专利名称：抑生长素肽的制作方法
技术领域：
本发明涉及抑生长素肽，其生产方法和含有它们的药物组合物抑生长素是具有下列结构的十四肽
由于抑生长素的分离和特性，人们还在继续广泛研究更有效和更稳定的类似物。
本发明更具体地提供含有式(I)的氨基酸序列的抑生长素类似物-(D/L)Trp-Lys-X1-X2-(I)其中X1是式(a)或(b)基团
或
其中R1是任意取代的苯基，R2是-Z1-CH2-R1，-CH2-CO-O-CH2-R1，
或
其中Z1是O或S，和X2是在Cα侧链上具有芳香残基的α-氨基酸，或者是选自Dab，Dpr，Dpm，His，(Bzl)HyPro，噻吩基-Ala，环己基-Ala和叔丁基-Ala的氨基酸单元，所述序列的残基Lys相应于天然抑生长素-14的残基Lys9。
这些化合物在以后称为本发明化合物。
此处所用的抑生长素类似物指从天然存在的抑生长素-14衍生而来的直链或环肽，合有式I的序列并且其中还有一个或多个已经缺省和/或被一个或多个其它氨基酸基团置换的氨基酸单元和/或其中一个或多个官能团被一个或几个其它官能团置换和/或一个或多个被一个或多个其它等排基团置换的基团。该术语一般应包括所有修饰的天然抑生长素14衍生物，该衍生物含有上述式1序列并具有与至少一个与下面定义的抑生长素受体亚型有nM范围的亲和力。
根据本发明的优选方案，本发明提供抑生长素-14的8位至11位残基为上述定义的式I序列的抑生长素类似物。
更优选地，本发明提供前面公开的含有六肽单元的抑生长素类似物，该六肽单元的3位至6位残基含有式I序列。特别优选抑生长素六肽，其中六肽单元的1-位和2位残基可以是任意本领域已知的残基，如A.S.Dutta在《小肽》(Small Peptides) Vol.19，292-354，Elsevier，1993中公开的残基，或取代基，如抑生长素-14的Phe6和/或Phe7。
本发明更具体地提供抑生长素类似物，其中六肽单元是环状的，如在6-位残基的α-羧基和1-位残基的α-氨基之间存在直接的肽键。
当式I序列中的Lys，X1和X2具有L-构型，Trp可以是D或L-构型。优选Trp具有D-构型。
X1优选是式(a)或(b)残基，R2优选是-Z1-CH2-R1或
当X2在Cα侧链上含有芳香残基时，它可以是适宜的天然或非天然的α-氨基酸，如Phe，Tyr，Trp，Nal，Pal，苯并噻吩-Ala，Tic和甲状腺原氨酸(thyronin)，优选Phe或Nal，更优选Phe。X2优选是在Cα侧链带有芳香残基的α氨基酸。
当R1是取代的苯基时，它可以适宜地被卤素，甲基，乙基，甲氧基或乙氧基如在邻和/或对位取代。更优选R1是表取代的苯基。
Z1优选是O。
本发明代表性的化合物例如是式(II)化合物
其中X1和X2定义如上，A是选自下列的二价残基Pro，
其中R3是NR8R9-C2-6亚烷基，胍基-C2-6亚烷基或C2-6亚烷基COOH，R3a是H，C1-4烷基或独立地具有一个R3的定义。R3b是H或C1-4烷基，Ra是OH或NR5R6，R6是-(CH2)1-3-或-CH(CH3)-，R4是H或CH3，R4a是任选的环-取代苄基，R5和R6各自独立地是H，C1-4烷基，ω-氨基-C1-4亚烷基，ω-羟基-C1-4亚烷基或酰基，R7是直接键或C1-6亚烷基，R8和R9各自独立地是H，C1-1烷基，ω-羟基-C2-4亚烷基，酰基或CH2OH-(CHOH)c-CH2-其中c是0，1，2，3，或4，或R8和R9与和它们相连的氮原子共同形成杂环基，该杂环基还可以含有杂原子，和R11是任选环-取代的苄基，-(CH2)1-3-OH，CH3-CH(OH)-或-(CH2)1-5-NR5R6，和ZZa是天然或非天然的α-氨基酸单元。ZZa可以具有D-或L-构型。当ZZa是天然或非天然α-氨基酸单元时，它可以是如Thr，Ser，Ala，Val，Ile，Leu，Nle，His，Arg，Lys，Nal，Pal，Tyr，Trp，任选环-取代的Phe或N6-苄基-Gly。当ZZa是Phe时，其苯环可以被如NH2，NO2，CH3，OCH3或卤素优选在对位取代。当ZZa是Phe时，其苯环优选不取代。
当A含有Pro氨基酸残基时，在脯氨酸环上的任意取代基，如R3-NH-CO-O-等，优选在4-位。这些取代的脯氨酸残基可以是顺式，如
也可以是反式。本发明包括各种几何异构体及其混合物。
当A是(NR8R9-C2-6亚烷基-NH-CO-O)Pro-时，其中NR8R9形成杂环基，该杂环基可以是芳香的或饱和的并含有一个氮原子或一个氮原子和第二个选自氮原子和氧原子的杂原子。优选的杂环基如吡啶基或吗啉代。该残基中的C2-6亚烷基优选-CH2-CH2-。
作为A中的R5，R6，R8和R9的任意酰基可以是如R12CO-，其中R12是H，C1-4烷基，C2-4链烯基，C3-6环烷基或苄基，优选甲基或乙基。当A中的R4a或R11是环取代的苄基时，苯环可以如上述ZZa那样被取代。
本发明优选的一组化合物是如其中A没有侧链-NH-CO-O-部分的式II化合物。更优选的一组本发明化合物是如其中A含有碱性侧基，如R3-NH-CO-O-或
部分的式II化合物。
