专利名称：诊断或治疗性促生长素抑制素或铃蟾肽类似物的连接物及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及促生长素抑制素和铃蟾肽类似物及其用途，用于导向于在检测、诊断或治疗疾病中有用的化合物。
背景技术：
包括癌症的标准治疗在内的许多治疗的毒副作用，事实上限制了可给患者施用的试剂的用量。另外，许多试剂引起器官-特异的毒性，从而进一步限制了可送递到靶组织的剂量。例如，许多氨茴环霉素家族成员的心脏毒性降低了这组化学治疗剂可获得的最大治疗剂量。各种可检测或治疗剂的定向药物送递可降低在正常组织内的毒性，并通过在特定的组织提供浓缩的局部效果，从而增加治疗的功效。
促生长素抑制素、铃蟾肽或其它生物活性肽类似物已用于检测对肽特异的过表达受体的肿瘤细胞(参见，例如Denzler and Reubi，Cancer85(1)188-198，1999)。促生长素抑制素、铃蟾肽和许多其它生物活性肽拮抗剂类似物在结合到它们的受体上之后快速内化(Lukinius等，Acta Onc.38383-387，1999；Morel，Biochem.Pharmacol.47(1)63-76，1994)。肽类似物的这种内化可导致向细胞核的转运(Chen等，Am.J.Physiol.Renal Physiol.279F440-F448，2000；Hornick等，J.Nucl.Med.41(7)1256-1263，2000；Janson等，J.Nucl.Med.41(9)1514-1518，2000)。
促生长素抑制素类似物结合在特定的正常或患病组织表面上存在的特定铃蟾肽受体亚型。促生长素抑制素受体常常以亚型特异的方式在包括炎性肠病、类风湿关节炎、各类肿瘤和供应许多肿瘤的血管在内的特定患病组织中上调(Denzler and Reubi，Cancer，85188-198，1999；Plonowski等，Cancer Res.60(11)2996-3001，2000；Kahan等，Int.J.Cancer82(4)592-598，1999；Gulec等，Surg.Res.97(2)131-137，2001)。类似地，对另一生物活性肽特异的受体，物质P，可在各种疾病中上调(Id.)。已发现与促生长素抑制素有关的硬骨鱼紧张肽II肽受体在许多神经肿瘤上表达(Takahashi等，Peptides221175-1179，2001)。GnRH II配体/类似物的受体已位于令人感兴趣的许多周围组织上，其中包括乳腺、前列腺和胃肠道(Neil等，Biochem.Biophys.Res.Commun.2821012-1019；Millar等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA98963609641，2001)。
已表征了至少5种促生长素抑制素受体亚型，肿瘤可表达各种受体亚型(Shaer等，Int.J.Cancer70530-537，1997)。天然存在的促生长素抑制素及其类似物对这些受体亚型显示出不同的结合，从而允许肽类似物精确地导向于特定的患病组织。
许多化合物如细胞毒性剂的物理和化学性能使它们难以连接到生物活性肽上。试剂或药物可降低肽类似物的结合的特异性或生物活性，从而限制它作为导向剂的效力。另外，治疗和细胞毒性剂可具有引起降低溶解度和促进药物-肽类似物在某些器官累积的化学性能，从而增加了毒性并降低了效力。需要有效的方式将细胞毒性剂连接到导向剂如促生长素抑制素、铃蟾肽或另一生物活性肽上，并在维持各组分活性的同时，降低细胞毒性剂的非定向摄取，从而使治疗效果最大化和使毒性最小化。
此外，尽管碘化和砹化(参见Vaidyanathan等，Nucl.Med.Biol.27(4)329-337，2000)在用于成像和在可能辅助治疗与对生物活性肽特异的因子的表达增加有关的疾病方面具有巨大的希望，但存在的问题是现在可获得的标记许多肽类似物的方法存在问题。放射性卤素如碘具有巨大的潜力作为肿瘤成像和细胞毒性剂。有潜力的同位素包括125I(K.S.Sastry，Am.Assoc.Phys.Med.191361-1370，1992；Mariano，J.Nucl.Med.41(9)1519-1521，2000)，131I(Wheldon等，Radiother，Oncol.，2191-99，1991)，123I(Blower等，Eur.J.Nucl.Med.25101-108，1998；Janson等，J.Nuc.Med.41(9)1514-1518，2000；Mariani等，J.Nuc.Med.41(9)1519-1521，2000)，和124I(Glaser等，J.Labelled Compd.Radiopharm.44(6)465-480，2001)。存在与放射性碘原子加入到肽中有关的数个问题(Bakker等，Eur.J.Nucl.Med.23(7)775-781，1996)。一个问题是因特异脱碘酶导致碘从L-Tyr残基中快速损失(Kawai等，Nucl.Med.Biol.17(4)369-76，1990)。另一问题是因碘添加到肽试剂内产生的疏水性的大大增加，这与在肝脏内放射性的增加累积有关，从而干扰了肿瘤的成像和促使严重的毒性。进一步的问题是当碘化靠近药效基团(pharmacophore)的酪氨酸时，结合亲和力的损失。需要能促进标记各种生物活性肽，同时在体内不有害累积的接头。
发明概述本发明的特征在于通过接头连接(oconjugate)到化合物上的生物活性肽，如促生长素抑制素或铃蟾肽，该接头允许保留肽的生物活性。这种肽试剂用于将治疗剂、细胞毒性剂、可检测标记物导向于细胞，如表达促生长素抑制素或铃蟾肽受体的癌细胞。
第一方面，本发明的特征在于下式的肽试剂X-Y-Z-Q其中X任选地选自细胞毒性剂、治疗剂、可检测的标记物或螯合基团；Y是增加肽试剂生物分布的肽、含连接X的接头的亲水聚合物，或省去；Q是生物活性肽，如促生长素抑制素或铃蟾肽，且Z是连接肽，当在Q的N-端或相容侧链氨基处键合到Q上时，它保持至少50％Q的生物活性。Z具有下式A-B-C-E-F，其中A是D-Lys、D-Tyr、D-Ser或L-Ser，或省去；B是D-Lys或D-Tyr，或省去；C是Lys、Ser、hSer、Thr、Nle、Abu、Nva、(2，3或4)3-吡啶基-Ala(Pal)、Orn、Dab、Dap、4-NH2-Phe、D-4-OH-Pro或L-4-OH-Pro，或省去；E是D-Lys、D-Tyr、D-Ser、D-4-OH-Pro、L-4-OH-Pro、3-碘-D-Tyr、3，5-二碘-D-Tyr、3-砹-D-Tyr、3，5-二砹-D-Tyr、3-溴-D-Tyr、3，5-二溴-D-Tyr、D-Asn、L-Asn、D-Asp、L-Asp、D-Glu、L-Glu、D-Gln或L-Gln；且F是D-Lys、D-Tyr、D-Ser、L-Ser、D-4-OH-Pro、L-4-OH-Pro、3-碘-D-Tyr、3，5-二碘-D-Tyr、3-砹-D-Tyr、3，5-二砹-D-Tyr、3-溴-D-Tyr、3，5-二溴-D-Tyr、D-Asn、L-Asn、D-Asp、L-Asp、D-Glu、L-Glu、D-Gln或L-Gln；条件是若A、B、C和E分别是Tyr、Tyr、Lys和Tyr，则F不是Lys；若A、B、C和E分别是Lys、Tyr、Lys和Tyr，则F不是Tyr或Lys；若省去A和B，且C与E分别是Lys和Tyr，则F不是Tyr或Lys。
在第二个相关的方面中，本发明的特征在于具有下式的肽试剂X-Y-Z-Q其中X是细胞毒性剂或治疗剂；Y是增加肽试剂亲水分布的肽、含连接X的接头的亲水聚合物，或省去；Q是具有生物活性的肽；且Z是连接肽，当在Q的N-端或相容侧链氨基处键合到Q上时，它保持至少50％Q的生物活性，其中Z具有下式A-B-C-E-F其中A是D-Lys、D-Tyr、D-Ser或L-Ser，或省去；B是D-Lys或D-Tyr，或省去；C是Lys、Ser、hSer、Thr、Nle、Abu、Nva、(2，3或4)3-吡啶基-Ala(Pal)、Orn、Dab、Dap、4-NH2-Phe、D-4-OH-Pro或L-4-OH-Pro，或省去；E是D-Lys、D-Tyr、D-Ser、D-4-OH-Pro、L-4-OH-Pro、3-碘-D-Tyr、3，5-二碘-D-Tyr、3-砹-D-Tyr、3，5-二砹-D-Tyr、3-溴-D-Tyr、3，5-二溴-D-Tyr、D-Asn、L-Asn、D-Asp、L-Asp、D-Glu、L-Glu、D-Gln或L-Gln；且F是D-Lys、D-Tyr、D-Ser、L-Ser、D-4-OH-Pro、L-4-OH-Pro、3-碘-D-Tyr、3，5-二碘-D-Tyr、3-砹-D-Tyr、3，5-二砹-D-Tyr、3-溴-D-Tyr、3，5-二溴-D-Tyr、D-Asn、L-Asn、D-Asp、L-Asp、D-Glu、L-Glu、D-Gln或L-Gln；条件是若A、B、C和E分别是Tyr、Tyr、Lys和Tyr，则F不是Lys；且若A、B、C和E分别是Lys、Tyr、Lys和Tyr，则F不是Tyr或Lys；且若省去A和B，且C与E分别是Lys和Tyr，则F不是Tyr或Lys。Z肽接头因此可以是长度为2、3、4或5个残基。
在本发明第一和第二方面的一个实施方案中，X是一种或多种细胞毒性剂。优选X是抗代谢剂，细胞毒性剂可选自阿霉素、甲氨蝶呤、喜树碱、高喜树碱、rhizoxins、dolistatins、紫杉醇、combretastatin和maytansinoids或其衍生物或类似物。例如，细胞毒性剂甲氨蝶呤可通过接头Z或Y-Z连接到肽类似物上，从而形成本发明的肽试剂。优选的细胞毒性剂是rhizoxin、rhizoxin-D、喜树碱、及其活性类似物、高喜树碱、安丝菌素P-3、dolistatins、epothilones、combretastatins和combretastatin A-4。
在其它优选的实施方案中，连接肽Z是D-Ser-Nle-D-Ser-D-Ser、D-Ser-Lys-D-Ser-D-Ser、D-Ser-Lys-D-Tyr-D-Tyr、D-Ser-Lys-D-Tyr-D-Ser、D-Ser-Ser-D-Lys-D-Ser、D-Ser-Ser-D-Lys-Ser、D-Ser-Nle-D-Tyr-D-Ser、D-Ser-Pal-D-Tyr-D-Ser、D-Ser-Thr-D-Tyr-D-Ser、Lys-D-Ser-D-Ser、Ser-D-Lys-D-Ser、Ser-D-Lys-Ser、Nle-D-Tyr-D-Ser、Lys-D-Tyr-D-Ser、Pal-D-Lys-D-Ser、Thr-D-Tyr-D-Ser、D-Ser-D-Lys、D-Ser-D-Tyr、D-Lys-D-Lys、D-Lys-D-Tyr或D-Tyr-D-Lys。
在本发明的第三方面中，肽试剂具有下式X-Y-Z-Q其中X是螯合基团，或省去；Y是增加肽试剂亲水生物分布的肽、含连接X的接头的亲水聚合物，或省去；Q是具有生物活性的肽；且Z是连接肽，当在Q的N-端或相容侧链氨基处连接到Q上时，它保持至少50％Q的生物活性。在本发明的这一方面中，Z具有下式C-E-F，其中C是Lys、Orn、Dab、Dap、4-NH2-Phe、Nle、Ser、hSer、Abu、Nva、D-4-OH-Pro或L-4-OH-Pro，或省去；且E与F各自独立地选自D-Lys、D-Tyr、D-Ser、D-4-OH-Pro、L-4-OH-Pro、3-碘-DTyr、3，5-二碘-D-Tyr、3-溴-D-Tyr、3，5-二溴-D-Tyr、D-Asn、D-Asp、L-Asp、D-Glu或L-Glu；且若C和E分别是Lys和D-Tyr，则F不是D-Tyr或D-Lys。
在第三方面的可供替代的实施方案中，本发明的肽试剂被直接或间接连接到可检测的标记物上。可检测的标记物优选为键合到该试剂的氨基酸残基上的放射性试剂，如放射性标记的碘、砹或溴。或者，X可以是螯合基团，可例如含有Lu、In、Y或Sm的同位素，或可省去X。若省去X，则Y可以被低级(lower)乙酰化、琥珀酰化、马来酰化或富马酰化。
在第三方面的多个实施方案中，本发明的特征在于肽试剂，其中Z是Lys-D-Tyr-D-Ser、Lys-D-Ser-D-Ser或Nle-D-Tyr-D-Ser。
在本发明第三方面的另一实施方案中，Z的长度可以是3个氨基酸。Z优选下式的肽试剂C-E-F其中C选自以上列举的氨基酸，E是D-Tyr且F是D-Ser。或者，Z可以是Lys-D-Tyr-D-Ser、Lys-D-Ser-D-Ser或Nle-D-Tyr-D-Ser。
在本发明第三方面的另一实施方案中，本发明的特征在于组合物，其中Z具有下式C-E-F其中C选自Lys、Orn、Dab、Dap、4-NH2-Phe、Nle、Ser、hSer、Abu、Nva、D-4-OH-Pro和L-4-OH-Pro，或省去；E是D-Tyr；且F是D-Ser。
在本发明的第一、第二、第三方面中，Y可以是肽序列，它增加生物活性肽连接物的亲水生物分布。例如，在优选的实施方案中，Y具有式U(V-V)n，其中U是D-Pro、L-Pro、D-4-OH-Pro、L-4-OH-Pro、肌氨酸、Lys、Orn、Dab、Dap、4-NH2-Phe或(NH2-(CH2)m-COOH)，其中m＝2-10，包括2和10，或省去；各V独立地选自D-Ser、L-Ser、D-Thr、L-Thr、D-Gln、L-Gln、D-Asn、L-Asn、D-4-OH-Pro或L-4-OH-Pro；且n＝1-50，包括1和50。在另一优选的实施方案中，各V独立地为D-Ser或L-Ser。在另一优选的实施方案中，至少一个V是D-氨基酸。
在可供替代的实施方案中，Y可以是亲水聚合物。例如Y可以是聚乙二醇、聚醋酸乙烯酯、聚乙烯醇、HPMA(N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺)或HPMA共聚物、α，β-聚(N-羟乙基)-DL-天冬酰胺(PHEA)、α，β-聚(N-羟丙基)-DL-天冬酰胺或聚醋酸乙烯酯。
生物活性肽Q优选促生长素抑制素肽或铃蟾肽。
在本发明的一个实施方案中，Q是铃蟾肽，和Z具有下式E-F其中E是D-Lys、D-Tyr、D-Ser、D-4-OH-Pro、L-4-OH-Pro、3-碘-D-Tyr、3，5-二碘-D-Tyr、3-砹-D-Tyr、3，5-二砹-D-Tyr、3-溴-D-Tyr、3，5-二溴-D-Tyr、D-Asn、L-Asn、D-Asp、L-Asp、D-Glu、L-Glu、D-Gln或L-Gln；且F是D-Lys、D-Tyr、D-Ser、L-Ser、D-4-OH-Pro、L-4-OH-Pro、3-碘-D-Tyr、3，5-二碘-D-Tyr、3-砹-D-Tyr、3，5-二砹-D-Tyr、3-溴-D-Tyr、3，5-二溴-D-Tyr、D-Asn、L-Asn、D-Asp、L-Asp、D-Glu、L-Glu、D-Gln或L-Gln。
本发明还提供治疗或诊断疾病的方法，该方法包括对患有所述疾病的受实验者施用治疗有效量的本发明的肽试剂。可用肽试剂治疗例如肺、乳腺、脑、眼、前列腺或结肠的肿瘤或其血管发生性血管，相应血管发生性血管，或神经内分泌来源的肿瘤，例如类癌综合症。
根据下述详细说明和根据权利要求，本发明的其它特征和优点将变得显而易见。
定义根据本发明，“治疗剂”是指在检测、诊断或治疗人类疾病中使用的任何化合物。这种化合物可以是天然存在的、修饰的或合成的化合物。治疗剂可促进或抑制人类疾病路径中牵涉的任何生物过程。优选的疾病靶包括，但不限于，炎性肠病、类风湿关节炎、肿瘤细胞或异常增生细胞、类癌综合征、肢端肥大症和血管发生。治疗剂可以是，例如抗肿瘤剂，包括细胞毒性剂。抗肿瘤剂可以是烷化剂、抗生素、抗代谢药、激素激动剂或拮抗剂微管蛋白抑制剂、拓扑异构酶I和II抑制剂或免疫调节剂。它们可通过其它机理途径起作用或抗肿瘤剂可以是补充的增强剂。
“细胞毒性剂”是指对肿瘤细胞有毒的任何天然存在的、修饰的或合成的化合物。这种试剂可用于治疗肿瘤以及炎性疾病、自身免疫病，和用于治疗特征在于细胞增殖或极度活跃的细胞群的其它症状或疾病。细胞毒性剂包括，但不限于，烷化剂、抗生素、抗代谢药、微管蛋白抑制剂、拓扑异构酶I和II抑制剂、激素激动剂或拮抗剂，或免疫调节剂。当通过光或红外激活时，它们也可以是细胞毒性剂(Photofrin，IR dyes；Nat.Biochnol.19(4)327-331，2001)。它们可通过其它机理途径起作用或细胞毒性剂可以是补充的增强剂。
