的已有技术。这些技术在文献中有充分描述。例如见Maniatis，Fritsh&Sambrook，“分子克隆实验手册(Molecular CloningA Laboratory Manual(1982)；“DNA克隆实践方法(DNA CloningA Practical approach)，”第I和II卷(D.N.Glover ed.1985)；“寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)”(M.J.Gait ed.1984)；“核酸杂交(Nucleic Acid Hybridiation)”[B.D.Hames&S.J.Higgins eds.(1985)]；“转录和翻译(Transcription and Translation)”[B.D.Hames&S.J.Higgins eds.(1984)]；“动物细胞培养(Animal Cell Culture)”[R.I.Freshney，ed.(1986)]；“固定化细胞和酶(Immobilized Cells And Enzymes)”[IRL Press，(1986)]；B.Perbal，“分子克隆指导(A Practical Guide To Molecular Cloning)”(1984)。
因此，如果在这里出现，下述术语应有下列定义。
这里所述的氨基酸最好是“L”异构型的。然而，“D”异构型的残基可代替任何L-氨基酸残基，只要多肽保留有与免疫球蛋白结合的所需功能性质。NH2指多肽的氨基末端存在的游离氨基基团。COOH指存在于多肽的羧基末端的游离的羧基基团。为与标准的多肽术语(J Biol.Chem.，2433552-59(1969))保持一致，下面的对应表显示了氨基酸残基的缩写对应表符号 氨基酸1个字母 3个字母Y Tyr 酪氨酸G Gly 甘氨酸F Phe 苯丙氨酸M Met 甲硫氨酸A Ala 丙氨酸S Ser 丝氨酸I Ile 异亮氨酸L Leu 亮氨酸T Thr 苏氨酸V Val 缬氨酸P Pro 脯氨酸K Lys 赖氨酸H His 组氨酸Q Gln 谷氨酰胺E Glu 谷氨酸W Trp 色氨酸R Arg 精氨酸D Asp 天冬氨酸N Asn 天冬酰胺C Cys 半胱氨酸应当注意，所有的氨基酸残基序列在这里以式子表示，其从左到右是按常规的氨基端到羧基端的方向排列的。而且，应当注意，氨基酸残基序列的开始或结尾处的破折号表示与另一有一个或多个氨基酸残基的序列相连的肽键。上述表格与这里出现的三个字母和一个字母的记号对应。
“复制子”是任何在体内有自动复制DNA功能的遗传元件(如质粒、染色体、病毒)，即在其控制下能够进行复制。
“载体”是一种复制子，如质粒、噬菌体或粘粒，另一个DNA片段可与其连接从而来复制所连着的片段。
“DNA分子”指单链或双链螺旋型的脱氧核苷(腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或胞嘧啶)的聚合体形式。该术语仅仅指分子的一级和二级结构，不局限于任何特定的三级结构。因此，该术语包括所发现的双链DNA、inter alia、线性DNA分子(如限制片段)、病毒、质粒和染色体。在讨论这里的结构时，根据常规只给出了沿DNA非转录链(即有与mRNA相同序列的链)的5′到3′的序列。
“复制起点”指参与DNA合成的DNA序列。
DNA“编码序列”指在合适的调节序列控制下在体内转录并翻译成多肽的双链DNA。编码序列的界限是5′端(相当蛋白质的氨基端)的起始密码子和3′端(相当蛋白质的羧基端)的翻译终止密码子。编码序列包括(但不局限于)原核细胞序列、来自真核细胞mRNA的cDNA甚至是合成的DNA序列。聚腺苷酸信号和转录终止序列通常位于编码序列的3′端。
控制转录和翻译的序列是DNA调控序列，如启动子、增强子、聚腺苷酸信号、终止子等，它们可提供宿主细胞中的编码序列的表达。
“启动子序列”是可以与细胞中RNA聚合酶结合并引发下游(3′方向)编码序列转录的DNA调控区。为详细说明本发明，启动子序列的3′端与转录起始部位连接，其上游(5′方向)延伸包括在上述背景下引发可检测水平的转录所需的最小数量的碱基或元件。在启动子序列中会发现有转录起始位点(常规情况下用核酸酶S1作图来确定)，还有与RNA聚合酶结合的蛋白质结合区域(共有序列)。真核生物启动子通常(但不总是)含有“TATA”框和“CAT”框。原核生物启动子除-10和-35共有序列外还含有SD序列。
“表达控制序列”是控制并调节另一DNA序列转录和翻译的DNA序列。当RNA聚合酶将编码序列转录成mRNA时，编码序列是处于转录和翻译控制序列的“控制”下，然后mRNA被翻译成由编码序列编码的蛋白质。
“信号序列”可以包括编码序列之前的部分。该序列编码信号肽，即多肽的N末端，其与宿主细胞联系并使多肽到达细胞表面或分泌入基质，该信号肽在蛋白质离开细胞前被宿主细胞切下。信号序列可与多种原核和真核生物天然蛋白质关联。
术语“寡核苷酸”在这里指本发明的探针，其被定义为包括两个或多个核糖核苷酸的分子，最好超过三个。其确切大小与许多因素有关，而这些因素反过来与寡核苷酸的最终功能和用途有关。