本发明进一步优选的一组化合物是其中N-端氨基酸含有取代的Pro，特别是4-取代的Pro的一组化合物，如其中A是4-取代Pro的式II化合物。
优选地，A是4-(R3-NH-CO-O)Pro。
更具有代表性的本发明化合物是含有带螯合基团的氨基化合物，特别是其中A含有带螯合基团的侧链氨基的式II化合物，该化合物可以是游离形式，盐或与可检测元素形成的配合物。这些化合物以下称为螯合的本发明化合物。
适宜的螯合基团是生理上可接受的并且能够与可检测元素配合的螯合基团。优选的螯合基团基本上具有亲水特性。螯合基团的实例包括如多氨基多羧酸或酸酐的衍生物，如无环配位体的衍生物如乙二胺四乙酸(EDTA)，二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)，乙二醇-O，O’-(2-氨基乙基)-N，N，N’，N’-四乙酸(EGTA)，N，N’-双(羟基苄基)乙二胺-N，N’-二乙酸(HBED)和三亚乙基四胺六乙酸(TTHA)，取代的EDTA或DTPA的衍生物，如对-异硫氰酸根合-苄基-EDTA或DTPA，大环配位体的衍生物，如1，4，7，10-四氮杂环十二烷-N，N’，N”，N 四乙酸(DOTA)和1，4，8，11-四氮杂环十四烷-N，N’，N”，N-四乙酸(TETA)或1，4，7，10-四氮杂环十三烷-N，N’，N”，N-四乙酸(TITRA)。
螯合基团可以与本发明化合物的氨基直接或通过一个间隔连接。适宜的间隔包括本领域已知的那些，如公开于GB-A-2,225,579中的那些，例如氨基羧酸的二价残基，如β-Ala或6-氨基己酸衍生物的二价残基。
优选的螯合基团是DTPA，DOTA，TETA或取代的EDTA或DTPA的衍生物。最优选从DTPA或DOTA衍生的螯合基团。
可检测元素指任意元素，优选在治疗或体内诊断技术中显示可检测特性的金属离子，如发射可检测射线的金属离子或能够感应NMR驰豫性质的金属离子。
适宜的可检测金属离子包括例如重元素或稀土离子，如用于CAT扫描(计算机轴向断层X射线照相法)，顺磁离子，如Gd3+，Fe3+，Mn2+和Cr2+，荧光金属离子，如Eu3+，和放射性核素，如放射性镧系元素，特别是γ-射线放射性核素，γ-射线放射性核素，α-射线放射性核素，俄歇-e--射线放射性核素，阳电子-射线放射性核素如68Ga适宜的γ-射线放射性核素包括用于诊断技术中的核素。γ-射线放射性核素具有从1小时至40天，优选从5小时到4天，更优选从12小时到3天的半衰期。实例是从镓，铟，锝，镱，铼，铽，铊和钐衍生的核素，如67Ga，111In，99mTc，161Tb，169Yb和186Re。
适宜的β-射线放射性核素包括用于治疗中的核素，例如90Y，67Cu，186Re，188Re，169Er，121Sn，127Te，143Pr，198Au，109Pd，165Dy，32P，142Pr和156Sm。
适宜的α-射线放射性核素包括用于治疗中的核素，如211At，212Bi或201Tl。
本发明化合物可以游离或盐的形式存在。盐包括与如有机酸，聚合酸或无机酸的加成盐，例如盐酸盐和乙酸盐可由和与例如螯合基团中的存在的，如碱金属盐如钠盐或钾盐，或取代或未取代的铵盐的羧酸基团获得的盐形式。
本发明也包括生产本发明化合物的方法。它们可以用已知方法的相似方法生产。
本发明化合物可以用，例如下列方法生产a)除去至少一个出现在含有式I残基的抑生长素肽中的保护基，该抑生长素肽是被保护的形式，或b)通过酰胺键将两个肽单元连接在一起，其中每个肽单元均含有至少一个被保护或未被保护的氨基酸，其中酰胺键是以得到所需的氨基酸序列的方式存在的，如果需要，进行方法步骤a)，或c)除去未保护或被保护的抑生长素肽的官能团或将其转化成另一种官能团以得到另一个未保护或被保护的肽并且在后一种情况进行方法步骤a)，或d)为生产螯合的本发明化合物，可将螯合剂与未螯合的保护或未被保护的并且含有螯合基固定在化合物所需氨基上的游离氨基的本发明化合物连接在一起，然后任选地进行步骤a)及以游离形式，盐形式或任选地与可检测元素形成配合物形式回收本发明化合物。
由方法步骤b)的方法可以制备直链肽但也包括通过酰胺键环化直链肽得到具有所需氨基酸序列的环肽。如果需要，在步骤b)的肽偶合之前在氨基酸上或根据c)的最终线性或环肽上引入在A中出现的侧链。这样，在后一种情况中，其中A是羟基-Pro的式II化合物可以被转化得到其中A是R3-NH-CO-O-Pro的式II化合物环化作用可以通过酰肼而简便地进行。当在树脂上制备直链肽时，假如要不是线性肽的氨基酸序列对应与所需抑生长素类似物的氨基酸序列，一般说来选择哪个氨基酸位于C末端位置并不至关重要，一旦直链肽环化，则人们不再能确定哪个氨基酸位于直链肽C-端。通常链起始的第一个氨基酸的选择并不重要，因为直链肽可以环化，而且有其他偏好一种起始氨基酸胜于其它氨基酸的因素。优选将直链肽环化以使从位置3的Trp到位置2的ZZa间形成一个键或从位置6的X2到位置5的X1间形成一个键。