“可检测的标记物”是指当连接到肽试剂上时，使化合物变得可检测的任何类型的标记物。可检测的标记物可以是毒性或无毒的，可不受限制地具有下述一个或多个特征荧光(Kiefer等，WO9740055)、颜色、毒性(例如放射性，例如γ-发射放射性核素、Auger-发射放射性核素、β-发射放射性核素、α-发射放射性核素或正电子-发射放射性核素)、放射敏感性或光敏感性。尽管可检测的标记物可直接连接到本发明的类似物的氨基酸残基上，但也可例如通过与连接(例如通过共价键连接或间接连接)到类似物的氨基酸残基上的螯合基团络合，从而间接连接可检测的标记物。也可借助将被第二分子特异结合的标记物的能力，将可检测的标记物间接连接到类似物上。这类间接连接的标记物的一个实例是生物素标记物，它可被第二分子，链亲和素，特异结合。第二分子也可连接到提供中子捕获的部分上(例如在Kahl等的Proc.Natl.Acad.Sci.USA877265-7269，1990中所述的硼笼)。
可检测的标记物也可以是重元素的金属离子或稀土离子，如Gd3+、Fe3+、Mn3+、或Cr2+(参见，例如Invest.Radiol.33(10)752-761，1998)。优选的放射性可检测标记物是放射性碘标记物(例如122I、123I、124I、125I或131I)，它们能被偶合到本发明的类似物中存在的各D-或L-Tyr或D-或L-4-氨基-Phe残基上。优选的非放射性可检测标记物是许多已知的染料，它们能被偶合到NH2-端基的氨基酸残基上。
对细胞有毒的可检测标记物的优选实例包括蓖麻毒素、白喉毒素和放射性可检测标记物(例如122I、123I、124I、125I、131I、177Lu、64Cu、67Cu、153Sm、166Ho、186Re、188Re、211At、212Bi、225Ac、67Ga、68Ga、75Br、76Br、77Br、117mSn、47Sc、109Pd、89Sr、159Gd、149Pm、142Pr、111Ag、165Dy、213Bi、111In、114mIn、201Ti、195mPt、193Pt、86Y和90Y)。此处所述的这些和其它化合物可直接或间接连接到生物活性肽或其类似物上。有毒的可检测标记物也可以是化学治疗剂(例如喜树碱、高喜树碱、5-氟尿嘧啶或阿霉素)，或可以是放射敏感剂(例如紫杉酚、gemcitabine、氟嘧啶、metronitozil或去氧胞啶类似物2′，2′-二氟-2′-去氧胞啶(dFdCyd))，它被直接或间接连接到本发明的促生长素抑制素类似物上。
“螯合基团”是指共价键合到肽试剂上的任何基团，它可与可检测的标记物如金属、光敏剂等络合。螯合基团例如包括，亚氨基二羧酸基或多氨基多羧酸基。使用在Liu等的Bioconjugate Chem.12(4)653，2001；Alter等等U.S.P.N.5753627和PCT公开No.WO91/01144(这些在此引入参考)中概述的方法，可以将螯合基团连接到本发明的肽试剂上。本发明的类似物可通过它已连接的螯合剂，络合到可检测的标记物上，从而得到间接标记的类似物。类似地，细胞毒性剂或治疗剂也可经过螯合基团连接到本发明的肽试剂上。
“生物活性肽”是指在生物过程或功能中涉及的任何天然存在的、修饰的或合成的肽。生物活性肽的实例包括，但不限于，激素、生长因子、神经递质、抗原、抗体或其片段等。“肽”是指任何多肽、肽(包括环状或支链肽)或包括通过肽键或修饰的肽键彼此连接的两个或多个氨基酸的蛋白质。“肽”包括短链肽，通常称为肽、寡肽或寡聚物，和长链，长度最多约100个残基的肽。肽可含有20个基因编码的氨基酸以外的氨基酸，和除肽键以外的键。“肽”包括用天然方法或用本领域已知的化学修饰技术修饰的氨基酸序列。可在多肽的任何地方发生修饰，其中包括肽主链、氨基酸侧链和氨基或羧基末端。
此处所使用的肽氨基酸残基的表示法是本领域常用的那些缩写。不那么常见的缩写Abu、Ava、β-Ala、hSer、Nle、Nva、Pal、Sar、Dab和Dap分别代表2-氨基丁酸、氨基戊酸、β-氨基丙酸、高丝氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、(2，3或4)3-吡啶基-Ala、1，4-二氨基丁酸、肌氨酸和1，3-二氨基丙酸。在本发明所有方面中，值得注意的是，当氨基酸没有指定为D-或L-氨基酸时，则氨基酸或者是L-氨基酸，或者可以是D-或L-氨基酸。
“类似物”是指与参考分子不同，但在结构、功能和/或化学上与参考分子有关的分子。类似物可保留参考分子的主要性能、功能或结构。最优选类似物保留参考分子的至少一种生物功能。通常限制差别，以便参考分子的结构或序列和类似物在总体上类似。肽类似物及其参考肽因一个或多个取代、添加和/或缺失或任何组合，在氨基酸序列上可能不同。取代或插入的氨基酸残基可能是或者可能不是被遗传密码编码的残基。肽或多肽类似物可以是天然存在的，如等位基因变体，或者它可以不是已知天然存在的变体。可通过直接合成，通过修饰，或通过诱变技术制造非天然存在的肽类似物。
“促生长素抑制素肽”是指具有天然促生长素抑制素的至少一种生物活性的促生长素抑制素类似物；优选这一活性是在带有促生长素抑制素受体的细胞上特异性键合到促生长素抑制素受体上的能力。具有生物活性的许多这种类似物是已知的，并描述于例如Hornik等的U.S.P.N.5770687；Coy等的U.S.P.N.5708135；Hoeger等的U.S.P.N.5750499；McBride等的U.S.P.N.5620675、Coy等的U.S.P.N.5633263；Coy等的U.S.P.N.5597894；Taylor等的U.S.P.N.5073541；Coy等的U.S.P.N.4904642；Dean的U.S.P.N.6017509；Hoffman等的WO98/47524和A.E.Bogden的U.S.P.N.5411943，每一篇均在此通过引入作为参考。
术语“铃蟾肽”包括具有天然铃蟾肽的至少一种生物活性的铃蟾肽类似物，优选这一活性是在带有铃蟾肽受体的细胞上特异性结合到三种已知的铃蟾肽受体亚型中的一种或全部亚型上的能力。铃蟾肽类似物包括，但不限于，选自含八肽G-Trp-H-I-His-J-K-NHV中的肽，其中G是Gln、Asn、Nle或Nva；H是Ava、Gly、Leu、Val、Ile、Nle或Nva；I是β-Ala、4-氨基丁酸、Gly、Ala、D-Ala、-N-Me-Ala或N-Me-D-Ala；J是Phe、Tyr、4-氯-Phe、4-氟-Phe、4-溴-Phe、4-NO2-Phe、Ala、Gly、Leu、Val、Ile、Nle或Nva；K是Met、Phe、Tyr、4-氯-Phe、4-氟-Phe、4-溴-Phe、4-NO2-Phe、Ala、Gly、Leu、Val、Ile、Nle或Nva；且N表示酰胺或N-烷基酰胺，V是H或低级烷基酰胺。
“烷基”是指脂族支链或直链烃基。烷基任选地被一个或多个取代基取代，这些取代基可以相同或者不同。“低级烷基”是指具有小于11个碳原子的支链或直链烷基，优选C1-C8烷基。“低级烷基酰胺”是指用一个或多个含酰胺基团取代的如上所述的低级烷基。
“亲水生物分布”是指本发明肽试剂对施用该肽试剂的受实验者的体液(例如血液、脑脊液、尿或其它体液)的亲和力，以便肽试剂在受实验者的全身分布，但经肾脏在尿内快速排泄，同时避免周围器官如肝脏、胆囊和肾脏的近端小管的摄取。
“亲水聚合物”是指任选地修饰的天然存在或合成的水溶性聚合物，该聚合物将改变本发明肽试剂的生物分布。这种聚合物的实例包括，但不限于，聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、葡聚糖、羟乙基淀粉、明胶、PVP、PHPMA、聚α，β-[N-(2-羟乙基)]-DL-天冬酰胺(PHEA)、聚琥珀酰胺(PSI)等。可例如通过琥珀酰化(负电荷)、PSI的部分水解(羧基)或者与添加含氨基或者含羧基的化合物反应等，来修饰这些聚合物。这种任选的修饰可增加或者改变聚合物的亲水性或者使得能偶合到肽或细胞毒性剂、治疗剂或者本发明肽试剂的螯合片段上。这种聚合物和修饰是本领域已知的，且描述于例如Yamoaka等的J.Pharmacol.Sci.83601-606，1994；Rypacek等的PflugersArch.392211-217，1982；Yamoaka等的J.Pharm.Pharmacol.47479-486，1995，Francesco，Bioconjugate Chemistry9(4)418-450，1998，Duncan和Spreafico，Clin.Pharmcokinet.27(4)290-306，1994中，在此将它们引入作为参考。
根据下述详细说明和根据权利要求，本发明的其它特征和优点将变得显而易见。
附图的简要说明
图1是显示与未连接的甲氨蝶呤和未连接的促生长素抑制素类似物片段相比，典型的甲氨蝶呤-促生长素抑制素连接物对成神经细胞瘤IMR-32细胞的抑制效果的图表。在这种体外体系中，甲氨蝶呤-肽连接物和单独的甲氨蝶呤的等同效力是显而易见的。对照肽JF-08-89是D-Ser-D-Ser-D-Ser-D-Ser-D-Ser-Nle-D-Tyr-D-Ser-环[Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys]-Thr-NH2(SEQ ID NO10)。
图2是显示本发明的亲水肽试剂的生物分布的图表。描述了2种125I-标记的亲水促生长素抑制素类似物。注意在正常组织(包括肝脏)内没有放射性的累积，和标记的肽试剂在尿和粪便中的快速和高效排泄。肽JF-08-73是125I-琥珀酰基-D-Asp-D-Ser-D-Ser-D-Ser-D-Ser-D-Ser-D-Asp-D-Ser-D-Ser-D-Ser-D-Ser-D-Ser-Lys-D-Tyr-D-Tyr-环[Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys]-Thr-NH2(SEQ ID NO11)。肽JF-08-53是125I-D-Ser-D-Ser-D-Ser-D-Ser-D-Ser-D-Lys-D-Tyr-D-Ser-环[Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys]-Thr-NH2(SEQ ID NO12)。
详细说明已开发出利用新型通用的连接序列的肽试剂家族。该连接序列能使治疗剂、细胞毒性剂、螯合基团或者可检测的标记物连接到生物活性肽上，同时没有显著损失肽试剂导向片段的生物效力。在本发明另一方面中，这些肽试剂或者类似物可另外包括亲水生物分布增强片段，通过导向类似物远离肝脏，朝向经肾脏的快速排泄，从而增加治疗效力。
本发明的肽试剂具有下式X-Y-Z-Q(式I)其中X任选地选自细胞毒性剂、治疗剂、可检测的标记物或螯合基团；Y是亲水元素；Q是生物活性肽，如促生长素抑制素或铃蟾肽，且Z是连接肽，当在Q的N-端或相容侧链氨基处键合到Q上时，它保持至少50％Q的生物活性。Q的取代的实例是GnRH肽的6位。该位置非常耐受例如D-Lys的取代，D-Lys中的ε-氨基，在保留受体亲和力的情况下，可用于细胞毒性或放射性基团的所述连接。Z具有下式A-B-C-E-F，其中A是D-Lys、D-Tyr、D-Ser或L-Ser，或省去；B是D-Lys或D-Tyr，或省去；C是Lys、Ser、hSer、Nle、Abu、Nva、(2，3或4)3-吡啶基-Ala 9(Pal)、Orn、Dab、Dap、4-NH2-Phe、D-4-OH-Pro或L-4-OH-Pro，或省去；E是D-Lys、D-Tyr、D-Ser、D-OH-Pro、L-4-OH-Pro、D-Asn、L-Asn、D-Asp、L-Asp、D-Glu、L-Glu、D-Gln或L-Gln；且F是D-Lys、D-Tyr、D-Ser、D-OH-Pro、L-4-OH-Pro、3-碘-D-Tyr、3，5-二碘-D-Tyr、3-砹-D-Tyr、3，5-二砹-D-Tyr、3-溴-D-Tyr、3，5-二溴-D-Tyr、D-Asn、L-Asn、D-Asp、L-Asp、D-Glu、L-Glu、D-Gln或L-Gln；条件是若A、B、C和E分别是Tyr、Tyr、Lys和Tyr，则F不是Lys；且若A、B、C和E分别是Lys、Tyr、Lys和Tyr，则F不是Tyr或Lys；且若省去A和B，并且C与E分别是Lys和Tyr，则F不是Tyr或Lys。Z肽接头因此可以是长度为2、3、4和5个残基。
在迄今为止合成的肽试剂当中，包括下述JF-07-100MTXCOO-CH2CO-D-Lys-D-Tyr-Lys-D-Tyr-D-Lys-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2(SEQ ID NO1)JF-08-87AMTXCOO-CH2CO-(D-Ser)5-Lys-D-Tyr-D-Tyr-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2(SEQ ID NO2)JF-09-35MTXCOONH-Leu-Ala-Leu-Ala-(D-Ser)5-Lys-D-Tyr-D-Ser-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2(SEQ ID NO3)MTXCOO-CH2CO-(D-Ser)5-Lys-D-Tyr-D-Tyr-环[Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys]-Thr-NH2(SEQ ID NO4)MTXCOO-CH2CO-(D-Ser-Ser)4-Tyr-D-Ser-Gln-Trp-Ala-Val-β-Ala-His-Phe-Nle-NH2(SEQ ID NO5)JF-09-73硫代秋水仙碱-硫醚-Lys-(D-Ser)10-Nle-D-Tyr-D-Ser-环[Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys]-Thr-NH2(SEQ ID NO6)JF-09-93喜树碱-羰基-Sar-D-Ser-Nle-D-Tyr-D-Ser-环[Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys]-Thr-NH2(SEQ ID NO7)JF-09-95喜树碱-羰基-Pro-D-Ser-Nle-D-Tyr-D-Ser-环[Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys]-Thr-NH2(SEQ ID NO8)JF-09-99喜树碱-羰基-羟基脯氨酸-D-Ser-Nle-D-Tyr-D-Ser-环[Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys]-Thr-NH2(SEQ ID NO9)在表1中可找到本发明肽试剂的其它序列。
通过包括含亲水残基的Z接头，和任选地包括长的亲水接头，本发明克服了有毒肽类似物在组织内的累积。这些接头促进完整未键合的肽试剂经肾脏快速排泄。同样已知包含在本发明中的聚乙二醇(PEG)、α，β-聚(N-羟乙基)-DL-天冬酰胺(PHEA)和聚乙烯醇(PVA)基团是快速肾脏排泄的优良促进剂，而快速肾脏排泄一般与较低可能的药物毒性相关(Yamoaka等的J.Pharmacol.Sci.，83601-606，1994；Rypacek等的J.Pharm.Pharmacol.，47479-486，1995)。我们断定这些基团还促进从生物可利用的非内化连接物中释放的毒性降低。
本发明的肽试剂包括当连接到细胞毒性剂上时，为保持肽类似物全部生物效力而设计的通用连接序列。本发明的肽类似物的生物效力优选大于或等于衍生它的母体肽类似物，其中特异性大于、小于或等于母体肽的目标特异性。例如，促生长素抑制素类似物比天然存在的促生长素抑制素可结合到更多的促生长素抑制素受体亚型上，或者它可以结合到特定的受体亚型上。本发明的一些类似物含有氨基酸或其类似物的D-异构体，这促进细胞毒性剂的稳定偶合，同时保持肽类似物较高的受体亲和力和生物效力。优选细胞毒性剂将经可能支持胞内游离细胞毒性剂释放的键偶合。
另外，由于本发明的促生长素抑制素类似物具有不同的亲水性，它们是水溶性的，因此与以前的疏水类似物相比，具有增加的用途。此处所述的亲水类似物可溶于血液、脑脊液、和其它体液以及可溶于尿，从而促进了经肾脏的排泄。这种亲水特征促进本发明类似物送递到身体的几乎各个区域。本发明还公开了掺入到肽类似物内的特定亲水元素，这允许类似物亲水性的调节，以适合于各种连接的细胞毒性剂的化学和结构特征。