术语“引物”在这里指一种寡核苷酸，无论其是天然存在于纯化的限制性消化物中或是合成的，当在诱导引物延伸产物的合成(与核酸链互补)的条件下，即在有核苷酸、诱导剂如DNA聚合酶和合适的温度pH下，它可作为合成的引发点。引物可以是单链或双链的，且必须有足够的长度，以在诱导剂存在时引发合成所需的延伸产物。引物的确切长度依赖于许多因素，其包括温度、引物来源及其使用方法。例如，对于诊断应用，根据靶序列的复杂性，寡核苷酸引物通常含有15-25或更多的核苷酸，尽管它可含有较少的核苷酸。
这里的引物的选择应“基本上”与特定靶DNA序列的不同链互补。这意味着引物必须足够互补来与它们各自的链杂交。因此，引物序列不需要反映模板的确切序列。例如，非互补的核苷酸片段可与引物的5′端连接，而引物序列的其余部分与链互补。或者，非互补的碱基或更长的序列可散布在引物中，只要引物序列与序列有足够的互补性或与其杂交，从而制成延伸产物的合成模板。
如这里所用的，术语“限制性内切核酸酶”和“限制性酶”均指在特异性核苷酸序列处或附近切开双链DNA的细菌酶。
当这种DNA被引入细胞内，细胞就被外源或异源DNA“转化”。转化的DNA可以或不必整合(共价连接)入细胞的基因组。例如在原核生物、酵母和哺乳动物细胞中，转化DNA可以维持在如质粒那样的附加型元件中。对于真核细胞，稳定转化的细胞中转化的DNA已整合入染色体中，这样就能通过染色体的复制遗传给子代细胞。这一稳定性是由真核细胞建立的由一群含有转化DNA的子代细胞组成的细胞系或克隆系的能力来证明。“克隆系”是一群从单个细胞或单一祖细胞(monnon ancestor)通过有丝分裂获得。“细胞系”是可以在体外稳定生长许多代的原始细胞的克隆系。
当DNA序列确定长度内至少约75％(较佳至少约80％，最佳至少约90或95％)的核苷酸相同时，两个DNA序列是“基本上同源的”。基本上同源的序列可通过用标准软件比较序列来鉴定，其中序列从序列数据库或Southern杂交实验在例如该特定系统确定的严格条件下获得。确定的合适杂交条件是该领域已知的。例如见Maniatis等人，同上；DNA Cloning，Vols.I&II，同上；Nucleic AcidHybridization，同上。
DNA构建物的“异源”区是在较大DNA分子中可鉴别的DNA片段，其在自然界中没有发现与较大分子连接。因此，当异源区编码哺乳动物基因时，基因通常被DNA侧接(flank)，而该DNA不与源有机物基因组中的哺乳动物基因组DNA侧接。在另一个例子中，编码序列是一个构建物，其中的编码序列在自然界中没有发现(如含有内含子的基因组编码序列cDNA，或含有与天然基因不同的密码子的合成序列)。等位变异或天然发生的突变不会产生这里定义的DNA异源区。
这些研究中最常用的标记是放射性元素、酶、暴露在紫外光下时产生荧光的化学物质等。许多荧光性物质是已知的，并可用作标记。它们包括例如荧光素、若丹明、金胺、得克萨斯红(Texas Red)、AMCA蓝和Lucifer黄。特别的检测物是在山羊中制备的与荧光素通过异硫氰酸酯共轭的抗兔抗体。
蛋白质也可用放射性元素或酶来作标记。放射性标记可用任何现有的计量方法来检测。较佳的同位素可选自3H、14C、32P、35S、36Cl、51Cr、31Co、58Co、59Fe、90Y、125I、131I和186Re。
同样可使用酶标记，其可用任何现在采用的比色法、分光法、荧光分光光度法、电流分析法或气体计量法技术来检测。酶通过与桥接分子如碳化二亚胺、二异氰酸酯、戊二醛等反应来共轭连接到选择的颗粒上。可用于这些步骤的许多酶是已知的并可被采用。较佳的是过氧化物酶、β-葡糖醛酸酶、β-D-葡糖苷酶、β-D-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖氧化酶加上过氧化物酶和碱性磷酸酶。美国专利No.3,654,090，3,850,752和4,016,043公开了不同标记物和方法的实施例。
该领域研究出并采用的特别测定系统是受体测定法。在受体测定法中，对待测物作适当的标记，然后对某种细胞测试菌落用一定量的标记接种，然后进行结合研究以测定标记物与细胞受体的结合情况。通过这种方法就可确定物体间的亲和性差别。
该领域已知的有用的测定方法是“顺/反”测定法。简单的说，该测定法采用了两种基因构建物，一种通常是在转染入合适细胞系后可连续表达感兴趣的特定受体的质粒，第二种是在受体/配体复合体的控制下表达报道分子如萤光素酶的质粒。因此，例如，如果要评价一种作为特定受体的配体的化合物，一种质粒应是一种导致受体在所选细胞系中表达的构建物，而第二种质粒应有与萤光素酶基因连接的启动子，而萤光素酶基因中插入有特定受体的效应元件。如果待测化合物是受体的刺激物时，配体将与受体复合，得到的复合体与效应元件结合并启动萤光素酶基因的转录。然后光计量测定得到的化学发光值，获得剂量效应曲线并与已知的配体比较。前述的过程在美国专利No.4,981,784和PCT国际
发明者M·R·蒙特米尼, B·皮尔斯 申请人:研究发展基金会