含有被螯合基团取代的氨基的本发明化合物的配合可通过将螯合的化合物与相应的可检测元素产生的化合物，如金属盐，优选水溶性盐，反应而完成。反应可以通过已知方法的相似方法进行，如Perrin，《有机配体》，化学数据系列22(Organic Ligand.，Chemical DataSeries22)NY Pergamon Press(1982)；in Krejcarit Tucker《生物物理和生物化学研究通讯》(Biophys Biochem.Res Com)77581(1977)和Wagner和Welch，《核医学杂志》(J.Nucl.Med.)20428(1979)中公开的方法。
没有有关起始原料的具体描述，但是这些化合物是已知的或可用已知方法的相似方法和本领域的实用方法制备。
下列实施例用于说明本发明。所有的温度为℃。
使用下列缩写Bzl＝苄基(Bzl)＝与(a)或(b)中氧或硫相连的-CH2-苯基DMF＝二甲基甲酰胺BOC＝叔丁氧羰基Fmoc＝9-芴基甲氧羰基TFA＝三氟乙酸DIPCI＝二异丙基碳化二亚胺DCCI＝二环己基碳化二亚胺HOBt＝羟基苯并三唑Dab＝2，4-二氨基丁酸Dpr＝2，3-二氨基丙酸Dpm＝2，6二氨基庚二酸Dde＝4，4-二甲基-2，6-二氧环己-1-亚基乙基RT＝室温HyPro＝4-羟基-脯氨酸(反式除非另有说明)Tic＝四氢异喹啉-羧酸实施例1环[HyPro-Phe-DTrp-Lys-Tyr(Bzl)-Phe]在Fmoc固相合成方法中使用Fmoc-Phe-SASRIN树脂(1.00g，0.65mmol)直至将所需Fmoc-(D)Trp-Lys(Boc)-Tyr(Bzl)-Phe-Pro(y-t-OH)-Phe SASRIN肽树脂装配好。用哌啶将Fmoc脱保护。用肼解作用裂解肽树脂。在1.00g肽树脂中，加入8.3mlDMF和1.24ml的水合肼(约15％的水合肼的DMF溶液)。将混合物在室温搅拌15小时。反应之后，将树脂过滤并用DMF彻底洗涤。收集滤液并在高真空下蒸发得到油状酰肼产物残余物。将残余物溶解在水中并冷冻干燥得到480mg直链H-(D)Trp-Lys(Boc)-Tyr(Bzl)-Phe-HyPro-Phe-NH-NH2酰肼产物。将该酰肼溶解在16ml DMF中，冷却到-20℃并用4N HCl的乙醚溶液(2.4ml，11.6mmol)然后用亚硝酸叔丁酯(41.3μl，0.348mmol)处理。将反应物搅拌20分钟。加入二异丙基乙胺(11.6mmol，2ml)并将反应物在室温搅拌72小时。反应完全后，高真空除去DMF。将水加入油状残余物中，析出沉淀。在乙酸乙酯和水之间萃取。将有机相用硫酸钠干燥并将产物分离。用TFA/水95∶5脱保护并用反相HPLC分离产物。将含有产物的馏分进行离子交换并冷冻干燥得到标题化合物，为白色粉末，MH+(FAB)975，F＝1.24[α]D22＝-39.0(95％AcOH；c＝0.1)，实施例2环[{4-(NH2-C2H4-NH-CO-O)Pro}-Phe-DTrp-Lys-Tyr(Bzl)-Phe]将Fmoc-HyPro-OMe滴加到三光气(0.6当量)的THF溶液中。1小时后加入二甲氨基吡啶(10当量)和N-BOC-二氨基乙烷(6.0当量)并将反应混合物在室温搅拌。TLC研究后，真空除去溶剂并将Fmoc-4-(N-BOC-氨基乙基氨基羰氧基)Pro-OMe从乙酸乙酯/0.1MHCl的两相系统中萃取出来得到粗产物(MH+＝554)。将上述粗甲酯分离然后用1NNaOH的二口恶烷/水处理得到游离酸，并将产物Fmoc-4-(氨基乙基氨基羰氧基)-Pro-OH在硅胶上纯化，(MNa)+＝562)。
在Fmoc固态相合成方法中使用Fmoc-Phe-SASRIN树脂(1.0g，0.65mmol)直至将所需Fmoc-(D)Trp-Lys(Boc)-Tyr(Bzl)-Phe-Pro(y-t-N-BOC-二氨基乙烷氨基甲酰基)-Phe-SASRIN肽树脂装配好。用哌啶将Fmoc脱保护。在玻璃柱上用2％TFA的CH2Cl2处理而除去肽树脂，用1M NaHCO3溶液中和。真空蒸发溶剂并将保护的直链肽冷冻干燥(MH+＝139.8)。将保护的直链肽用DCCI(6.0当量)和HOBt(6.0当量)处理5天而环化。然后用95∶5的TFA∶H2O脱保护，并将环肽用制备TLC纯化并用AG4-X4离子交换树脂对乙酸盐形式进行离子交换得到标题化合物(FAB-MH+＝1061.7)。实施例3环[{4-(吗啉代-乙基-氨基羰氧基)-Pro}-Phe-DTrp-Lys-Tyr(Bzl)-Phe]羟基脯氨酸-衍生物的合成如下将Fmoc-HyPro-OMe滴加到三光气(0.6当量)的THF溶液中。1小时后加入二甲氨基吡啶(1.0当量)和N-乙基氨基吗啉(6.0当量)并将反应物在室温搅拌。TLC研究后，真空除去溶剂并将Fmoc-4-(吗啉代乙氨基羰氧基)Pro-OMe在硅胶上纯化，(MH+524)。用1N NaOH的二口恶烷/水处理除去甲酯并将产物Fmoc-4-(吗啉乙氨基羰氧基)Pro-OH在硅胶上纯化，(MH+510)。