促生长素抑制素激动剂类似物在与其受体结合之后快速内化(参见Lukinius等的Acta Onc.，38383-387，1999)，并进而可用作导向于各种治疗剂(如常规的肿瘤细胞毒性剂)的载体。有可能这种抗肿瘤剂可得到显著改进，这是因为许多肿瘤类型严重地过表达促生长素抑制素2型受体。按照这种方式，我们提出与所有可连接的细胞毒性剂有关的毒副作用可有效地降低，只要可设计对促生长素抑制素受体保留非常高亲和力的有效杂合分子。
本发明的特征在于使用连接序列，在分子式I中称为Z，我们发现它能使许多长的N-端氨基酸序列和大分子连接到激动剂效力全部保留的促生长素抑制素类似物的N-端基上。这种连接序列可用于添加更长、酶稳定的(通过使用D-氨基酸)、亲水的肽序列(分子式I的Y元素)，该序列被设计导向所得连接物远离肝脏，朝向经肾脏的快速排泄。或者可经Z接头将亲水聚合物连接到肽类似物上。这促进非内化连接物的毒性释放降低。
肽类似物还包括在式I中称为Y的元素，可优化该元素，促进连接到细胞毒性基团或治疗基团或螯合基团或可检测的标记物上的特定肽试剂的生物分布。Y接头可以是肽或聚合物，如PEG或PVA。若Y是亲水肽，则Y的长度可以是1-50个氨基酸，或更优选长度为3-15个残基。例如，Y的长度可以是3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸残基。若Y是肽，则Y可以含有带电或非极性氨基酸，天然存在、合成或修饰的它们的类似物或衍生物。
使用本发明的连接序列，将在式I中称为Q的生物活性肽，连接到在式I中称为X的各种治疗剂或诊断剂上。式I的组分X可以是任何已知的细胞毒性或治疗部分，例如抗肿瘤剂，如阿西维辛、阿柔比星、盐酸阿考达唑、阿克罗宁、阿多来新(adozelesin)、阿霉素、aldesleukin、六甲基蜜胺、阿波霉素、醋酸双羟胺蒽醌、氨鲁米特、安吖啶、anastrozole、安曲霉素、天冬酰胺酶、曲林菌素、阿扎胞苷、阿扎替派、阿佐霉素、巴马司他(batimastat)、苯佐替派、bicalutamide、盐酸比生群、bisnafide Dimesylate、bizelesin、硫酸博来霉素、brequinar Sodium、溴匹立明、白消安、放线菌素C、卡鲁睾酮、喜树碱、卡醋胺、卡贝替姆、卡铂、卡莫司汀、盐酸卡柔比星、carzelesin、cedefingol、苯丁酸芥氮、西罗霉素、顺铂、克拉立平(cladribine)、combretestatin A-4、crisnatol Dimesylate、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、DACA(N-[2-(二甲基氨基)乙基]吖啶-4-酰胺)、放线菌素、盐酸柔红霉素、柔红霉素、decitabine、右马普拉汀(dexormaplatin)、地扎呱宁、地扎呱宁甲醇盐、地吖醌、docetaxel、dolasatin、阿霉素、盐酸阿霉素、屈洛昔芬、柠檬酸屈洛昔芬、丙酸屈他雄酮、偶氮霉素、edatrexate、盐酸依氟鸟氨酸、椭圆玫瑰树碱、elsamitrucin、enloplatin、恩普氨酯、伊匹哌啶、盐酸表阿霉素、erbulozole、盐酸依索比星、雌莫斯汀、雌莫斯汀磷酸钠、依他硝唑、乙碘(ethiodized)油I 131、依托泊甙、磷酸依托泊甙、氯苯乙蜜胺、盐酸法唑(fadrozole)、法扎拉滨、芬维A胺、氟尿苷、磷酸氟达拉滨、氟尿嘧啶、5-FdUMP、氟西他滨、fosquidone、磷曲星钠、gemcitabine、盐酸gemcitabine、金Au 198、高喜树碱、羟基脲、盐酸伊达比星、异环磷酰胺、伊莫福新、干扰素α-2a、干扰素α-2b、干扰素α-n1、干扰素α-n3、干扰素β-Ia、干扰素γ-Ib、异丙铂、盐酸irinotecan、醋酸lanreotide、letrozole、醋酸亮丙瑞林、盐酸liarozole、lometrexol钠、洛莫司汀、盐酸losoxantrone、马索丙考、美坦生、盐酸双氯乙基甲胺、醋酸甲地孕酮、醋酸美仑孕酮、美法仑、美诺立尔、巯基嘌呤、甲氨蝶呤、甲氨蝶呤钠、氯苯氨啶、美妥替哌、米丁度胺、丝裂卡菌素、丝裂红素、米托菌素、米托马星、丝裂霉素、米托司培、米托坦、盐酸米托蒽醌、麦考酚酸、诺考达唑、诺拉霉素、ormaplatin、奥昔舒仑、紫杉醇、pegaspargase、培利霉素、溴新斯的明、硫酸培来霉素(peploycin)、过磷酰胺、哌泊溴烷、哌泊舒凡、盐酸piroxantrone、普卡霉素、plomestane、卟非尔钠、泊非霉素、泼尼漠司汀、盐酸丙卡巴肼、嘌呤霉素、盐酸嘌呤霉素、吡唑霉素、rhizoxin、rhizoxin D、利波腺苷、洛太米特(rogletimide)、safingol、盐酸safingol、司莫司汀、新曲秦、sparfosate钠、司帕霉素、盐酸锗螺胺、螺莫司汀、螺铂、绛色霉素、链佐星、氯化锶Sr89、sulofenur、他利霉素、taxane、taxoid、tecogalan钠、替加氟、盐酸teloxantrone、temoporfin、替尼泊甙、环氧三嗪酮(teroxirone)、睾内酯、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤、噻替哌、thymitaq、噻唑呋啉、tirapazamine、tomudex、TOP53、盐酸topotecan、柠檬酸托瑞米芬、醋酸曲托龙、磷酸曲西立滨、三甲曲沙、葡萄糖醛酸三甲曲沙、曲普瑞林、盐酸妥布氯唑、尿嘧啶氮芥、乌瑞替派、vapreotide、verteporfin、长春碱、硫酸长春碱、长春新碱、硫酸长春新碱、长春地辛、硫酸长春地辛、硫酸长春匹定、硫酸长春甘酯、硫酸长春罗新、酒石酸长春瑞宾、硫酸长春罗定、硫酸长春利定、伏罗唑(vorozole)、折尼拉汀(zeniplatin)、静司他丁、盐酸佐柔比星、2-氯去氧腺苷、2′-去氧间型霉素、9-氨基喜树碱、raltitrexed、N-炔丙基-5，8-二去氮叶酸、2-氯-2′-阿糖基-氟-2′-去氧嘌苷、2-氯-2′-去氧嘌苷、茴香霉素、古曲抑菌素A、hPRL-G129R、CEP-751、亚油酰胺、芥子气、氮芥(双氯乙基甲胺)、环磷酰胺、美法仑、苯丁酸氮芥、异环磷酰胺、白消安、N-甲基-亚硝基脲(MNU)、N，N′-双(2-氯乙基)-亚硝基脲(BCNU)、N-(2-氯乙基)-N′-环己基-N-亚硝基脲(CCNU)、N-(2-氯乙基)-N′-(反式-4-甲基环己基)-N-亚硝基脲(MeCCNU)、N-(2-氯乙基)-N′-(二乙基)乙基膦酸-N-亚硝基脲(福莫司汀)、链脲霉素、达卡巴嗪(diacarbazine)(DTIC)、米托唑胺、替莫唑胺、噻替哌、丝裂霉素C、AZQ、阿多来新、顺铂、卡铂、ormaplatin、oxaliplatin、C1-973、DWA 2113R、JM216、JM335、双(铂)、tomudex、阿扎胞苷、阿糖胞苷、gemcitabine、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、次黄嘌呤、替尼泊甙9-氨基喜树碱、topotecan、CPT-11、阿霉素、柔红霉素、表阿霉素、darubicin、米托蒽醌、losoxantrone、更生霉素(放线菌素D)、安吖啶、pyrazoloacridine、全反式维生素A、14-羟基-retro-维生素A、全反式维生素A酸、N-(4-羟苯基)维生素A酰胺、13-顺式维生素A酸、3-甲基TTNEB、9-顺式维生素A酸、氟达拉滨(2-F-α-AMP)或2-氯去氧阿糖腺苷(2-Cda)。
其它抗肿瘤化合物包括，但不限于20-pi-1，25-二羟基维生素D3、5-乙炔基尿嘧啶、abiraterone、阿克拉霉素、acylfulvene、adecypenol、阿多来新、aldesleukin、全部TK拮抗剂、六甲密胺、阿巴司丁、amidox、阿米斯丁、氨基乙酰丙酸、amrubicin、安吖啶、阿那格雷、anastrozole、andrographolide、血管生成抑制剂、拮抗剂D、拮抗剂G、安雷利克斯、anti-dorsalizing morphogenetic蛋白质-1、抗雄激素药物、前列腺癌、抗雌激素药物、抗瘤酮、反义寡核苷酸、甘氨酸阿非迪霉素、凋亡基因调节剂、凋亡调节剂、脱嘌呤核酸、α-CDP-DL-PTBA、精氨酸去胺酶、asulacrine、阿他美坦、atrimustine、axinastatinl、axinastatin 2、axinastatin 3、azasetron、azatoxin、氮杂酪氨酸、浆果赤霉素III衍生物、balanol、巴马司他、BCR/ABL拮抗剂、苯并二氢卟吩、benzoylstaurosporine、β-内酰胺衍生物、β-alethine、β-clamycin B、白桦脂酸、bFGF抑制剂、bicalutamide、比生群、双氮丙啶肌胺、bisnafide、bistrateneA、bizelesin、breflate、博来霉素A2、博来霉素B2、溴匹立明、布多替钛、buthionine sulfoximine、钙泊三醇、calphostin C、喜树碱衍生物(例如10-羟基稀释剂)、金丝雀痘IL-2、capecitabine、酰胺-氨基-三唑、酰胺三唑、CaRest M3、CARN 700、软骨衍生的抑制剂、carzelesin、酪蛋白激酶抑制剂(ICOS)、粟精胺、天蚕抗菌肽B、cetrorelix、二氢卟吩、氯代喹喔啉磺酰胺、西卡前列素、顺式卟啉、克拉立平、氯米芬类似物、克霉唑、collimycin A、collimycinB、combretastatin A4、combretastatin类似物、conagenin、crambescidin816、crisnatol、cryptophycin 8、cryptophycin A衍生物、curacin A、环戊蒽醌(cyclopentanthraquinone)、cycloplatam、cypemycin、阿糖胞苷ocfosfate、细胞溶解因子、细胞生长抑制剂、decliximab、decitabine、dehydrodidemnin B、2′-去氧助间型霉素(DCF)、deslorelin、dexifosfamide、地拉佐生、dexverapamil、地吖醌、didemnin B、乙酰唑胺、二乙基norspermine、二氢-5-氮杂胞苷、二氢紫杉酚，9-、dioxamycin、二苯基螺莫司汀、discodermolide、二十二烷醇、dolasetron、去氧氟尿苷、屈洛昔芬、屈大麻酚、duocarmycin SA、依布硒啉、ecomustine、edelfosine、edrecolomab、依氟鸟氨酸、榄香烯、emitefur、表阿霉素、epothilone(A，R-H；B，R＝Me)、epithilone、依他硝唑、依托泊甙、依托泊甙-4′-磷酸酯(etopofos)、exemestane、法唑、法扎拉滨、feretinide、非格司亭、非那司提、flavopiridol、flezelastine、氟海星酮、氟达拉滨、盐酸fluorodaunorunicin、福酚美克、福麦斯坦、磷曲星、福莫司汀、texaphyrin钆、硝酸镓、galocitabine、ganirelix、白明胶酶抑制剂、gemcitabine、谷光甘肽抑制剂、hepsulfam、heregulin、六亚甲基双乙酰胺、高三尖杉酯碱(HHT)、金丝桃蒽酮、ibandronic酸、伊达比星、idoxifene、idramantone、伊莫福新、ilomastat、咪唑吖啶酮、imiquimod、免疫刺激肽、胰岛素状生长因子-1-受体抑制剂、干扰素激动剂、干扰素、白细胞介素、碘苄胍、碘阿霉素、ipomeanol，4-、irinotecan、iroplact、irsogladine、isobengazole、isohomohalicondrin B、itasetron、jasplakinolide、kahalalide F、三乙酸lamellarin-N、lanreotide、leinamycin、来诺拉提、硫酸香菇多糖、leptolstatin、letrozole、白血病抑制因子、白血球α干扰素、亮丙瑞林+雌激素+孕酮、亮丙瑞林、左旋四咪唑、liarozole、线性多胺类似物、寝食亲脂二糖肽、亲脂铂化合物、lissoclinamide 7、lobaplatin、胍乙基磷酸丝氨酸、lometrexol、氯尼达明、losoxantrone、洛伐他汀、loxoribine、lurtotecan、texaphyrin镥、lysofylline、细胞溶解菌素肽、美坦生、mannostatinA、marimastat、马索丙考、maspin、matrilysin抑制剂、基质金属蛋白酶抑制剂、美诺立尔、merbarone、meterelin、methioninase、甲氧氯普胺、MIF抑制剂、ifepristone、miltefosine、mirimostim、错配双链RNA、光神霉素、米托胍腙、二溴卫矛醇、丝裂霉素类似物、米托萘胺、mitotoxin成纤维细胞生长因子-saporin、米托蒽醌、mofarotene、莫拉马提、单克隆抗体、人类绒毛膜促性腺激素、单磷酰脂质体A+myobacterium细胞壁sk、莫哌达醇、抗多种药物的基因抑制剂、多发性肿瘤抑制剂1-基治疗、芥末抗癌剂、mycaperoxide B、myobacterium细胞壁提取物、myriaporone、N-乙酰基地那林、N-取代苯甲酰胺、那法瑞林、nagrestip、纳洛酮+喷他佐辛、napavin、naphterpin、nartograstim、nedaplatin、nemorubicin、neridronic酸、中性肽链内切酶、尼鲁米特、nisamycin、氧化氮调节剂、氧化氮抗氧剂、nitrullyn、06-苄基鸟嘌呤、善得定、okicenone、低聚核苷酸、onaspristone、奥丹亚龙、奥丹亚龙、oracin、口服细胞因子诱导剂、ormaplatin、osaterone、奥沙利铂、oxaunomycin、紫杉醇类似物、紫杉醇衍生物、palauamine、棕榈酰基rhizoxin、pamidronic酸、panaxytriol、panomifene、parabactin、帕折普汀、天门冬酰胺酶、peldesine、戊糖酸多硫酸钠、喷司他丁、pentrozole、perflubron、过磷酰胺、紫苏乙醇、phenazinomycin、醋酸苯酯、磷酸酶抑制剂、溶链菌制剂、盐酸匹鲁卡品、吡柔比星、吡曲克李、placetin A、placetin B、纤溶酶原活化剂抑制剂、铂络合物、铂化合物、铂三胺络合物、鬼臼毒素、porfirmer钠、泊非霉素、丙基双吖啶酮、前列腺素J2、proteasome抑制剂、蛋白质-A基免疫调节剂、蛋白质激酶C抑制剂、蛋白质激酶C抑制剂、microalgal、蛋白质酪氨酸磷酸酶抑制剂、嘌呤核苷磷酰酶抑制剂、羟基茜草素、吡唑吖啶、吡醇羟异化血红素聚氧乙烯连接物、raf拮抗剂、raltitrexed、ramosetron、ras法尼基蛋白质转移酶抑制剂、ras抑制剂、ras-GAP抑制剂、去甲基化retelliptine、羟乙二磷酸铼186Re、rhizoxin、ribozyme、RII retinamide、洛太米特、rohitukine、罗莫肽、罗喹美克、鲁必金酮B1、ruboxyl、safingol、saintopin、SarCNU、sarcophytol A、沙莫司亭、Sdi 1模拟物、司莫司汀、衰老衍生的抑制剂1、感觉低聚核苷酸、信号传递抑制剂、信号传递调节剂、单链抗原结合蛋白质、西佐喃、sobuzoxane、borocaptate钠、醋酸苯酯钠、solverol、生长调节素结合蛋白质、sonermin、sparfosic酸、spicamycin D、螺莫司汀、splenopentin、spongistatinl、角鲨胺、干细胞抑制剂、冠心病分化抑制剂、stipiamide、stromelysin抑制剂、sulfinosine、超活性血管作用的肠肽拮抗剂、suradista、苏拉明、八氢吲嗪三醇、合成糖胺聚糖、tallimustine、他莫昔芬甲碘化物、牛磺莫司汀、tazarotene、tecogalan钠、替加氟、tellurapyrylium、端粒末端转移酶抑制剂、temoporfin、替莫唑胺、替尼泊甙、四氯decaoxide、tetrazomine、thaliblastine、沙利度胺、thiocoraline、血小板生成素、血小板生成素模拟物、thymalfasin、促胸腺生成素受体拮抗剂、thymotrinan、甲状腺刺激激素、乙基etiopurpurin锡、tirapazamine、二氯环戊二烯钛、topotecan、topsentin、托瑞米芬、全能干细胞因子、转译抑制剂、维生素A酸、三乙酰基胆碱、曲西立滨、三甲曲沙、曲普瑞林、托烷司琼、turosteride、酪氨酸激酶抑制剂、tyrphostin、UBC抑制剂、乌苯美司、尿殖窦衍生的生长抑制因子、尿激酶受体拮抗剂、vapreotide、拟青霉素B、载体系统、红细胞基因治疗、velaresol、veramine、黄雀、verteporfin、长春瑞宾、vinxaltine、vitaxin、伏罗唑、zanoterone、折尼拉汀、zilascorb和静司他丁stimalamer。