用与前面实施例相似的方法在Fmoc固相合成中使用Fmoc-Phe-SAARIN直至将所需的Fmoc-(D)Trp(Boc)-Lys-(Bzl)-Phe(吗啉代乙氨基氨基甲酸酯)HyPro-Phe-SASRIN树脂装配好。用哌啶将Fmoc脱保护在玻璃柱上用2％TFA的CH2Cl2处理而除去肽树脂。用1M NaHCO3溶液中和。将溶剂真空除去并将保护的直链肽冷冻干燥。将保护的直链肽用DCCI(6.0当量)和HOBt(6.0当量)处理5天而环化。然后用95∶5的TFA∶H2O脱保护，并将环肽用制备TLC纯化并用AG4-X4离子交换树脂对乙酸盐形式进行离子交换得到标题化合物。MH+(FAB)1131 [α]D22＝-55.0·(95％AcOH；c＝0.1)。
通过重复上述公开的方法和使用相应的起始原料，可得到下式化合物环[X-Y-DTrp-Lys-Z-Phe]其中X，Y和Z如下列表1中定义。
表1实施例 XYZ 物化参数MH+4 4-HyProN4-Bzl-Gly Tyr(Bzl)E.S. 975.75Pro Phe Tyr(Bzl)FAB95964-(NH2-C2H4-NH-CO-O-)ProHis Tyr(Bzl)E.S. 1051.57id. Tyr Tyr(Bzl)FAB10778id. Arg Tyr(Bzl)E.S. 1070.494-(NH2-C3H6-NH-CO-O-)ProHis Tyr(Bzl)E.S. 1065.410 id. Phe Tyr(Bzl)FAB107511 id. Tyr Tyr(Bzl)E.S. 1091.712 4-(NH2-C2H4-NH-cO-O-)ProPhe Ser(PClBzl) E.S. 1019.613 id. Ala Thr(Bzl)E.S. 924.214 id. Phe Tyr(Bzl)FAB104715 id. Trp Tyr(Bzl)FAB110016 id. Phe Thr(Bzl)E.S. 999.617 id. Phe Glu(Bzl)E.S. 1027.718 4-(N[CH3]2-C2H4-NH-CO-O-)Pro Phe Tyr(Bzl)FAB108919
Phe Tyr(BZl)E.S. 1103.620 NH2-C2H4-CO-O-NCH3Ser Tyr Tyr(Bzl)E.S. 1065.621 MeSer Phe Tyr(Bzl)FAB963 1)22 4-(pyridyl-c2H4-NH-CO-O)Pro Phe Tyr(Bzl)FAB11232)23 4-(NH2-C5H10-NH-CO-O-)Pro Phe Tyr(Bzl)FAB11183)24 4-HyProHis Tyr(Bzl)E.S. 965.725 id. Tyr Glu(Bzl)FAB94126 id. Phe Thr(Bzl)FAB91327 4-NH2-ProPhe Tyr(Bzl)FAB974 4)
表1(续)实施例 X Y Z物化参数28 N4-Me-Lys Phe Tyr(Bzl) FAB 96729*
Tyr Tyr(Bzl) E.S.1118.730 4-(NH2-C2H4-NH-CO-O-)Pro Tyr Thr(Bzl) E.S.1015.531 4-(NH2-C2H4-NH-CO-O)Pro Phe Ser(Bzl) E.S.985.132 4-(NH2-C2H4-NH-CO-O)Pro(cis) Phe Ser(Bzl) E.S.985.133 4-(NH2-C2H4-NH-CO-O)Pro Ser Thr(Bzl) E.S.939.034 4-(NH2-C2H4-NH-CO-O)Pro Thr Thr(Bzl) E.S.953.135 4-NH2-Pro- Phe Ser(Bzl) E.S.898.036 4-[N(CH3)2-C2H4-NH-CO-O]Pro Phe Ser(Bzl) E.S.1013.237 4-(NH2-C2H4-NH-CO-O)Pro Tyr Ser(Bzl)38 4-NH2-Pro(cis) Phe Ser(Bzl) E.S.89839 4-(NH2-C2H4-NH-CO-O)Pro Ile Thr(Bzl)40 4-(NH2-C2H4-NH-CO-O)Pro Phe Cys(Bzl)1) [α]D22＝-47.0° (95％AcOH；c＝0.1)2) [α]D22＝-54.0° (95％AcOH；c＝0.1)3) [α]D22＝-54.0° (95％AcOH；c＝0.1)4) [α]D22＝-99° (95％AcOH；c＝0.1)id. ＝ 同上 。
*实施例29的肽可以用下列方法制备用实施例2所述的Fmoc固相合成方法将被保护的肽环[(NH2-C(＝NH)-NH-C2H4-NH-CO-O)]-Pro-Tyr-DTrp-Lys(Dde)-Tyr(Bzl)-Phe装载到树脂上。用Nε-Dde-Lys代替Nε-Boc-Lys并用于在HyPro残基的碱性侧链选择性地引入胍基。装好肽后将末端Fmoc基除去并如实施例2中所述方法将肽环化，最后脱保护。将该肽溶解在DMF中并加入二异丙基乙胺(3当量)和HOBt(4当量)随后加入亚硝酸3，5-二甲基-吡唑甲脒金翁(4当量)并将溶液在室温搅拌72小时。将反应混合物真空蒸发然后用无水肼(2％的DMF溶液)处理30分钟以除去Lys上的Dde基。将粗的标题肽(实施例29)在乙腈和三乙铵磷酸盐水溶液系统中用HPLC纯化。实施例41环[4-(NH2-C2H4-NH-CO-O-)Pro-Ala-DTrp-Lys-Tyr(3-Bzl)-Phe]MH+(E.S.)984.5实施例42环[{4-(NH2-C2H4-NH-CO-O-)Pro}-p-NH2)-Phe-DTrp-Lys-Tyr(3-Bzl)-Phe]MH+(E.S.)1076.6实施例43环[4-HyPro-Phe-DTrp-Lys-Tyr(Bzl)-β-Nal]MH+(E.S.)1025.5实施例44环[4-HyPro-Phe-DTrp-Lys-Tyr(Bzl)-Tyr]MH+(E.S.)991.6实施例45环[MePhe-His-DTrp-Lys-Tyr(Bzl)-Dab]MH+(FAB)1005实施例46
a)环[4-(NH2-C2H4-NH-CO-O-)Pro-Phe-DTrp-Lys(ε-Boc)-Tyr(Bzl)-Phe]将60mg环[4-(NH2-C2H4-NH-CO-O-)Pro-Phe-DTrp-Lys-Tyr(Bzl)-Phe]，12mg NaHCO3和12mg(BOC)2O溶解在10mlDMF/水7/3中并保持室温搅拌过夜。蒸发溶剂后将标题产物用硅胶色谱并用二氯甲烷/甲醇/乙酸50％8/2/0.25作流动相进行分离。b)环[4-(DTPA-NH2-C2H4-NH-CO-O-)Pro-Phe-DTrp-Lys(ε-Boc)-Tyr(Bzl)-Phe]将120mgDTPA-酰肼溶解在5ml DMF中并滴加乙醚/3N HCl调PH至3。冷却至-15℃后加入4μl亚硝酸叔丁酯和15mg上述a)中所得化合物在3ml含有15μl Hunig碱的DMF溶液。4小时后蒸发除去溶剂并将残余物脱保护并且不进一步纯化。c)环[4-(DTPA-NH2-C2H4-NH-CO-O-)Pro-Phe-DTrp-Lys-Tyr(Bzl)-Phe]将步骤b)的粗产物用5mlTFA/水95/5在0℃处理10分钟。用50ml水稀释后将溶液直接装载到RP18-HPLC柱上并用水/乙腈/TFA0.1％梯度洗脱。收集纯馏分并冷冻干燥。FAB-MS1436.6。实施例47111In标记的实施例46c)化合物将1mg实施例46c)化合物溶解在5ml0.01M乙酸中。将所得溶液通过0.22μMillex-GV滤器(注册商标)，将其分成每份0.1ml于-20℃储存。将111InCl3(Amersham，1mCi/100μl)预稀释在等体积的0.5M乙酸钠中并通过将配位体与InCl3溶液混合并在室温下进行温和的均化的方法进行标记。然后加入HEPE缓冲液，PH7.4使溶液达到10-6M。实施例48环-[4-(DOTA-NH-C2H4-NH-CO-O)Pro-Phe-DTrp-Lys-er(Bzl)-Phe]M.S.1371.57将该化合物用90Y标记如下将20μl90Y(1.2mCi，0.04M HCl)加入到20μl的50μM的上述化合物(0.15M NH4＝Ac，0.3％BSA，PH4.5)中，将该溶液在100℃保温15分钟。除去一个等分部分并将其在通过C18反相HPLC分析之前用4mM DTPA(PH4.5)稀释，以确定反应混合物中游离的未螯合的90Y的量(根据[90YDTPA]2-的出现来确定)。实施例49
将116mg实施例46a)化合物，12mgNaCNBH3和2当量各种醛溶解在25ml DMF/HOAc1％中并保持在60℃直至TLC检测不到起始原料为止。除去溶剂后将残余物用硅胶色谱纯化(二氯甲烷/甲醇/HOAc50％9/1/0.125)----＞8/2/0.25)以分离单和双烷基化的最终产物。i)醛(D)-葡萄糖X1＝HOCH2-(CHOH)4-CH2-X2＝HE.S.-MH+＝1225.4ii)醛(D)-葡萄糖X1＝X2＝HOCH2-(CHOH)4-CH2-E.S.-MH+＝1389.6iii)醛2，3-O-异亚丙基-(D)-甘油醛X1＝HOCH2-CHOH-CH2- X2＝Hiv)醛2，3-O-异亚丙基-(D)-甘油醛X1＝X2＝HOCH2-CHOH-CH2E.S.-MH+＝1209.4v)醛羟基乙醛X1＝X2＝HOCH2CH2-E.S.-MH+＝1149.4游离形式或可药用盐形式和配合物形式的本发明化合物在体外和体内试验中显示有价值的药理活性，因此可用于治疗中。
特别地，本发明化合物与至少一个抑生长素受体亚型结合。已经克隆并表征了5种抑生长素受体亚型，SST-1，SST-2，SST-3，SST-4和SST-5。
hSST-1，hSST-2和hSST-3及其序列公开于Y.Yamada等的《美国国立科学研究院研究进展》(Proc.Nat.Acad.Sci)，89，251-255(1992)中。hSST-4及其序列公开于L.Rohrert等的《美国国立科学研究院研究进展》(Proc.Acad.Sci.)，90，4196-4200(1993)中。hSST-5及其序列公开于R.Panetta等的Mol.Pharmacol.45，417-427，1993中，结合测定可以用下文公开的从hSST-1，hSST-2，hSST-3，hSST-4，或hSST-5选择细胞系(如稳定表达hSST-1，hSST-2，hSST-3，hSST-4，或hSST-5的CHO细胞)制备的膜来进行。