X也可以是抗增殖剂，例如吡曲克李异硫羰酸酯。或者，X可以是抗前列腺肥大剂，如豆甾葡苷、良性前列腺增生治疗剂，如盐酸tamsulosin或，前列腺生长抑制剂，如喷托孟。
X也可以是放射性试剂，其中包括，但不限于，125I冻干人纤维蛋白原、18F氟去氧葡萄糖、18F氟多潘、125I胰岛素、131I胰岛素、123Ilobenguane、131I胆影酸钠、131I碘非那宗、131I碘胆甾醇、123I碘马尿酸钠、125I碘马尿酸钠、131I碘马尿酸钠、125I碘奥酮、131I碘奥酮、123I盐酸洛非帕明、125I iomethin、131I iomethin、125I碘他拉酸钠、131I碘他拉酸钠、131I酪氨酸、125I碘塞罗宁、131I碘塞罗宁、197Hg醋酸汞丙醇、203Hg醋酸汞丙醇、197Hg汞丙醇、75Se硒蛋氨酸、三氯化锑锝99mTc胶体、bicisate锝99mTc、地索苯宁锝99mTc、羟乙二磷酸锝99mTc、依沙美肟锝99mTc、furifosmin锝99mTc、葡庚糖酸锝99mTc、利多苯宁锝99mTc、甲溴苯宁锝99mTc、亚甲二膦酸锝99mTc、亚甲二膦酸二钠锝99mTc、mertiatide锝99mTc、羟亚甲基二膦酸锝99mTc、三胺五乙酸锝99mTc、三胺五乙酸钙三钠锝99mTc、sestamibi锝99mTc、siboroxime锝99mTc、锝99mTc、琥巯酸、锝99mTc硫胶体、teboroxime锝99mTc、tetrofosmin锝99mTc、tiatide锝99mTc、125I四碘甲腺氨酸、131I四碘甲腺氨酸、131I碘托泊酮、125I三油酸甘油酯或131I三油酸甘油酯。
治疗剂或者细胞毒性剂可包括，例如抗癌补充增强剂，其中包括，但不限于，三环抗抑郁药物(例如米帕明、地昔帕明、amitryptyline、氯米帕明、曲米帕明、多塞平、去甲替林、普罗替林、阿莫沙平和maprotiline)；非三环抗抑郁药物(例如舍曲林、曲唑酮和西酞普兰)；Ca++拮抗剂(例如维拉帕米、硝苯地平、尼群地平、和卡罗维林)；钙调素抑制剂(例如普尼拉明、三氟培拉嗪和氯米帕明)；两性霉素B、曲帕拉醇类似物(例如他莫昔芬)、抗心率失常药(如奎尼丁)；抗高血压药(例如利血平)、硫醇耗尽剂(例如buthionine和sulfoximine)和多药物抗性减少剂如Cremaphor EL。
本发明的化合物也可与细胞因子如粒细胞集落刺激因子一起施用。在抗癌鸡尾酒中使用的优选抗癌剂(例如与本发明的试剂组合)包括(一些具有在括号内所示的它们的MTD)gemcitabine(1000mg/m2)、氨甲喋呤(15gm/m2i.v.+leuco.＜500mg/m2i.v.w/oleuco)、5-FU(500mg/m2/天×5天)、FUDR(在小鼠中100mg/kg/d，在人类中0.6mg/kg/d)、FdUMP、羟基脲(在人类中35mg/kg/d)、docetaxel(60-100mg/m2)、discodermolide、epothilones、长春新碱(1.4mg/m2)、长春碱(升高3.3-11.1mg/m2，或很少到18.5mg/m2)、长春瑞宾(30mg/m2/wk)、meta-pac、irinotecan(50-150mg/m2，1x/wk，取决于患者的反应)；SN-38(比irinotecan的效力大100倍)、10-OH campto、topotecan(在人类中，1.5mg/m2/天，lxiv LDIO小鼠＝75mg/m2)、依托泊甙(在人类上，100mg/m2/天)、阿霉素、flavopiridol、顺铂(在人类上，100mg/m2/天)、卡铂(在人类中，360mg/m2/天)、博来霉素(20mg/m2)、丝裂霉素C(20mg/m2)、普卡霉素(30sug/kg)、capecitabine(口服2.5mg/m2)、阿糖胞苷(100mg/m2/天)、2-C1-2′-去氧腺苷、氟达拉滨-P04(25mg/m2/天，×5天)、米托蒽醌(12-14mg/m2)、米托唑胺(＞400mg/m2)、喷司他丁或者tomudex。
X可以优选是抗代谢剂，如氨甲蝶呤。抗代谢剂包括，但不限于，下述化合物及其衍生物硫唑嘌呤、克拉立平、阿糖胞苷、达卡巴嗪、磷酸氟达拉滨、氟尿嘧啶、盐酸gencitabine、巯基嘌呤、氨甲蝶呤、二溴甘露醇、米托坦、盐酸氯胍、乙胺嘧啶、raltitrexed、葡糖醛酸三甲曲沙、乌拉坦、硫酸长春碱、硫酸长春新碱等。更优选，X可以是叶酸型抗代谢剂，这类试剂包括，例如氨甲蝶呤、盐酸氯胍、pyrimethanime、甲氧苄啶或者葡糖醛酸三甲曲沙或者这些化合物的衍生物。
在另一实施方案中，X可以是蒽环霉素抗肿瘤剂家族中的成员，其中包括，但不限于，盐酸阿柔比星、盐酸柔红霉素、盐酸阿霉素、盐酸表阿霉素、盐酸伊达比星、吡柔比星或者盐酸佐柔比星。此外，X可以是喜树碱或其衍生物或相关的化合物，如10，11亚甲二氧喜树碱。X也可以选自maytansinoid族的化合物，这些化合物包括结构上相关的各种化合物。例如，安丝菌素P3、美坦生、2′-N-去甲基美坦布亭或者maytanbicyclinol属于maytansinoids。
可修饰或者标记本发明的肽试剂，以促进诊断或者治疗用途。可检测的标记物如放射性试剂、荧光试剂、重金属或者其它试剂可结合到发明的肽试剂上。单一、双、或者多标记的肽试剂可以是有利的。例如，一个或者多个残基的放射性碘化，结合例如借助螯合基团将90Y偶合到含胺的侧基或者反应性基团上的双标记，将提供组合标记。对于特定的诊断需要，如鉴定广泛分散的小肿瘤细胞团，这可以是有用的。
也可例如通过卤化化合物的酪氨酸残基，修饰本发明的肽类似物。卤素包括氟、氯、溴、碘或砹。这种卤化的肽试剂可以是可检测标记的，例如若卤素是放射性同位素，如18F、75Br、77Br、122I、123I、124I、125I、129I、131I或211At。在各肽试剂分子内，本发明的卤化化合物含有共价键合到至少一个氨基酸上的卤素，优选共价键合到D-Tyr残基上的卤素。其它合适的可检测的修饰包括将其它化合物(例如荧光染料如荧光素)键合到类似物的赖氨酸残基上，特别地键合到具有含赖氨酸的接头的类似物上。
供放射性标记本发明的生物肽试剂的放射性同位素包括可共价键合到类似物的残基上的任何放射性同位素。放射性同位素可选自发射β或γ射线的放射性同位素，或者可经修饰而含有例如可共价键合到类似物的赖氨酸残基上的螯合基团的肽试剂。然后修饰螯合基团使其含有任何放射性同位素，如镓、铟、锝、镱、铼或铊(例如125I、67Ga、111In、99mTc、169Yb、186Re)。
当通过连接放射性同位素修饰肽试剂时，优选放射性同位素是放射性半衰期相当于或长于所使用试剂的生物半衰期的那些。更优选放射性同位素是卤原子的放射性同位素(例如氟、氯、溴、碘和砹的放射性同位素)，甚至更优选75Br、77Br、76Br、122I、123I、124I、125I、129I、131I或211At。
包括放射性金属的连接物可用于放射照相成像或放射治疗。优选的放射性同位素还包括99mTc、51Cr、67Ga、68Ga、111In、168Yb、140La、90Y、88Y、153Sm、156Ho、165Dy、64Cu、97Ru、103Ru、186Re、188Re、203pb、211Bi、212Bi和214Bi。基于所需的治疗或诊断应用，确定金属的选择。
本发明的金属络合物用作诊断和/或治疗剂。可检测的标记物可以是来自重元素金属离子或稀土离子，如Gd3+、Fe3+、Mn3+、或Cr2+。在MRI成像应用中，含顺磁或超顺磁金属的连接物可用作诊断剂。可在连接物中使用的顺磁金属包括，但不限于，铬(III)、锰(II)、铁(II)、铁(III)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、镨(III)、钕(III)、钐(III)、钆(III)、铽(III)、镝(III)、钬(III)、铒(III)和镱(III)。优选具有至少10、12、15或20mM-1sec-1Z-1的驰豫度的聚合物，其中Z是顺磁金属的浓度。
可使用螯合基团，将可检测的标记物或其它分子间接偶合到本发明的肽试剂上。螯合基团可以连接含放射性标记物的肽试剂，如双官能的稳定螯合剂可被连接到一个或多个末端氨基酸反应性基团或内部氨基酸反应性基团上。它们可通过防止Edman降解的β-Ala异硫氰酸酯或合适的非α-氨基酸接头来连接。本领域已知的螯合剂的实例包括，例如亚氨基(inino)羧酸和多氨基多羧酸反应性基团，DTPA(N，N-双[2-[双(羧甲基)氨基]乙基]甘氨酸)和DOTA(1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸)。
本发明的细胞毒性剂或治疗剂连接物可使用任何较大数量的已知促生长素抑制素类似物，它识别促生长素抑制素受体，例如在以上定义中所述的那些。优选连接物的促生长素抑制素类似物部分含有10至18个氨基酸，和包括核心序列环[Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys]。优选类似物的C-端是Thr-NH2。此处所披露的铃蟾肽类似物也可连接到本发明肽试剂内的细胞毒性剂或治疗剂上。
使用已知的化学方法，可将促生长素抑制素类似物直接偶合到细胞毒性剂或治疗剂上，或者可通过间接的键偶合这两部分。例如，可将类似物连接到螯合基团上，而该螯合基团则被连接到细胞毒性剂或治疗剂上。螯合基团包括，但不限于，亚氨基二羧基或多氨基多羧基。至于通用的方法，参见例如Liu等的Bioconjugate Chem.12(4)653，2001；Cheng等，WO89/12631；Kieffer等，WO93/12112；Albert等，U.S.P.N.5753627；和WO91/01144(每一篇文献均在此引入作为参考)。
标记的治疗剂或细胞毒性剂的特异性导向提供对生物活性肽特异的受体表达的肿瘤的选择破坏。例如，表达促生长素抑制素受体的肿瘤包括肺、乳腺、前列腺、结肠、脑、胃肠道、神经内分泌轴、肝脏、肾脏等的肿瘤(参见Schaer等Int.J.Cancer，70530-537，1997；Chave等Br.J.Cancer82(1)124-130，2000；Evans等Br.J.Cancer75(6)793-803，1997)。细胞毒性的促生长素抑制素肽类似物对肿瘤血管或血管发生性血管，如过表达促生长素抑制素受体的那些也可以是特异的(参见，Denzler和Reubi，Cancer 85188-198，1999；Gulec等，J.Surg.Res.97(2)131-137，2001；Woltering等，J.Surg.Res.50245，1991)。
也可将本发明的肽试剂直接或与任何药学上可接受的载体或本领域已知的盐组合，施用于哺乳动物受实验者，如人类。药学上可接受的盐可包括在药学工业中常用的无毒酸加成盐或金属络合物。酸加成盐的实例包括有机酸，如乙酸、乳酸、pamoic酸、苹果酸、柠檬酸、马来酸、抗坏血酸、琥珀酸、苯甲酸、棕榈酸、辛二酸、水杨酸、酒石酸、甲磺酸、甲苯磺酸或三氟乙酸或类似物；聚合物酸如单宁酸、羧甲基纤维素等；和无机酸，如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸等。金属络合物包括锌、铁等。一个例举的药学上可接受的载体是生理盐水。其它生理上可接受的载体和它们的制剂是本领域技术人员已知的，且例如描述于Remington′s Pharmaceutical Sciences(第18版)A.Gennaro编辑，1990，Mack Publishing Company，Easton，PA中。
可口服、肠胃外(例如肌内、腹膜内、静脉内或皮下注射、吸入、经皮、滴眼剂或植入物)、鼻、阴道、直肠、舌下，或局部施用与适合于施用路线的药学上可接受的载体混合的治疗有效量的本发明肽试剂或其药学上可接受的盐的药物制剂。
例如在Remington′s Pharmaceutical Sciences(第18版)A.Gennaro编辑，1990，Mack Publishing Company，Easton，PA中可找到制造制剂用的本领域公知的方法。根据制造药物组合物领域的任何已知方法，可以以固体或液体形式制备拟口服使用的组合物。组合物可任选地含有甜味剂、调味剂、着色剂、香料、和/或防腐剂，以便提供更可口的制剂。口服施用的固体剂型包括胶囊、片剂、丸剂、粉剂和颗粒。在这种固体形式中，将活性化合物与至少一种惰性的药学上可接受的载体或赋形剂混合。这些可包括，例如惰性稀释剂，如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、蔗糖、淀粉、磷酸钙、磷酸钠或高岭土。也可使用粘合剂、缓冲剂和/或润滑剂(例如硬脂酸镁)。片剂和丸剂可另外与肠衣一起制备。
口服施用的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆和软明胶胶囊。这些形式含有在本领域常用的惰性稀释剂，如水或油介质。除了这些惰性稀释剂之外，组合物还可包括佐剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂。
肠胃外施用的配方包括灭菌的含水或无水溶液、悬浮液或乳液。合适的载体的实例包括丙二醇、聚乙二醇、植物油、明胶、氢化naphalene和可注射的有机酯，如油酸乙酯。这种制剂也可含有佐剂，如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可使用可生物相容、可生物降解的丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物来控制化合物的释放。供本发明多肽用的其它潜在有用的肠胃外送递体系包括乙烯-醋酸乙烯酯共聚物颗粒、渗透泵、可植入的输注体系和脂质体。
可例如通过经细菌截留过滤器过滤，通过掺入灭菌剂到组合物内，或通过辐射或加热组合物，使液体制剂灭菌。或者，也可以以灭菌的固体组合物形式制造它们，其中该组合物在使用之前可迅速溶解在灭菌水或一些其它的灭菌可注射介质内。
直肠或阴道给药的组合物优选是栓剂，栓剂除了含有活性物质之外，还可含有赋形剂如可可油或栓剂蜡。鼻或舌下给药的组合物也与本领域已知的标准赋形剂一起制备。供吸入的制剂可含有赋形剂，例如乳糖，或可以是含例如聚氧乙烯-9-月桂基醚、甘胆酸盐和脱氧胆酸盐的含水溶液，或者可以是以鼻腔滴剂或喷雾剂形式施用的油状溶液，或作为凝胶。
可变化本发明组合物内的活性成分的用量。本领域的技术人员会理解，在某种程度上根据各种因素，其中包括待施用的多肽、给药时间、给药途径、制剂的性质、排泄的速度、受实验者状况的性质和患者的年龄、体重、健康状态和性别，调节精确切的个体剂量。另外，生物活性肽如促生长素抑制素或铃蟾肽所导向的的严重程度也将对剂量水平产生影响。一般地，每日施用0.1μg/kg-100mg/kg体重的剂量水平作为单一剂量或分成多剂。通常的剂量范围优选为250μg/kg-5.0mg/kg体重/天。鉴于各种施用途径的不同效率，可预计在所需剂量内的宽范围变化。例如，预计口服给药通常要求比静脉内注射给药高的剂量水平。可使用本领域公知的供优化用的标准的经验途径，调节在这些剂量水平内的变异。一般地，考虑到上述的因素，将由主治医生决定精确的治疗有效剂量。
可以以持续释放组合物形式，如在U.S.P.N.5672659和U.S.P.N.5595760中所述的那些，施用本发明的多肽。使用即刻或持续释放组合物取决于被治疗的状况的类型。若状况由急性或过急(over-acute)的病症组成，则用即刻释放形式的治疗优于长期释放的组合物。或者，对于预防或长期治疗来说，通常优选持续释放组合物。