所用的脑或垂体组织中的hSST可以用如原地杂交和/或受体放射自显影法使其显影。根据已知方法，如J.C.Reubi等J.Clin.Endocrinol.Metab.1987，65，1127-1137中公开的方法制备膜。将从hSST选择细胞系(如稳定表达hSST-1，hSST-2，hSST-3，hSST-4，或hSST-5的CHO细胞)制备的膜以总体积300μl一式三份在22℃培养30分钟，同时增加[125I-Tyr3]-octreottde在10mmol/l含有0.5％BSA的Hepes缓冲液中的浓度。用在Whatman GF/B玻璃纤维过滤器上快速过滤来中止培养，然后每次用5ml冰冷却的10mmol/lTris/150mmol/lNaCl洗涤四次，将滤液在IKR计数器上以78％计数效能计数。特异性结合是总结合减去在1μmol/l抑生长素-14中的非特异性结合。试验分成三份进行。亲和常数(KD)和结合位点数通过对数据进行Scatchard作图来计算。
分别如上所示的本发明化合物在对hSST-1，hSST-2，hSST-3，hSST-4，和/或hSST-5的结合试验中分别具有在纳摩尔范围内的IC50值，优选IC50值在0.1到10nM(IC50＝用与上述[125I-Tyr3]-octreotide相同的放射性配位体在竞争性结合试验中半数最大抑制的浓度)。<
而且，在体外对培养垂体细胞的GH释放的抑制表明本发明化合物具有GH-释放抑制活性。将成年雄性鼠的垂体前叶腺切成小片并分散于0.1％胰蛋白酶的20mM HEPES缓冲液中。将分散的细胞在MEM(Gibco)并补充5％胎牛血清，5％马血清，1mM NaHCO3，2.5nM地塞米松，2.5mg/ml胰岛素和20U/ml Pen/Strep中培养4天。在实验当天将结合的细胞用Krebs-Ringer培养基洗涤两次，该培养基用20mMHEPES缓冲并补充5mM葡萄糖和0.2％BSA。然后将细胞和试验化合物在3×10-10M生长激素释放因子存在下培养2至4小时。释放到培养基中的生长激素的数量通过RIA测定。本发明化合物抑制GH释放的浓度-依赖性是从10-11到10-6M。实施例2化合物的IC50值为0.4nM。
雄性鼠的标准试验表明本发明化合物也抑制胰岛素和或胰高血糖素的释放。试验物质以各种、对数交点间隔剂量给药，并每一剂量至少使用5只鼠。将试验化合物经皮下注射(s.c.)给药1小时后取血。通过放射-免疫-测定检测血清胰岛素和胰高血糖素水平。在该试验中皮下注射本发明化合物在至1000μg/kg，如0.02至10μg/kg剂量范围内有活性。对于胰岛素分泌，经皮下注射实施例9化合物，其EC50为1.8μg/kg。
因此，本发明化合物可用于治疗包括或与GH-分泌过量有关的病因学疾病，如用于治疗肢端肥大，也可以用于治疗糖尿病，特别是其并发症，如血管病，增生性视网膜病，发端(dawn)现象和肾病和与胰岛素或高血糖素释放有关的代谢疾病。
本发明化合物也可以抑制胃酸分泌，外分泌和内分泌的胰分泌和胃肠道中各种肽的分泌，如用鼠的胃或胰瘘管的标准试验所述，其中化合物在0.01到10mg/kg的剂量内有活性。
本发明化合物还可用于胃肠道疾病的治疗，例如用于消化道溃疡，肠皮和胰皮瘘管，易激性肠综合征和倾泻综合征，水样腹泻综合征，与艾滋病相关的腹泻，化学治疗-引起的腹泻，急性或慢性胰腺炎和胃肠道激素分泌肿瘤(如血管活性肠肽肿瘤(vipomas)，高血糖素瘤，胰岛瘤，类癌瘤等等及胃肠道出血等疾病的治疗。
本发明化合物也可以有效地用于抑生长素受体阳性肿瘤的治疗，特别是带有hSST-1，hSST-2，hSST-3，hSST-4和/或hSST-5的肿瘤，如带有这些抑生长素受体的各种癌细胞系的增殖试验所述。
AR42J鼠胰肿瘤细胞系从氮丝氨酸-诱导的外分泌胰肿瘤中得到(Jessop和Hay，1980)。支原体的不存在一般用双苯甲亚胺染色并用GenProbe杂交测定(San Diego，CA)来检测。将培养基在补充10％胎牛血清(FCS)下的DMEM中在5％CO2下连续培养。细胞在没有抗生素或抗真菌剂的条件下生长。将近乎长满AR42J细胞进行胰蛋白酶消化，，用DMEM+2.5％FCS稀释并将其接种在无盖96-孔盘上。在(第0天)培养48小时后，将各对照盘中的细胞通过在Coulter计数器上和SRB比色测定法测定细胞数。然后将细胞暴露在各种浓度的试验化合物中2至5天然后计数。在这种条件下本发明化合物在10-12到10-6M的浓度范围内抑制肿瘤细胞增生。实施例2化合物的IC50值为0.7±0.3(SE)nM。
体内肿瘤生长的研究将重19-22g的雌性裸鼠(来自IFFA Credo，Lyon，France的nu/nu Balbc-A)按每组5只动物分组关在大笼(macrolon cages)(III型16×22×11cm)中。将笼置于通风橱中(Iffa Credo)以保持在24+1℃。使动物随意饮水和食用不含病原体啮齿类动物的食物(Diet A，Kliba，Basel，瑞士)。对于来自培养细胞原发性肿瘤，将AR42J细胞进行胰蛋白酶消化并将5-10×106的肿瘤细胞(在0.2ml中)经皮下注射到裸鼠的两肋中。在肿瘤细胞注射2-4天后开始治疗，试验化合物优选以连续输注的方式给药，如以10-50μg/kg/hr的速度输注。肿瘤的大小用侧径器测定。为了计算肿瘤的体积使用公式“体积(椭圆体)＝长度×深度×高度×0.52”。统计学计算使用Student t-试验(Student’s t-test)。在该试验中实施例2化合物在第11天对肿瘤生长相对于盐水对照液有51％的抑制。