可以以任何方式制备本发明的多肽。可从天然存在的原料中分离多肽，重组生产多肽，或合成生产多肽，或通过这些方法的组合生产多肽。短肽的合成是本领域公知的，参见例如Stewart等，Solid PhasePeptide Synthesis(Pierce Chemical Co.，2d ed.，1984)。可根据本领域已知的标准肽合成方法合成本发明的肽，下面的实施例1中将举例说明。
通过下述实施例阐述本发明，无论如何，这些实施例不打算限制本发明。
实施例1(+)-甲氨蝶呤(氨甲喋呤)的二铯盐的制备将氨甲喋呤(0.75mmol)溶解在200ml向其中加入了碳酸氢铯(1.5mmol)的水中。搅拌该黄色溶液4小时，减压蒸发，将油状残渣溶解在乙醇中。从无水乙醇中蒸发3次，以除去残留的水。
实施例22-溴-乙酰基-D-叔丁基-Ser-D-叔丁基-Ser-D-叔丁基-Ser-D-叔丁基-Ser-D-叔丁基-Ser-ε-叔丁氧基羰基-Lys-D-叔丁基-Tyr-D-叔丁基-Tyr-S-三苯甲基-Cys-Phe-D-Trp-ε-叔丁氧基羰基-Lys-叔丁基-Thr-S-三苯甲基-Cys-叔丁基-Thr-Rink-酰胺-树脂的制备将Rink-酰胺MBHA聚苯乙烯树脂(0.25mmol)[4-(2′，4′-二甲氧基苯基-Fmoc-(氨基甲基)苯氧基乙酰氨基-正亮氨酰基-甲基二苯甲基胺树脂，100-200目，Novabiochem，San Diego，CA)]加入到CS136自动肽合成仪(CS Bio，Inc.，San Carlos，CA)的反应容器中，并在DMF中溶胀约1小时。过滤树脂，并添加过量的20％溶于DMF的哌啶，并混合2分钟。过滤树脂，并再次添加过量的20％哌啶并混合20分钟，以确保完全除去树脂的Fmoc基团。在去保护之后，用DMF洗涤树脂4次，然后将首先被护的氨基酸，Fmoc-Thr(tBut)(0.75mmol)、二异丙基碳二亚胺(DIC)(0.75mmol)和N-羟基苯并三唑一水合物(HOBt)(0.75mmol)全部溶解在DMF中，并加入到树脂中，混合(1h)，接着用DMF洗涤4次。
通过用20％哌啶/DMF溶液处理，再次除去Fmoc基团，接着进行相同的通用偶合步骤，使下述氨基酸连续与生长肽链反应Fmoc-S-三苯甲基-L-半胱氨酸、Fmoc-O-叔丁基-L-苏氨酸、Nα-Fmoc-Nε-Boc-L-赖氨酸、Nα-Fmoc-Nin-Boc-D-色氨酸、Fmoc-L-苯丙氨酸、Fmoc-S-三苯甲基-L-半胱氨酸、Fmoc-O-叔丁基-D-酪氨酸、Fmoc-O-叔丁基-D-酪氨酸、Nα-Fmoc-Nε-Boc-L-赖氨酸、Fmoc-O-叔丁基-D-丝氨酸、Fmoc-O-叔丁基-D-丝氨酸、Fmoc-O-叔丁基-D-丝氨酸、Fmoc-O-叔丁基-D-丝氨酸、Fmoc-O-叔丁基-D-丝氨酸。在除去最终的Fmoc基团之后，使用相同的偶合剂，将2-溴乙酸偶合到N-端氨基上。
实施例3氨甲喋呤-乙酰基-D-叔丁基-Ser-D-叔丁基-Ser-D-叔丁基-Ser-D-叔丁基-Ser-D-叔丁基-Ser-ε-叔丁氧基羰基-Lys-D-叔丁基-Tyr-D-叔丁基-Tyr-S-三苯甲基-Cys-Phe-D-Trp-ε-叔丁氧基羰基-Lys-叔丁基-Thr-S-三苯甲基-Cys-叔丁基-Thr-Rink-酰胺-树脂的制备将实施例1制备的氨甲喋呤的二铯盐(0.75mmol)溶解在DMSO中，并在圆底烧瓶内，加入到实施例2制备的肽基树脂(0.25mmol)中。在水浴(40℃，18小时)中加热的同时，轻轻混合悬浮液、过滤并用大量DMF，接着用甲醇洗涤。在最后的过滤之后，空气干燥衍生的树脂过夜。
实施例4氨甲喋呤-乙酰基-D-Ser-D-Ser-D-Ser-D-Ser-D-Ser-Lys-D-Tyr-D-Tyr-环[Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys]-Thr-酰胺的制备将实施例3制备的氨甲喋呤-肽树脂(0.25mmol)放置在圆底烧瓶内，向圆底烧瓶内加入15ml含水(2.5％)、1，2-乙二硫醇(2.5％)和三异丙基硅烷(1％)的三氟乙酸(TFA)的溶液。搅拌该悬浮液(2h)、过滤并用TFA洗涤数次。真空蒸发TFA，并将醚加入到所得油中，得到黄色粉末，然后将该黄色粉末溶解在60％醋酸(250ml)中。在剧烈搅拌下逐滴添加碘在甲醇中的浓缩溶液，直到形成永久的褐色，此时，通过添加小量抗坏血酸除去过量碘。
在真空下，将溶液体积降低到约10ml，通过制备型反相高压液相色谱(RP-hplc)，在C-18键合的氧化硅(Dynamax300，8μm)柱(21.4×250mm)上，纯化粗的氨甲喋呤肽。使用流速为20ml/min的线性梯度洗脱体系由0.1％TFA组成的缓冲液A和缓冲液B、80％MeCN中的0.1％TFA；以1％/min增加20B％到50％B。在280nm处监控分离。收集通过分析hplc证明含纯产物的级分、真空浓缩并进行冻干。通过从含水乙酸中冻干，以恒重的絮状白色粉末形式获得肽。通过酸水解产物的氨基酸分析和基质辅助的激光解吸质谱，证明确切组成。
实施例52-溴-乙酰基-D-叔丁基-Ser-叔丁基-Ser-D-叔丁基-Ser-叔丁基-Ser-D-叔丁基-Ser-叔丁基-Ser-D-叔丁基-Ser-叔丁基-Ser-D-叔丁基-Tyr-D-叔丁基-Ser-Gln-Trp-Ala-Val-β-Ala-叔丁氧基羰基-His-Phe-Nle-Rink-酰胺-树脂的制备将Rink-酰胺MBHA聚苯乙烯树脂(0.25mmol)[4-(2′，4′-二甲氧基苯基-Fmoc-(氨基甲基)苯氧基乙酰氨基-正亮氨酰基-甲基二苯甲基胺树脂，100-200目，Novabiochem，San Diego，CA)]加入到CS136自动肽合成仪(CS Bio，Inc.，San Carlos，CA)的反应容器中，并在DMF中溶胀约1小时。过滤树脂，并添加过量的20％溶于DMF的哌啶，并混合2分钟。过滤树脂，并再次添加过量的20％哌啶并混合20分钟，以确保完全除去树脂的Fmoc基团。在去保护之后，用DMF洗涤树脂4次，然后将首先被护的氨基酸，Fmoc-Nle(0.75mmol)、二异丙基碳二亚胺(DIC)(0.75mmol)和N-羟基苯并三唑一水合物(HOBt)(0.75mmol)全部溶解在DMF中，并加入到树脂中，混合(1h)，接着用DMF洗涤4次。
通过用20％哌啶/DMF溶液处理，再次除去Fmoc基团，使用相同的偶合剂，如实施例2中所述，偶合其余的氨基酸衍生物和2-溴乙酸。
实施例6氨甲喋呤-乙酰基-D-叔丁基-Ser-叔丁基-Ser-D-叔丁基-Ser-叔丁基-Ser-D-叔丁基-Ser-叔丁基-Ser-D-叔丁基-Ser-叔丁基-Ser-D-叔丁基-Tyr-D-叔丁基-Ser-Gln-Trp-Ala-Val-β-Ala-叔丁氧基羰基-His-Phe-Nle-Rink-酰胺-树脂的制备将实施例1制备的氨甲喋呤的二铯盐(0.75mmol)溶解在DMSO中，并在圆底烧瓶内，加入到实施例5制备的肽基树脂(0.25mmol)中。在水浴(40℃，18小时)中加热的同时，轻轻混合悬浮液、过滤并用大量DMF，接着用甲醇洗涤。在最后的过滤之后，空气干燥衍生的树脂过夜。
实施例7氨甲喋呤-乙酰基-D-Ser-Ser-D-Ser-Ser-D-Ser-Ser-D-Ser-Ser-Tyr-D-Ser-Gln-Trp-Ala-Val-β-Ala-His-Phe-Nle-NH2将实施例6制备的氨甲喋呤-肽树脂(0.25mmol)放置在圆底烧瓶内，向该圆底烧瓶内加入15ml含水(2.5％)、1，2-乙二硫醇(2.5％)和三异丙基硅烷(1％)的三氟乙酸(TFA)的溶液。搅拌该悬浮液(2h)、过滤并用TFA洗涤数次。真空蒸发TFA，并将醚加入到所得油中，得到黄色粉末。
通过制备型反相高压液相色谱(RP-hplc)，在C-18键合的氧化硅(Dynamax300，8μm)柱(21.4×250mm)上，纯化氨甲喋呤肽。使用流速为20ml/min的线性梯度洗脱体系由0.1％TFA组成的缓冲液A和缓冲液B、80％MeCN中的0.1％TFA；以1％/min增加20B％到50％B。在280nm处监控分离。收集通过分析hplc证明含纯产物的级分、真空浓缩并进行冻干。通过从含水乙酸中冻干，以恒重的絮状白色粉末形式获得肽。通过酸水解产物的氨基酸分析和基质辅助的激光解析质谱，证明确切组成。
实施例8细胞毒性剂-肽连接物对肿瘤细胞增殖的影响根据所述的方案(Progega Corporation，Madison，WI)，使用CellTiter 96细胞增殖试剂盒。在96孔的试剂盒平板的各孔内分别添加含各种浓度不同肽的培养基(50μl)，接着添加50μl含5000个培养的IMR-32肿瘤细胞的悬浮液。在湿化的5％二氧化碳气氛中，在37℃下温育该平板不同的时间，最多到且包括7天。将试剂盒的染色溶液(15μl)加入到各孔内，并在湿化的5％二氧化碳气氛中，在37℃下温育该平板4小时。4小时之后，向各孔中添加100μl溶解/终止溶液，并在37℃下继续温育1小时或更多，直到出现甲(formazan)晶体的完全溶解。然后使用96孔的平板读数器，在570nm的波长下，测量各孔溶液的吸光度。
实施例9促生长素抑制素类似物对大鼠垂体GH释放的体外作用这是评价SRIF类似物效力的主要系统，可认为是促生长素抑制素亚型2大鼠受体相关的系统，该系统还与人类亚型2的结合在组织学上相关。
使用无菌操作，通过胰蛋白酶/DNA酶方法，分散体重为200-250g并在控制的条件下(约0500-1900h的光照)饲养的成年雄性大鼠的垂体前叶。用无菌过滤的Duldecco的修饰Eagle培养基(MEM)(GibcoLaboratories，Grand Island，NY(GIBCO))稀释分散的细胞，其中所述培养基补加有2.5％胎牛血清(GIBCO)、3％马血清(GIBCO)、10％来自垂体供体的新鲜大鼠血清(在冰上储存不超过1小时)、1％MEM非必需氨基酸(GIBCO)、庆大霉素(10ng/ml，Sigma)和制霉菌素(10000U/ml，GIBCO)。使用血细胞计数器计数细胞(约2000000个细胞/垂体)并以200000个细胞/孔的密度随机铺板(Co-starcluster；Rochester Scientific Co.，Rochester，NY)。在95％的空气和5％的二氧化碳湿化的气氛中，在37℃下，在上述Duldecco培养基中维持铺板的细胞96小时。
在激素侵袭(challenge)用制剂中，用培养基199(GIBCO)洗涤细胞3次，除去旧培养基和飘浮的细胞。在一式四份的孔中，在总体积为1ml含1％BSA(级分V；Sigma Chemical Co.，St.，Louis，MO)的培养基199中，测试各剂量的促分泌素(在硅化试管中测试)。在刺激GH的1nM GRH(1-29)NH2存在下，用SS或SS类似物剂量对细胞加以脉冲。在空气/二氧化碳气氛(95％/5％)存在下，温育3小时后除去培养基并在20℃下储存，直到分析激素含量。通过标准的双抗体RIA法，使用由NIDDK和National Hormone and Pituitary Program供应的组分，测量在血浆和培养基内的GH。
实施例10O-苄基-D-Ser-O-苄基-D-Ser-O-苄基-D-Ser-O-苄基-D-Ser-O-苄基-D-Ser-L-Nle-O-2，6-二氯苄基-D-Tyr-O-苄基-D-Ser-S-4-甲基苄基-L-Cys-L-Phe-D-Trp-Nε-(2-氯苄氧基羰基)-L-Lys-O-苄基-L-Thr-S-4-甲基苄基-L-Cys-O-苄基-L-Thr-MBHA树脂的制备将甲基二苯甲基胺(MBHA)聚苯乙烯树脂(Bachem，Inc.，Torrance.CA)(0.25mmol)加入到CS136自动肽合成仪(CS Bio，Inc.，SanCarlos，CA)的反应容器中，并在二氯甲烷(DCM)中溶胀约1小时。过滤树脂，添加过量的10％二异丙基乙胺(DIPEA)，并混合2分钟。过滤树脂，并再次添加过量的10％DIPEA并混合5分钟，以确保完全中和树脂。在中和之后，用DCM洗涤树脂4次，然后将首先被保护的氨基酸，Boc-Thr(Bzl)-OH(0.75mmol)、二异丙基碳二亚胺(DIC)(0.75mmol)和N-羟基苯并三唑一水合物(HOBt)(0.75mmol)全部溶解在DMF中，并加入到树脂中，混合(1h)，接着用DCM洗涤4次。
通过添加过量的40％三氟乙酸(TFA)DCM除去tBOc基团并混合2分钟。过滤树脂，并再次添加过量的40％TFA，并混合20分钟，以确保N-端tBoc的完全除去。过滤树脂并添加过量的10％二异丙基乙胺(DIPEA)，混合2分钟。过滤树脂，并再次添加过量的10％DIPEA，并混合5分钟，以确保完全中和树脂。在中和之后，用DCM洗涤树脂4次。然后按照相同的通用偶合步骤，使下述氨基酸连续与生长肽链反应Boc-S-4-甲基苄基-L-半胱氨酸、Boc-O-苄基-L-苏氨酸、Nα-Boc-Nε-(2-氯苄氧基羰基)-L-赖氨酸、Boc-D-色氨酸、Boc-L-苯丙氨酸、Boc-S-4-甲基苄基-L-半胱氨酸、Boc-O-苄基-D-丝氨酸、Boc-O-2，6-二氯苄基-D-酪氨酸、Boc-正亮氨酸、Boc-O-苄基-D-丝氨酸、Boc-O-苄基-D-丝氨酸、Boc-O-苄基-D-丝氨酸、Boc-O-苄基-D-丝氨酸、Boc-O-苄基-D-丝氨酸。最后用甲醇洗涤树脂4次并静置过夜干燥。
实施例11D-Ser-D-Ser-D-Ser-D-Ser-D-Ser-L-正亮氨酸-D-Tyr-D-Ser-环[L-Cys-L-Phe-D-Trp-L-Lys-L-Thr-L-Cys]-L-Thr-NH2的制备将实施例10的肽基树脂与5ml苯甲醚一起放置在适于无水氟化氢操作的Teflon装置中。在醇/干冰浴中冷却反应容器5分钟，然后将35ml气体无水氟化氢(HFO冷凝到反应容器内。将该浴从干冰变化为常规的冰，并使之混合1小时，然后用氮气流将HF吹出反应容器。用过量乙醚沉淀肽3次并过滤。将过滤的粗肽溶解在60-90％的乙酸(250ml)中。在剧烈搅拌下逐滴添加甲醇中的碘的浓溶液，直到形成永久的褐色，此时，通过添加小量抗坏血酸除去过量碘。
在真空下，将溶液体积降低到约10ml，通过制备型反相高压液相色谱(RP-hplc)，在C-18键合的氧化硅(Dynamax300，8μm)柱(21.4×250mm)上，纯化粗肽。使用流速为20ml/min的线性梯度洗脱体系由0.1％TFA组成的缓冲液A和缓冲液B、80％MeCN中的0.1％TFA；以1％/min增加20B％到50％B。在280nm处监控分离。收集通过分析HPLC证明含纯产物的级分、真空浓缩并进行冻干。通过从含水乙酸中冻干，以恒重的絮状白色粉末形式获得肽。通过酸水解产物的氨基酸分析和基质辅助的激光解吸质谱，证明确切的组成。
实施例12D-Ser-D-Ser-D-Ser-D-Ser-D-Ser-L-Lys-3-125I-D-Tyr-D-Ser-环[L-Cys-L-Phe-D-Trp-L-Lys-L-Thr-L-Cys]-L-Thr-NH2的制备使用改进的氯胺T反应，碘化实施例11制备的肽。将磷酸盐缓冲液(200μl，0.05M)加入到含有20mCi125I的隔膜密封的小瓶内，和将它充当反应容器。一旦中和，将溶解在100μl磷酸盐缓冲液内的9.411×10-8mol肽注射到反应小瓶内。为了启动碘化反应，将在50μl缓冲液内的4.29×10-7mol氯胺T注射到反应小瓶内。快速涡旋反应容器15-20秒，然后通过注射50μl 4.3×10-6mol亚硫酸氢钠终止反应。
纯化使用C18 SepPak Lite柱体(Waters Corp.，Milford，Mass)，从反应物中纯化肽。通过用10ml无水乙醇，以1ml/min的流速洗涤，活化SepPak。然后用10ml水洗涤SepPak。然后将放射性反应混合物施加到SepPak上，接着用5％乙醇3×3ml洗涤反应容器。通过用10ml20％的乙醇洗涤SepPak，将肽从其余的反应物中分离出来。最后，使用80％在0.01N盐酸中的乙醇溶液，以250μl的等分试样从柱中洗脱出肽，并收集到2ml无菌的螺帽小瓶内。
实施例13O-苄基-D-Ser-O-苄基-D-Ser-O-苄基-D-Ser-O-苄基-D-Ser-O-苄基-D-Ser-O-苄基-D-Ser-O-苄基-D-Ser-O-苄基-D-Ser-O-苄基-D-Ser-O-苄基-D-Ser-Nε-(2-氯苄氧基羰基)-L-Lys-O-2，6-二氯苄基-L-Tyr-O-2，6-二氯苄基-L-Tyr-S-4-甲基苄基-L-Cys-L-Phe-D-Trp-Nε-(2-氯苄氧基羰基)-L-Lys-O-苄基-L-Thr-S-4-甲基苄基-L-Cys-O-苄基-L-Thr-MBHA树脂的制备将甲基二苯甲基胺(MBHA)聚苯乙烯树脂(Bachem，Inc.，Torrance.CA)(0.25mmol)加入到CS136自动肽合成仪(CS Bio，Inc.，SanCarlos，CA)的反应容器中，并在二氯甲烷(DCM)中溶胀约1小时。过滤树脂，并添加过量的10％二异丙基乙胺(DIPEA)，并混合2分钟。过滤树脂，并再次添加过量的10％DIPEA并混合5分钟，以确保完全中和树脂。在中和之后，用DCM洗涤树脂4次，然后将首先被保护的氨基酸，Boc-Thr(Bzl)-OH(0.75mmol)、二异丙基碳二亚胺(DIC)(0.75mmol)和N-羟基苯并三唑一水合物(HOBt)(0.75mmol)全部溶解在DMF中，并加入到树脂中，混合(1h)，接着用DCM洗涤4次。
通过添加过量的40％三氟乙酸(TFA)DCM除去tBOc基团并混合2分钟。过滤树脂，并再次添加过量的40％TFA，并混合20分钟，以确保N-端tBoc的完全除去。过滤树脂并添加过量的10％二异丙基乙胺(DIPEA)，混合2分钟。过滤树脂，并再次添加过量的10％DIPEA，并混合5分钟，以确保完全中和树脂。在中和之后，用DCM洗涤树脂4次。然后按照相同的通用偶合步骤，使下述氨基酸连续与生长肽链反应Boc-S-4-甲基苄基-L-半胱氨酸、Boc-O-苄基-L-苏氨酸、Nα-Boc-Nε-(2-氯苄氧基羰基)-L-赖氨酸、Boc-D-色氨酸、Boc-L-苯丙氨酸、Boc-S-4-甲基苄基-L-半胱氨酸、Boc-O-2，6-二氯苄基-D-酪氨酸、Boc-O-2，6-二氯苄基-D-酪氨酸、Nα-Boc-Nε-(2-氯苄氧基羰基)-L-赖氨酸、Boc-O-苄基-D-丝氨酸、Boc-O-苄基-D-丝氨酸、Boc-O-苄基-D-丝氨酸、Boc-O-苄基-D-丝氨酸、Boc-O-苄基-D-丝氨酸、Boc-O-苄基-D-丝氨酸、Boc-O-苄基-D-丝氨酸、Boc-O-苄基-D-丝氨酸、Boc-O-苄基-D-丝氨酸、Boc-O-苄基-D-丝氨酸。使用如上所述的相同的通用步骤，除去最后的Boc基团，中和肽，并洗涤。
实施例14DOTA-O-苄基-D-Ser-O-苄基-D-Ser-O-苄基-D-Ser-O-苄基-D-Ser-O-苄基-D-Ser-O-苄基-D-Ser-O-苄基-D-Ser-O-苄基-D-Ser-O-苄基-D-Ser-O-苄基-D-Ser-Nε-(2-氯苄氧基羰基)-L-Lys-O-2，6-二氯苄基-L-Tyr-O-2，6-二氯苄基-L-Tyr-S-4-甲基苄基-L-Cys-L-Phe-D-Trp-Nε-(2-氯苄氧基羰基)-L-Lys-O-苄基-L-Thr-S-4-甲基苄基-L-Cys-O-苄基-L-Thr-MBHA树脂的制备为了将DOTA偶合到生长链的游离氨基上，其中DOTA在有机溶剂，包括单独的DMF和DMSO中很难溶，使用已知新型方法，该方法利用令人预料不到的HOBt增溶效果。首先，将5mmol HOBT溶解在含有50-75ml DMSO的烧杯中，然后加入1.25mmol DOTA，并剧烈混合悬浮液，直到DOTA进入溶液中。将DIC(1.25mmol)加入到烧杯中，将该混合物加入到肽基树脂内，混合过夜，然后用DMF洗涤4次，用甲醇洗涤4次。
实施例15DOTA-D-Ser-D-Ser-D-Ser-D-Ser-D-Ser-D-Ser-D-Ser-D-Ser-D-Ser-D-Ser-L-Lys-D-Tyr-D-Tyr-环[L-Cys-L-Phe-D-Trp-L-Lys-L-Thr-L-Cys]-L-Thr-NH2的制备使用实施例12中所述的液体HF，进行从树脂中裂解实施例14中所述的被保护肽树脂并除去侧链保护基。然后，同样如实施例12中所述环化并纯化游离肽。
实施例16D-O-苄基-Ser-O-苄基-Ser-D-O-苄基-Ser-O-苄基-Ser-D-O-苄基-Ser-O-苄基-Ser-D-O-苄基-Ser-O-苄基-Ser-D-O-二氯苄基-Tyr-D-O-苄基-Ser-Gln-Trp-Ala-Val-β-Ala-甲苯磺酰基-His-Phe-Nle-MBHA树脂的制备如实施例13所述，将甲基二苯甲基胺(MBHA)聚苯乙烯树脂(Bachem，Inc.，Torrance.CA)(0.25mmol)加入到CS136自动肽合成仪(CS Bio，Inc.，San Carlos，CA)的反应容器中，并通过连续添加氨基酸衍生物组装肽。
实施例17D-Ser-Ser-D-Ser-Ser-D-Ser-Ser-D-Ser-Ser-D-Tyr-D-Ser-Gln-Trp-Ala-Val-β-Ala-His-Phe-Nle-NH2如实施例12中所述，使用液体HF，进行从树脂中裂解实施例16中所述的被保护肽树脂并除去侧链保护基。然后，同样如实施例12中所述纯化游离肽。
实施例18铃蟾肽激动剂类似物对豚鼠胰腺腺泡细胞淀粉酶释放的体外影响将来自一只豚鼠胰腺的分散腺泡悬浮在150ml标准培养溶液中，并在37℃下培养样品(250ml)30分钟，通过Phadebas试剂方法测定淀粉酶的释放。淀粉酶释放计算为在培养过程中，培养开始时腺泡中淀粉酶的活性释放到胞外培养基内的百分比。在各种浓度下培养各种浓度的铃蟾肽标准物和类似物，以便测定一半的最大刺激值(EC50)。
实施例19125I标记的JF-08-73(琥珀酸酯-D-Asp-D-Ser-D-Ser-D-Ser-D-Ser-D-Ser-D-Asp-D-Ser-D-Ser-D-Ser-D-Ser-D-Ser-L-Lys-D-Tyr-D-Tyr-环[L-Cys-L-Phe-D-Trp-L-Lys-L-Thr-L-Cys]-L-Thr-NH2)和JF-08053(D-Ser-D-Ser-D-Ser-D-Ser-D-Ser-L-Lys-D-Tyr-D-Ser-环[L-Lys-L-Phe-D-Trp-L-Lys-L-Thr-L-Cys]-L-Thr-NH2)的生物分布如实施例12所述，放射性标记肽。用磷酸盐缓冲盐水稀释含最高量放射性肽的第二个螺帽小瓶，实现小于3％乙醇的最终浓度。将溶液分成不超过2ml的三等份并腹膜内注射到各大鼠体内。在吸收垫上收集尿和粪便过夜。在24小时时，杀死大鼠，解剖并称量每一个下面的器官并在剂量定标器内计数。结果见表2。
实施例20硫代秋水仙碱的制备将秋水仙碱(1.25mmol)溶解在已加入了甲巯酸钠(7.13mmol)的10.0ml水中。搅拌黄色溶液24小时，然后用ETOH∶氯仿(1∶1)萃取2次，然后蒸发，得到黄色晶体的所需化合物。
实施例21脱乙酰基硫代秋水仙碱的制备向实施例1的产物中加入5.0ml甲醇和5.0ml2N盐酸，并在干燥氮气下使溶液回流18小时。蒸馏掉甲醇，残留溶液用氢氧化钠再中和，用氯仿萃取3次、蒸发，最后从乙腈/水中冻干，得到黄色粉末。
实施例22脱乙酰基硫代秋水仙碱-3-硫代二丙酰基-Nε-(2-氯苄氧基羰基)-L-Lys-O-苄基-D-Ser-O-苄基-D-Ser-O-苄基-D-Ser-O-苄基-D-Ser-O-苄基-D-Ser-O-苄基-D-Ser-O-苄基-D-Ser-O-苄基-D-Ser-O-苄基-D-Ser-O-苄基-D-Ser-L-Nle-O-2，6-二氯苄基-D-Tyr-O-苄基-D-Ser-S-4-甲基苄基-L-Cys-L-Phe-D-Trp-Nε-(2-氯苄氧基羰基)-L-Lys-O-苄基-L-Thr-S-4-甲基苄基-L-Cys-O-苄基-L-Thr-MBHA树脂的制备将甲基二苯甲基胺(MBHA)聚苯乙烯树脂(Bachem，Inc.，Torrance.CA)(0.25mmol)加入到CS136自动肽合成仪(CS Bio，Inc.，SanCarlos，CA)的反应容器中，并在二氯甲烷(DCM)中溶胀约1小时。过滤树脂，并添加过量的10％二异丙基乙胺(DIPEA)，并混合2分钟。过滤树脂，并再次添加过量的10％DIPEA并混合5分钟，以确保完全中和树脂。在中和之后，用DCM洗涤树脂4次，然后将首先被保护的氨基酸，Boc-Thr(Bzl)-OH(0.75mmol)、二异丙基碳二亚胺(DIC)(0.75mmol)和N-羟基苯并三唑一水合物(HOBt)(0.75mmol)全部溶解在DMF中，并加入到树脂中，混合(1h)，接着用DCM洗涤4次。
通过添加过量的40％三氟乙酸(TFA)DCM除去tBOc基团并混合2分钟。过滤树脂，并再次添加过量的40％TFA，并混合20分钟，以确保N-端tBoc的完全除去。过滤树脂并添加过量的10％二异丙基乙胺(DIPEA)，混合2分钟。过滤树脂，并再次添加过量的10％DIPEA，并混合5分钟，以确保完全中和树脂。在中和之后，用DCM洗涤树脂4次。然后按照相同的通用偶合步骤，使下述氨基酸连续与生长肽链反应Boc-S-4-甲基苄基-L-半胱氨酸、Boc-O-苄基-L-苏氨酸、Nα-Boc-Nε-(2-氯苄氧基羰基)-L-赖氨酸、Boc-D-色氨酸、Boc-L-苯丙氨酸、Boc-S-4-甲基苄基-L-半胱氨酸、Boc-O-苄基-D-丝氨酸、Boc-O-2，6-二氯苄基-D-酪氨酸、Boc-正亮氨酸、Boc-O-苄基-D-丝氨酸、Boc-O-苄基-D-丝氨酸、Boc-O-苄基-D-丝氨酸、Boc-O-苄基-D-丝氨酸、Boc-O-苄基-D-丝氨酸、Boc-O-苄基-D-丝氨酸、Boc-O-苄基-D-丝氨酸、Boc-O-苄基-D-丝氨酸、Boc-O-苄基-D-丝氨酸、Boc-O-苄基-D-丝氨酸、Nα-Boc-Nε-(2-氯苄氧基羰基)-L-赖氨酸、3-硫代二丙酸，和最后在没有进行tBoc去保护步骤的情况下，在DCM/Dic中偶合脱乙酰基硫代秋水仙碱。最后用甲醇洗涤树脂4次并静置过夜干燥。
实施例23脱乙酰基硫代秋水仙碱-3-硫代二丙酰基-D-Ser-D-Ser-D-Ser-D-Ser-D-Ser-D-Ser-D-Ser-D-Ser-D-Ser-D-Ser-L-正亮氨酸-D-Tyr-D-Ser-环[L-Lys-L-Phe-D-Trp-L-Lys-L-Thr-L-Cys]-L-Thr-NH2的制备将实施例10的肽基树脂与5ml苯甲醚一起放置在适于无水氟化氢操作的Teflon装置中。在醇/干冰浴中冷却反应容器5分钟，然后将35ml气体无水氟化氢(HFO冷凝到反应容器内。将该浴从干冰变化为常规的冰，并使之混合1小时，然后用氮气流将HF吹出反应容器。用过量乙醚沉淀肽3次并过滤。将过滤的粗肽溶解在60-90％的乙酸(250ml)中。在剧烈搅拌下逐滴添加甲醇中的碘的浓溶液，直到形成永久的褐色，此时，通过添加小量抗坏血酸除去过量碘。
在真空下，将溶液体积降低到约10ml，通过制备型反相高压液相色谱(RP-hplc)，在C-18键合的氧化硅(Dynamax300，8μm)柱(21.4×250mm)上，纯化粗肽。使用流速为20ml/min的线性梯度洗脱体系由0.1％TFA组成的缓冲液A和缓冲液B、80％MeCN中的0.1％TFA；以1％/min增加20B％到50％B。在280nm处监控分离。收集通过分析HPLC证明含纯产物的级分、真空浓缩并进行冻干。通过从含水乙酸中冻干，以恒重的絮状白色粉末形式获得肽。通过酸水解产物的氨基酸分析和基质辅助的激光解吸质谱，证明确切的组成。
实施例24喜树碱的酰氯的制备在100mlRB烧瓶中，将喜树碱(0.574mmol)悬浮在30ml无水DCM中。在0℃下，在干燥氮气中，在20分钟内，向该浆液中添加溶解在20ml无水DCM内的DMAP(2.455mmol)。将光气(0.965mmol)加入到该浆液中，并在0℃下混合30分钟和在室温下混合2小时。蒸发过量的光气和二氯甲烷，喜树碱的酰氯溶解在二氯甲烷中。
实施例25喜树碱-羰基-Sar-D-叔丁基-Ser-正亮氨酸-D-叔丁基-Tyr-D-叔丁基-Ser-S-三苯甲基-Cys-Phe-D-Trp-ε-叔T氧基羰基-Lys-叔丁基-Thr-S-三苯甲基-Cys-叔丁基-Thr-Rink-酰胺树脂的制备将Rink-酰胺MBHA聚苯乙烯树脂(0.063mmol)[4-(2′，4′-二甲氧基苯基-Fmoc-(氨基甲基)苯氧基乙酰氨基-正亮氨酰基-甲基二苯甲基胺树脂，100-200目，Novabiochem，San Diego，CA)]加入到CS136自动肽合成仪(CS Bio，Inc.，San Carlos，CA)的反应容器中，并在DMF中溶胀约1小时。过滤树脂，并添加过量的20％溶于DMF的哌啶，并混合2分钟。过滤树脂，并再次添加过量的20％哌啶并混合20分钟，以确保完全除去树脂的Fmoc基团。在去保护之后，用DMF洗涤树脂4次，然后将首先被保护的氨基酸，Fmoc-Thr(tBut)(0.188mmol)、二异丙基碳二亚胺(DIC)(0.188mmol)和N-羟基苯并三唑一水合物(HOBt)(0.188mmol)全部溶解在DMF中，并加入到树脂中，混合(1h)，接着用DMF洗涤4次。
通过用20％哌啶/DMF溶液处理，再次除去Fmoc基团，接着进行相同的通用偶合步骤，使下述氨基酸连续与生长肽链反应Fmoc-S-三苯甲基-L-半胱氨酸、Fmoc-O-叔丁基-L-苏氨酸-Nα-Fmoc-Nε-Boc-L-赖氨酸、Nα-Fmoc-Nin-Boc-D-色氨酸、Fmoc-L-苯丙氨酸、Fmoc-S-三苯甲基-L-半胱氨酸、Fmoc-O-叔丁基-D-丝氨酸、Fmoc-O-叔丁基-D-酪氨酸、Nα-Fmoc-正亮氨酸、Fmoc-O-叔丁基-D-丝氨酸、Fmoc-肌氨酸。在除去最终的Fmoc基团之后，将实施例24的喜树碱酰氯加入到树脂中，并混合过夜，用大量DMF，然后用甲醇洗涤。在最后的过滤之后，空气干燥衍生化的树脂过夜。
实施例26
喜树碱-羰基-Sar-D-Ser-Nle-D-Tyr-D-Ser-环[Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys]-Thr-酰胺的制备将实施例25制备的喜树碱-肽树脂(0.063mol)放置在圆底烧瓶内，向该圆底烧瓶中加入15ml含水(2.5％)、1，2-乙二硫醇(2.5％)和三异丙基硅烷(1％)的三氟乙酸(TFA)溶液。搅拌该悬浮液(2h)、过滤并用TFA洗涤数次。真空蒸发TFA，并将醚加入到所得油中，得到黄色粉末，然后将该黄色粉末溶解在60％醋酸(250ml)中。在剧烈搅拌下逐滴添加碘在甲醇中的浓溶液，直到形成永久的褐色，此时，通过添加小量抗坏血酸除去过量碘。
在真空下，将溶液体积降低到约10ml，通过制备型反相高压液相色谱(RP-hplc)，在C-18键合的氧化硅(Dynamax300，8μm)柱(21.4×250mm)上，纯化粗的喜树碱肽。使用流速为20ml/min的线性梯度洗脱体系由0.1％TFA组成的缓冲液A和缓冲液B、80％MeCN中的0.1％TFA；以1％/min增加20B％到50％B。在280nm处监控分离。收集通过分析hplc证明含纯产物的级分、真空浓缩并进行冻干。通过从含水乙酸中冻干，以恒重的絮状白色粉末形式获得肽。通过酸水解产物的氨基酸分析和基质辅助的激光解吸质谱，证明确切组成。
表1各种促生长素抑制素类似物的连接物抑制从大鼠的垂体细胞的原代培养物中释放GH的能力。为了比较，天然的促生长素抑制素-14的IC50值为0.15nM(ND＝未进行)。
表1(续)
表1(续)
其它实施方案尽管参考优选的实施方案描述了本发明，但本领域的技术人员可容易地确认它的主要特征，并且在没有脱离其精神与范围的情况下，可对本发明作出各种变化和改进，使之适合于各种用途和疾病。本领域的技术人员将意识到或能够确认使用仅仅常规实验，得到此处所述的本发明具体实施方案的许多等同方案。这种等同方案拟包括在本发明的范围内。
在此引入在说明书中提及的所有出版物、专利和申请作为参考。
序列表<110>图兰恩教育基金管理人等<120>诊断或治疗性促生长素抑制素或铃蟾肽类似物的连接物及其用途<130>07005/005WO1<150>US 60/323,851<151>2001-09-21<160>35<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>4<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>变体<222>2<223>Xaa＝Nle<223>合成的<400>1Ser Xaa Ser Ser1<210>2<211>4<212>PRT<213>人工序列<220>