因此，本发明化合物可用于恶性细胞增生性疾病的治疗，如癌肿瘤，特别是有化合物(如下文公开的螯合化合物)靶向的带有抑生长素受体型的肿瘤。
本发明化合物也可以有效地抑制血管生成，如下文公开的裸鼠的标准试验所述。
将鼠通过腹腔注射400mg/kg水合氯醛(Sigma)麻醉。将肿瘤细胞(0.1ml中有0.1到10×106个)(如R.Steiner，P.B. Weidz和R.Langer著，Angiogenesis，1992，瑞士，中公开的方法制备的SiHa细胞和MDA-MB-231细胞，)经皮内注射。通常在每个鼠离主腹皮肤血管较远的两腹侧均注射以便使背景血管计数较低。对照组动物使用0.1ml0.02％台盼兰的PBS溶液。注射10天后将麻醉的鼠通过吸入CO2处死将皮肤封固在一个塑料环(直径40mm)通过倒置显微镜(Zeiss IM)在12.5和25倍放大倍数下评价。为了测定血管生成，将血管照相并将直接与肿瘤相连的血管计数，将对照组动物与的注射位点周围有限区域相连的血管计数。该区域相应于皮肤肿瘤的平均区域。后者用侧径器根据公式3.14xr2来确定。试验化合物在肿瘤注射的当天或3天后通过皮下注射给药。对照组动物用载体治疗。在该试验中，当以如0.01到1000μg/kg剂量皮下注射时，本发明化合物可以抑制血管的生成。
本发明化合物还可以用于预防和治疗血管生成，炎症疾病和视网膜病。
如下列试验所示，本发明化合物也可以有效地抑制平滑肌细胞的增生和迁移。
慢性同种异体移植排异本发明化合物可以抑制鼠肾同种异体移植慢性排异。将雄性DA(RTla)鼠的肾常位移植到雄性Lewis(RTl1)鼠上。共有24只鼠接受移植。从移植的当天开始给所有动物用7.5mg/kg/天/每只动物的环孢菌素A治疗14天，以预防急性细胞排异。不进行对侧肾切除术。用不同剂量的本发明化合物或安慰剂对每组6个动物的实验组动物进行治疗。在移植后53-64天开始，试验动物再通过输注本发明化合物或接受安慰利进行69-72天的治疗。在移植后第14天通过MRI测定器官的灌流在移植后第53-64天和实验结束时重复该测定。然后将动物解剖。在该鼠肾的同种异体移植模型中，以1到10μg/kg/h的剂量给以本发明化合物如实施例31化合物，可改善器官灌流。同时测定了IGF-1水平的一个急剧下降。
血管形成术在Balloon导管损伤模型中研究血管形成术在第0天将Balloon导管基本上按照Powell等(1989)的方法插入，在异氟烷麻醉下，通过一个外用导管将Fogarty 2F导管导入左颈动脉并使其膨胀(膨胀≈10μlH2O)。将膨胀的气球沿着普通颈动脉径向拉三次，在后两次中同时轻轻扭动而得到均一的脱皮内愈合。然后除去导管，在外导管周围结扎以预防出血并使动物恢复。
将2组12个RoRo鼠(400g，约24周龄)用于研究一个对照组和一个接受本发明化合物组。在所有操作、实验方法和分析中，鼠完全是随机抽样。在气球损伤前3天(天-3)直至研究结束，气球损伤的第14天(天+14)，用一个微型泵以10-50μg/kg/h的速度连续输注试验化合物。将鼠关在各自的笼中并不加限制地给以食物和水。
然后将鼠用异氟烷麻醉，将灌流导管通过左心室插入并固定在主动脉弓上，将呼吸插管插入右心室。将动物在15mmHg的灌流压下灌流，先用0.1M磷酸缓冲盐水溶液(PBS，PH7.4)灌流1分钟，再用2.5％戊二醛的磷酸缓冲溶液(PH7.4)灌流15分钟。然后将颈动脉切除，与周围组织分离并将其浸于含有7％蔗糖的0.1M卡可酸盐缓冲液(PH7.4)中于4℃温育过夜。随后将颈动脉在0.05％KMnO4的0.1M卡可酸盐溶液中和室温浸泡并振摇1h。然后将组织在不同级别的乙醇中脱水；在75％的乙醇中2×10分钟，在85％乙醇中2×10分钟，在95％乙醇中3×10分钟和在100％乙醇中3×10分钟。然后将颈动脉根据生产商的建议包埋在Technovit 7100中。将包埋培养基置于含氩气的干燥器中聚合过夜。用具有金属刀片的旋转切片机将每个颈动脉中部以4μm厚的部分切下并将其用Giemse-染料染色2分钟。这样从每个颈动脉制备约5部分并将血管中层的交叉部分，新内膜和腔通过一个图象系统(MCID，Toronto，Canada)进行形态评价。
在该试验中，当以0.2至10mg/kg，优选0.05至5mg/kg的日剂量连续输注给药时，本发明化合物能够抑制肌内膜的增生。
因此，本发明化合物可以用于预防或对抗移植血管疾病，同种异体或异种移植血管病，如在器官(如心，肺，混合心，肺，肝，肾)移植或胰移植中的移植血管动脉粥样硬化，或用于预防或治疗再狭窄和/或后续血管损伤(如血管形成术)的血管闭合。