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<223>合成的<400>3Ser Lys Tyr Tyr1<210>4<211>4<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成的<400>4Ser Lys Tyr Ser1<210>5<211>4<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成的<400>5Ser Ser Lys Ser1<210>6<211>4<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>变体<222>2<223>Xaa＝Nle
<223>合成的<400>6Ser Xaa Tyr Ser1<210>7<211>4<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>变体<222>2<223>Xaa＝Pal<223>合成的<400>7Ser Xaa Tyr Ser1<210>8<211>4<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成的<400>8Ser Thr Tyr Ser1<210>9<211>3<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成的<400>9Lys Ser Ser
1<210>10<211>3<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成的<400>10Ser Lys Ser1<210>11<211>3<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>变体<222>1<223>Xaa＝Nle<223>合成的<400>11Xaa Tyr Ser1<210>12<211>3<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成的<400>12Lys Tyr Ser1<210>13<211>3
<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>变体<222>1<223>Xaa＝Pal<223>合成的<400>13Xaa Lys Ser1<210>14<211>3<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成的<400>14Thr Tyr Ser1<210>15<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>变体<222>1<223>Xaa＝Gln，Asn，Nle，或Nva.
<221>变体<222>3<223>Xaa＝Ava，Gly，Leu，Val，Ile，Nle，或Nva.
<221>变体<222>4<223>Xaa＝BAla，4Abu，Gly，Ala，D-Ala，N-Me-Ala，或N-Me-D-Ala.
<221>变体
<222>6<223>Xaa＝Phe，Tyr，4-氯-Phe，4-氟-Phe，4-溴-Phe，4-NO2-Phe，Ala，Gly，Leu，Val，Ile，Nle，或Nva.
<221>变体<222>7<223>Xaa＝Met，Phe，Tyr，4-氯-Phe，4-氟-Phe，4-溴-Phe，4-NO2-Phe，Ala，Gly，Leu，Val，Ile，Nle，或Nva.
<221>变体<222>8<223>酰胺或烷基酰胺.
<221>变体<222>(9)...(9)<223>9号位置上的Xaa是Ava，Gly，Leu，Val，Ile，Nle，或Nva.
<221>变体<222>(10)...(10)<223>10号位置上的Xaa是Ava，Gly，Leu，Val，Ile，Nle，Nva，或低级烷基酰胺.
<223>合成的<400>15Xaa Trp Xaa Xaa His Xaa Xaa Xaa Xaa1 5<210>16<211>15<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成的<221>变体<222>16<223>Xaa＝Nle.
<221>MOD RES<222>(9)...(14)<223>9号和14号位置上的Cys是环化的.
<400>16Ser Ser Ser Ser Ser Xaa Tyr Ser Cys Phe Trp Lys Thr Cys Thr
1 5 10 15<210>17<211>22<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成的<221>MOD RES<222>(16)...(21)<223>16号和21号位置上的Cys是环化的.
<400>17Asp Ser Ser Ser Ser Ser Asp Ser Ser Ser Ser Ser Lys Tyr Tyr Cys1 5 10 15Phe Trp Lys Thr Cys Thr20<210>18<211>15<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成的<221>MOD_RES<222>(9)...(14)<223>9号和14号位置上的Cys是环化的.
<400>18Ser Ser Ser Ser Ser Lys Tyr Ser Cys Phe Trp Lys Thr Cys Thr1 5 10 15<210>19<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成的<400>19
Lys Tyr Lys Tyr Lys Cys Phe Trp Lys Thr Cys Thr1 5 10<210>20<211>15<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成的<400>20Ser Ser Ser Ser Ser Lys Tyr Tyr Cys Phe Trp Lys Thr Cys Thr1 5 10 15<210>21<211>19<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成的<400>21Leu Ala Leu Ala Ser Ser Ser Ser Ser Lys Tyr Ser Cys Phe Trp Lys1 5 10 15Thr Cys Thr<210>22<211>15<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成的<221>MOD_RES<222>(9)...(14)<223>9号和14号位置上的Cys是环化的.
<400>22Ser Ser Ser Ser Ser Lys Tyr Tyr Cys Phe Trp Lys Thr Cys Thr1 5 10 15
<210>23<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成的<221>变体<222>15<223>Xaa＝BAla<221>变体<222>18<223>Xaa＝Nle<400>23Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ser Gln Trp Ala Val Xaa His1 5 10 15Phe Xaa<210>24<211>21<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成的<221>变体<222>12<223>Xaa＝Nle<221>MOD_RES<222>(15)...(20)<223>15号和20号位置上的Cys是环化的.
<400>24Lys Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Xaa Tyr Ser Cys Phe1 5 10 15Trp Lys Thr Cys Thr20<210>25
<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成的<221>变体<222>1<223>Xaa＝Sar<221>变体<222>3<223>Xaa＝Nle<221>MOD_RES<222>(6)...(11)<223>6号和11号位置上的Cys是环化的.
<400>25Xaa Ser Xaa Tyr Ser Cys Phe Trp Lys Thr Cys Thr1 5 10<210>26<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成的<221>变体<222>3<223>Xaa＝Nle<221>MOD_RES<222>(6)...(11)<223>6号和11号位置上的Cys是环化的.
<400>26Pro Ser Xaa Tyr Ser Cys Phe Trp Lys Thr Cys Thr1 5 10<210>27<211>12<212>PRT
<213>人工序列<220>
<223>合成的<221>变体<222>1<223>Xaa＝羟基<221>变体<222>3<223>Xaa＝Nle<221>MOD_RES<222>(6)...(11)<223>6号和11号位置上的Cys是环化的.
<400>27Xaa Ser Xaa Tyr Ser Cys Phe Trp Lys Thr Cys Thr1 5 10<210>28<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成的<221>MOD_RES<222>(1)...(6)<223>1号和6号位置上的Cys是环化的.
<400>28Cys Phe Trp Lys Thr Cys1 5<210>29<211>15<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成的<221>变体
<222>6<223>Xaa＝Nle<400>29Ser Ser Ser Ser Ser Xaa Tyr Ser Cys Phe Trp Lys Thr Cys Thr1 5 10 15<210>30<211>15<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成的<221>变体<222>6<223>Xaa＝Nle<221>MOD_RES<222>(9)...(14)<223>9号和14号位置上的Cys是环化的.
<400>30Ser Ser Ser Ser Ser Lys Tyr Ser Cys Phe Trp Lys Thr Cys Thr1 5 10 15<210>31<211>20<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成的<400>31Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Lys Tyr Tyr Cys Phe Trp1 5 10 15Lys Thr Cys Thr20<210>32<211>20<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>合成的<221>变体<222>18<223>Xaa＝Nle<221>MOD_RES<222>(14)...(19)<223>14号和19号位置上的Cys是环化的.
<400>32Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Lys Tyr Tyr Cys Phe Trp1 5 10 15Lys Thr Cys Thr20<210>33<211>21<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成的<221>变体<222>12<223>Xaa＝Nle<400>33Lys Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Xaa Tyr Ser Cys Phe1 5 10 15Trp Lys Thr Cys Thr20<210>34<211>20<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成的<221>变体<222>11
<223>Xaa＝Nle<221>MOD_RES<222>(14)...(19)<223>14号和19号位置上的Cys是环化的.
<400>34Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Xaa Tyr Ser Cys Phe Trp1 5 10 15Lys Thr Cys Thr20<210>35<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成的<221>变体<222>1<223>Xaa＝Sar<221>变体<222>3<223>Xaa＝Nle<400>35Xaa Ser Xaa Tyr Ser Cys Phe Trp Lys Thr Cys Thr1 5 10权利要求
1.具有下式的肽试剂X-Y-Z-Q，其中X选自细胞毒性剂、治疗剂、可检测的标记物或螯合基团或省去；Y是增加所述试剂的亲水生物分布的肽、含连接X的接头的亲水聚合物，或省去；Q是具有生物活性的肽；且Z是连接肽，当在Q的N-端或相容侧链氨基处键合到Q上时，它保持至少50％Q的生物活性；Z具有下式A-B-C-E-F，其中A是D-Lys、D-Tyr、D-Ser或L-Ser，或省去；B是D-Lys或D-Tyr，或省去；C是Lys、Ser、hSer、Thr、Nle、Abu、Nva、(2，3或4)3-吡啶基-Ala(Pal)、Orn、Dab、Dap、4-NH2-Phe、D-4-OH-Pro或L-4-OH-Pro，或省去；E是D-Lys、D-Tyr、D-Ser、D-4-OH-Pro、L-4-OH-Pro、3-碘-D-Tyr、3，5-二碘-D-Tyr、3-砹-D-Tyr、3，5-二砹-D-Tyr、3-溴-D-Tyr、3，5-二溴-D-Tyr、D-Asn、L-Asn、D-Asp、L-Asp、D-Glu、L-Glu、D-Gln或L-Gln；且F是D-Lys、D-Tyr、D-Ser、L-Ser、D-4-OH-Pro、L-4-OH-Pro、3-碘-D-Tyr、3，5-二碘-D-Tyr、3-砹-D-Tyr、3，5-二砹-D-Tyr、3-溴-D-Tyr、3，5-二溴-D-Tyr、D-Asn、L-Asn、D-Asp、L-Asp、D-Glu、L-Glu、D-Gln或L-Gln；条件是若A、B、C和E分别是Tyr、Tyr、Lys和Tyr，则F不是Lys；且若A、B、C和E分别是Lys、Tyr、Lys和Tyr，则F不是Tyr或Lys；且若省去A和B，并且C与E分别是Lys和Tyr，则F不是Tyr或Lys。
2.具有下式的肽试剂X-Y-Z-Q，其中X是细胞毒性剂或治疗剂；Y是增加所述试剂亲水分布的肽、含连接X的接头的亲水聚合物，或省去；Q是具有生物活性的肽；且Z是连接肽，当在Q的N-端或相容侧链氨基处键合到Q上时，它保持至少50％Q的生物活性，其中Z具有下式A-B-C-E-F，其中A是D-Lys、D-Tyr、D-Ser或L-Ser，或省去；B是D-Lys或D-Tyr，或省去；C是Lys、Ser、hSer、Thr、Nle、Abu、Nva、(2，3或4)3-吡啶基-Ala(Pal)、Orn、Dab、Dap、4-NH2-Phe、D-4-OH-Pro或L-4-OH-Pro，或省去；E是D-Lys、D-Tyr、D-Ser、D-4-OH-Pro、L-4-OH-Pro、3-碘-D-Tyr、3，5-二碘-D-Tyr、3-砹-D-Tyr、3，5-二砹-D-Tyr、3-溴-D-Tyr、3，5-二溴-D-Tyr、D-Asn、L-Asn、D-Asp、L-Asp、D-Glu、L-Glu、D-Gln或L-Gln；且F是D-Lys、D-Tyr、D-Ser、L-Ser、D-4-OH-Pro、L-4-OH-Pro、3-碘-D-Tyr、3，5-二碘-D-Tyr、3-砹-D-Tyr、3，5-二砹-D-Tyr、3-溴-D-Tyr、3，5-二溴-D-Tyr、D-Asn、L-Asn、D-Asp、L-Asp、D-Glu、L-Glu、D-Gln或L-Gln；条件是若A、B、C和E分别是Tyr、Tyr、Lys和Tyr，则F不是Lys；且若A、B、C和E分别是Lys、Tyr、Lys和Tyr，则F不是Tyr或Lys；且若省去A和B，并且C与E分别是Lys和Tyr，则F不是Tyr或Lys。
3.权利要求2的肽试剂，其中Y是增加所述试剂亲水生物分布的肽。
4.权利要求3的肽试剂，其中Y具有下式U(V-V)n，其中U是D-Pro、L-Pro、D-4-OH-Pro、L-4-OH-Pro、Sar或(NH2-(CH2)m-COOH)，其中m＝2-10，包括2和10，或省去；各V独立地选自D-Ser、L-Ser、D-Thr、L-Thr、D-Gln、L-Gln、D-Asn、L-Asn、D-4-OH-Pro和L-4-OH-Pro；且n是1-50的整数，包括1和50。
5.权利要求4的肽试剂，其中各V独立地为D-Ser或L-Ser。
6.权利要求2的肽试剂，其中Y是亲水聚合物。
7.权利要求6的肽试剂，其中Y是聚乙二醇、聚醋酸乙烯酯、聚乙烯醇、HPMA(N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺)或HPMA共聚物、α，β-聚(N-羟乙基)-DL-天冬酰胺(PHEA)或α，β-聚(N-羟丙基)-DL-天冬酰胺。
8.权利要求2的肽试剂，其中X是细胞毒性剂。
9.权利要求8的肽试剂，其中X是抗代谢剂。
10.权利要求8的肽试剂，其中X是氨甲喋呤。
11.权利要求8的肽试剂，其中X选自下述化合物及其衍生物阿霉素、甲氨蝶呤、喜树碱、高喜树碱、rhizoxins、dolistatins、紫杉醇和maytansinoids。
12.权利要求2的肽试剂，其中Q是促生长素抑制素肽。
13.权利要求2的肽试剂，其中Q是铃蟾肽。
14.权利要求2的肽试剂，其中Z是D-Ser-Lys-D-Tyr-D-Tyr。
15.权利要求2的肽试剂，其中Z是D-Ser-Lys-D-Tyr-D-Ser。
16.权利要求2的肽试剂，其中Z是D-Ser-Ser-D-Lys-D-Ser。
17.权利要求2的肽试剂，其中Z是D-Ser-Ser-D-Lys-Ser。
18.权利要求2的肽试剂，其中Z是D-Ser-Nle-D-Tyr-D-Ser。
19.权利要求2的肽试剂，其中Z是D-Ser-Pal-D-Tyr-D-Ser。
20.权利要求2的肽试剂，其中Z是D-Ser-Thr-D-Tyr-D-Ser。
21.一种治疗疾病的方法，它包括给患有所述疾病的受实验者施用治疗有效量的肽试剂，该肽试剂具有下式X-Y-Z-Q，其中X是细胞毒性剂或治疗剂；Y是增加所述试剂的亲水生物分布的肽、含连接X的接头的亲水聚合物，或省去；Q是具有生物活性的肽；且Z是连接肽，当在Q的N-端或相容侧链氨基处键合到Q上时，它保持至少50％Q的生物活性；Z具有下式A-B-C-E-F，其中A是D-Lys、D-Tyr、D-Ser或L-Ser，或省去；B是D-Lys或D-Tyr，或省去；C是Lys、Ser、hSer、Thr、Nle、Abu、Nva、(2，3或4)3-吡啶基-Ala(Pal)、Orn、Dab、Dap、4-NH2-Phe、D-4-OH-Pro或L-4-OH-Pro，或省去；E是D-Lys、D-Tyr、D-Ser、D-4-OH-Pro、L-4-OH-Pro、3-碘-D-Tyr、3，5-二碘-D-Tyr、3-砹-D-Tyr、3，5-二砹-D-Tyr、3-溴-D-Tyr、3，5-二溴-D-Tyr、D-Asn、L-Asn、D-Asp、L-Asp、D-Glu、L-Glu、D-G ln或L-Gln；且F是D-Lys、D-Tyr、D-Ser、L-Ser、D-4-OH-Pro、L-4-OH-Pro、3-碘-D-Tyr、3，5-二碘-D-Tyr、3-砹-D-Tyr、3，5-二砹-D-Tyr、3-溴-D-Tyr、3，5-二溴-D-Tyr、D-Asn、L-Asn、D-Asp、L-Asp、D-Glu、L-Glu、D-Gln或L-Gln；条件是若A、B、C和E分别是Tyr、Tyr、Lys和Tyr，则F不是Lys；且若A、B、C和E分别是Lys、Tyr、Lys和Tyr，则F不是Tyr或Lys；且若省去A和B，并且C与E分别是Lys和Tyr，则F不是Tyr或Lys。
22.权利要求21的方法，其中Y是增加所述试剂亲水生物分布的肽。
23.权利要求21的方法，其中Y具有下式U(V-V)n，其中；U是D-Pro、L-Pro、D-4-OH-Pro、L-4-OH-Pro、Sar或(NH2-(CH2)m-COOH)，其中m＝2-10，包括2和10，或省去；各V独立地选自D-Ser、L-Ser、D-Thr、L-Thr、D-Gln、L-Gln、D-Asn、L-Asn、D-4-OH-Pro和L-4-OH-Pro；和n是1-50的整数，包括1和50。
24.权利要求23的方法，其中各V独立地为D-Ser或L-Ser。
25.权利要求21的方法，其中Y是亲水聚合物。
26.权利要求25的方法，其中Y是聚乙二醇、聚醋酸乙烯酯或聚乙烯醇。
27.权利要求21的方法，其中X是细胞毒性剂。
28.权利要求27的方法，其中X是抗代谢剂。
29.权利要求27的方法，其中X是喜树碱。
30.权利要求27的方法，其中X选自下述化合物及其衍生物阿霉素、甲氨蝶呤、喜树碱、高喜树碱、硫代秋水仙碱、秋水仙碱、combretastatins和combretastin A-4、rhizoxin、rhizoxin-d、dolistatins、紫杉醇、安丝菌素p3和maytansinoids。
31.权利要求21的方法，其中Q是促生长素抑制素肽。
32.权利要求21的方法，其中Q是铃蟾肽。
33.权利要求21的方法，其中Z是Nle-D-Tyr-D-Ser。
34.权利要求21的方法，其中Z是Lys-D-Tyr-D-Ser。
35.权利要求21的方法，其中Z是Pal-D-Lys-D-Ser。
36.权利要求21的方法，其中Z是Thr-D-Tyr-D-Ser。
37.权利要求21的方法，其中疾病选自肺、乳腺、脑、眼、前列腺或结肠的肿瘤，或神经内分泌来源的肿瘤，和血管发生性血管。
38.具有下式的肽试剂X-Y-Z-Q，其中X是可检测的标记物、螯合基团，或省去；Y是增加所述试剂的亲水生物分布的肽、含连接X的接头的亲水聚合物，或省去；Q是具有生物活性的肽；且Z是连接肽，当在Q的N-端或相容侧链氨基处键合到Q上时，它保持至少50％Q的生物活性；Z具有下式C-E-F，其中C是Lys、Orn、Dab、Dap、4-NH2-Phe、Nle、Ser、hSer、Abu、Nva、D-4-OH-Pro或L-4-OH-Pro，或省去；E和F独立地选自D-Lys、D-Tyr、D-Ser、D-4-OH-Pro、L-4-OH-Pro、3-碘-D-Tyr、3，5-二碘-D-Tyr、3-溴-D-Tyr、3，5-二溴-D-Tyr、D-Asn、D-Asp、L-Asp、D-Glu和L-Glu；且若C和E分别是Lys和D-Tyr，则F不是D-Tyr或D-Lys.
39.权利要求39的肽试剂，其中所述肽试剂连接到可检测的标记物上。
40.权利要求39的肽试剂，其中所述肽试剂间接连接到可检测的标记物上。
41.权利要求39的肽试剂，其中所述肽试剂直接连接到可检测的标记物上。
42.权利要求39的肽试剂，其中所述可检测的标记物是放射性的。
43.权利要求42的肽试剂，其中所述可检测的标记物是连接到所述肽试剂的氨基酸上的碘、砹或溴标记物。
44.权利要求38的肽试剂，其中X是螯合基团。
45.权利要求38的肽试剂，其中X省去，Y被低级乙酰化、琥珀酰化、马来酰化或富马酰化。
46.权利要求38的肽试剂，其中Y是增加所述试剂的亲水生物分布的肽序列。
47.权利要求46的肽试剂，其中Y具有下式U(V-V)n，其中；U是D-Pro、L-Pro、D-4-OH-Pro、L-4-OH-Pro、Sar或(NH2-(CH2)m-COOH)，其中m＝2-10，包括2和10，或省去；各V独立地选自D-Ser、L-Ser、D-Thr、L-Thr、D-Gln、L-Gln、D-Asn、L-Asn、D-4-OH-Pro和L-4-OH-Pro；且n是1-50的整数，包括1和50。
48.权利要求47的肽试剂，其中各V独立地为D-Ser、L-Ser或D-Gln。
49.权利要求38的肽试剂，其中E是D-Tyr且F是D-Ser。
50.权利要求38的肽试剂，其中Y是亲水聚合物。
51.权利要求50的肽试剂，其中Y是聚乙二醇、PHEA或聚乙烯醇。
52.权利要求38的肽试剂，其中Q是促生长素抑制素肽。
53.权利要求38的肽试剂，其中Q是铃蟾肽。
54.权利要求38的肽试剂，其中Z是Lys-D-Tyr-D-Ser。
55.权利要求38的肽试剂，其中Z是Lys-D-Ser-D-Ser。
56.权利要求38的肽试剂，其中Z是Nle-D-Tyr-D-Ser。
57.一种治疗或诊断疾病的方法，该方法包括向受实验者施用治疗或诊断有效量的肽试剂，所述肽试剂具有下式X-Y-Z-Q，其中X是可检测的标记物、螯合基团，或省去；Y是增加所述试剂的亲水生物分布的肽、含连接X的接头的亲水聚合物，或省去；Q是具有生物活性的肽；且Z是连接肽，当在Q的N-端或相容侧链氨基处键合到Q上时，它保持至少50％Q的生物活性；Z具有下式C-E-F，其中C是Lys、Orn、Dab、Dap、4-NH2-Phe、Nle、Ser、hSer、Abu、Nva、D-4-OH-Pro或L-4-OH-Pro，或省去；E和F各自独立地选自D-Lys、D-Tyr、D-Ser、D-4-OH-Pro、L-4-OH-Pro、3-碘-D-Tyr、3，5-二碘-D-Tyr、D-Asn、D-Asp、L-Asp、D-Glu和L-Glu；且若C和E分别是Lys和D-Tyr，则F不是D-Tyr或D-Lys.
58.权利要求57的方法，其中所述肽试剂连接到可检测的标记物上。
59.权利要求58的方法，其中所述肽试剂间接连接到可检测的标记物上。
60.权利要求58的方法，其中所述肽试剂直接连接到可检测的标记物上。
61.权利要求58的方法，其中所述可检测的标记物是放射性的。
62.权利要求61的方法，其中所述可检测的标记物是连接到所述肽试剂的氨基酸上的碘标记物。
63.权利要求57的方法，其中X是螯合基团。
64.权利要求57的方法，其中X省去，且Y被低级乙酰化、琥珀酰化、马来酰化或富马酰化。
65.权利要求57的方法，其中Y是增加所述试剂的亲水生物分布的肽序列。
66.权利要求65的方法，其中Y具有下式U(V-V)n，其中；U是D-Pro、L-Pro、D-4-OH-Pro、L-4-OH-Pro、Sar或(NH2-(CH2)m-COOH)，其中m＝2-10，包括2和10，或省去；各V独立地选自D-Ser、L-Ser、D-Thr、L-Thr、D-Gln、L-Gln、D-Asn、L-Asn、D-4-OH-Pro和L-4-OH-Pro；且n是1-50的整数，包括1和50。
67.权利要求66的方法，其中各V独立地为D-Ser、L-Ser或D-Gln。
68.权利要求57的方法，其中Y是亲水聚合物。
69.权利要求68的方法，其中Y是聚乙二醇、PHEA或聚乙烯醇。
70.权利要求57的方法，其中Q是促生长素抑制素肽。
71.权利要求57的方法，其中Q是铃蟾肽。
72.权利要求57的方法，其中E是D-Tyr且F是D-Ser。
73.权利要求57的方法，其中Z是Lys-D-Tyr-D-Ser。
74.权利要求57的方法，其中Z是Lys-D-Ser-D-Ser。
75.权利要求57的方法，其中Z是Nle-D-Tyr-D-Ser。
76.权利要求2的肽试剂，其中Q是铃蟾肽，且Z具有下式E-F，其中E是D-Lys、D-Tyr、D-Ser、D-4-OH-Pro、L-4-OH-Pro、3-碘-D-Tyr、3，5-二碘-D-Tyr、3-砹-D-Tyr、3，5-二砹-D-Tyr、3-溴-D-Tyr、3，5-二溴-D-Tyr、D-Asn、L-Asn、D-Asp、L-Asp、D-Gln或L-Gln；且F是D-Lys、D-Tyr、D-Ser、L-Ser、D-4-OH-Pro、L-4-OH-Pro、3-碘-D-Tyr、3，5-二碘-D-Tyr、3-砹-D-Tyr、3，5-二砹-D-Tyr、3-溴-D-Tyr、3，5-二溴-D-Tyr、D-Asn、L-Asn、D-Asp、L-Asp、D-Glu、L-Glu、D-Gln或L-Gln。
77.权利要求21的方法，其中Q是铃蟾肽，且Z具有下式E-F，其中E是D-Lys、D-Tyr、D-Ser、D-4-OH-Pro、L-4-OH-Pro、3-碘-D-Tyr、3，5-二碘-D-Tyr、3-砹-D-Tyr、3，5-二砹-D-Tyr、3-溴-D-Tyr、3，5-二溴-D-Tyr、D-Asn、L-Asn、D-Asp、L-Asp、D-Gln或L-Gln；且F是D-Lys、D-Tyr、D-Ser、L-Ser、D-4-OH-Pro、L-4-OH-Pro、3-碘-D-Tyr、3，5-二碘-D-Tyr、3-砹-D-Tyr、3，5-二砹-D-Tyr、3-溴-D-Tyr、3，5-二溴-D-Tyr、D-Asn、L-Asn、D-Asp、L-Asp、D-Glu、L-Glu、D-Gln或L-Gln。
78.权利要求38的肽试剂，其中Q是铃蟾肽，且Z具有下式E-F，其中E和F各自独立地选自D-Lys、D-Tyr、D-Ser、D-4-OH-Pro、L-4-OH-Pro、3-碘-D-Tyr、3，5-二碘-D-Tyr、3-溴-D-Tyr、3，5-二溴-D-Tyr、D-Asn、D-Asp、L-Asp、D-Glu和L-Glu。
79.权利要求57的方法，其中Q是铃蟾肽，且Z具有下式E-F，其中E和F各自独立地选自D-Lys、D-Tyr、D-Ser、D-4-OH-Pro、L-4-OH-Pro、3-碘-D-Tyr、3，5-二碘-D-Tyr、3-溴-D-Tyr、3，5-二溴-D-Tyr、D-Asn、D-Asp、L-Asp、D-Glu和L-Glu。
80.权利要求2的肽试剂，其中Z是Lys-D-Tyr-D-Ser。
81.权利要求2的肽试剂，其中Z是Ser-D-Lys-D-Ser。
82.权利要求2的肽试剂，其中Z是Ser-D-Lys-Ser。
83.权利要求2的肽试剂，其中Z是Nle-D-Tyr-D-Ser。
84.权利要求2的肽试剂，其中Z是Pal-D-Lys-D-Ser。
85.权利要求2的肽试剂，其中Z是Thr-D-Tyr-D-Ser。
86.权利要求21的方法，其中Z是D-Ser-Lys-D-Tyr-D-Tyr。
87.权利要求21的方法，其中Z是D-Ser-Lys-D-Tyr-D-Ser。
88.权利要求21的方法，其中Z是D-Ser-Ser-D-Lys-D-Ser。
89.权利要求21的方法，其中Z是D-Ser-Ser-D-Lys-Ser。
90.权利要求21的方法，其中Z是D-Ser-Nle-D-Tyr-D-Ser。
91.权利要求21的方法，其中Z是D-Ser-Pal-D-Tyr-D-Ser。
92.权利要求21的方法，其中Z是D-Ser-Thr-D-Tyr-D-Ser。
93.权利要求21的方法，其中Z是Ser-D-Lys-Ser。
94.权利要求21的方法，其中Z是Ser-D-Lys-D-Ser。
95.权利要求4的肽试剂，其中至少一个V是D-氨基酸。
96.权利要求23的方法，其中至少一个V是D-氨基酸。
97.权利要求47的肽试剂，其中至少一个V是D-氨基酸。
98.权利要求66的方法，其中至少一个V是D-氨基酸。
99.权利要求37的方法，其中神经内分泌来源的所述肿瘤是类癌综合征。
100.权利要求44的肽试剂，其中所述螯合基团包括Lu、In、Y或Sm的同位素。
101.权利要求63的方法，其中所述螯合基团包括Lu、In、Y或Sm的同位素。
全文摘要
公开了作为活性肽，如促生长素抑制素或铃蟾肽的类似物的肽试剂及其用途。本发明的化合物具有通式X－Y－Z－Q，其中X是细胞毒性剂、治疗剂、可检测标记物或螯合基团，Q是生物活性肽。在本发明的肽试剂中，Y任选是亲水聚合物或肽，Z是在Q的氨基末端键合于Q的连接肽，具有两个、三个、四个或五个选择的将X连接于Q的氨基酸残基，同时保持Q的生物活性。也公开了在疾病的治疗和诊断中使用这些肽试剂的方法。
文档编号A61BGK1589151SQ02823081
公开日2005年3月2日 申请日期2002年9月20日 优先权日2001年9月21日
发明者D·H·科伊, J·A·福泽利尔, W·A·默菲, L·孙 申请人:图兰恩教育基金管理人