对于所有上述症状，所需的剂量取决于如所用的本发明化合物，宿主，给药方式和需要治疗疾病的严重程度。通常以1μg至0.5mg/kg/天的剂量使用本发明化合物可得到满意的结果。所述病人日剂量范围是约2μg到20mg，优选约0.01至20mg，如以每剂量单元含有约0.5μg至约10mg，如从约2μg至10mg多至每天3次常规皮下注射或以缓释形式使用10至5000μg本发明化合物。
本发明化合物可以游离形式、药用盐形式或配合物形式给药这些盐或配合物可以用常规方法制备并显示与游离化合物相同的活性，本发明还提供含有以游离碱形式或可药用盐形式或配合物形式的本发明化合物(如式II化合物)和药用稀释剂或载体的药物组合物。该组合物可以用常规方法制备。本发明化合物、其可药用盐或配合物可以任何常规途径给药，如以注射液或悬浮液或鼻内或栓剂的形式非肠道给药。
根据前述本发明进一步提供a)将本发明化合物，如式II化合物，其可药用盐或其配合物用作药物；b)预防或治疗需要治疗的患者的上述疾病的方法，该方法包括给所述患者使用有效量的本发明化合物，如式II化合物或其药用盐或配合物；或c)本发明化合物、其可药用盐或配合物在用上述b任意方法制备的药物组合物中的用途。
螯合的本发明化合物或其可药用盐当与γ-或阳电子-射线核素，如111In，161Tb或86Y配合时，也可用作显影剂，如可使抑生长素受体阳性组织和细胞显形，如抑生长素受体阳性肿瘤和转移瘤，炎症或与抑生长素受体有关的自身免疫疾病，结核病或移植后器官排异，或当与α-或β-射线核素，或与俄歇-e-串连的核素，如90Y，61Tb，211At，213Bi或201Ti配合时，可作为放射性药物用于体内抑生长素受体阳性肿瘤和转移瘤，类风湿性关节炎和严重炎症疾病的治疗，如标准试验所述。
特别地，也观察到螯合的本发明化合物，如与111In，88Y，90Y，153Sm，186Re或161Tb螯合的本发明化合物与抑生长素受体具有很好的亲和力，其pKi为约8至10。实施例47化合物对hSST-2有1.2nM的IC50值，对hSST-3有0.65nM的IC50值和对hSST-5有0.30nM的IC50值。
螯合的本发明化合物及其配合物对抑生长素受体的亲和力也可以根据标准试验方法，如公开于GB-A-2，225，579中的方法从体内试验中确定，。例如在给带有SST-2受体的外分必胰肿瘤的小鼠或大鼠注射实施例47化合物4小时后显示明显的肿瘤聚集作用。
当以配合物形式使用螯合的本发明化合物时，如以1至5μg/kg的剂量使用0.1至5mCi，优选0.1至2mCi放射性核素标记的111In，86Y或161Tb螯合化合物时，肿瘤位置和主要产生外分泌的器官均可检测。
当用α-或β-射线核素，或与俄歇-e-串连核素放射标记时，螯合的本发明化合物对带有抑生长素受体的肿瘤细胞具有抗增生和/或细胞毒作用，如裸鼠试验中所述。
如上所示，给裸鼠接种AR42J鼠胰肿瘤细胞或NCI-H69人小细胞肺癌。当肿瘤的体积达到1至2cm3后，将动物随机地分成对照组和治疗组。给对照组动物以相应于治疗组的最高剂量腹腔或静脉注射未标记的化合物或配合形式的螯合化合物。给每只鼠的最高剂量为40mCi/kg。肿瘤的大小用上述的侧径器确定。统计学计算用Student t-试验。在该试验中，在单独使用实施例48化合物一周后可观察到至原肿瘤50％的瞬时肿瘤收缩和两周后肿瘤生长缓慢。相反，对照组显示在七天后至原体积的二倍的连续肿瘤生长。
因此，在一系列具体的或变化的实施方案中，本发明还提供1.使用配合形式的本发明螯合化合物，如螯合的式II化合物在患者体内检测抑生长素受体阳性细胞和组织用所述螯合剂记录靶向受体的位置。
用作显影剂的放射性标记的本发明化合物可以通过腹膜内给药，优选静脉内给药，如注射液或悬浮液，优选单一注射剂。放射性标记优选在给患者用药前短时内进行。
螯合的本发明化合物优选以含有0.2至20mCi，优选1至10mCi稳定配合的核素的剂量给药。
对所述动物与0.02至0.5mCi的γ-射线放射性核素配合的螯合的本发明化合物的剂量范围为0.01至1μg/kg。对大哺乳动物，如人，与如1至10mCi的111In或86Y配合的螯合的化合物的剂量范围是1至20μg。
2.螯合形式的本发明螯合化合物，如螯合的式II化合物，在体内治疗抑生长素受体阳性肿瘤和转移瘤的用途。
当然，本发明用于放射性治疗中所用的剂量取决于所治疗的具体疾病，例如对表达SST-2受体的正常器官的已知放射性毒性，肿瘤的体积和所需治疗的疾病。通常，剂量根据在健康器官上的药物动力学和放射活性的分布和所观察的目标摄取量来计算。螯合化合物的3射线配合物可连续(如在1至3个月内)给药。
在所述动物中与15至70mCi90Y或161Tb配合的螯合化合物的剂量范围是20至100μg/kg。
以配合形式的本发明螯合化合物可以任何常规途径给药，特别是腹腔或静脉给药，如以注射液或悬浮液形式给药。它们还优选通过输液给药，如输液30至60分钟。根据肿瘤的位置，它们可以尽可能与肿瘤位置接近的方式给药，如通过导管给药。
配合形式的螯合本发明化合物可以适宜地用作显影和治疗肿瘤，如垂体，胃-外分泌胰，类癌瘤，中枢神经系统，乳腺，前列腺，卵巢或结肠肿瘤，小细胞肺癌，副神经节瘤，肾癌，皮肤癌，成神经细胞瘤，嗜铬细胞瘤，髓甲状腺癌瘤，骨髓瘤，淋巴瘤，何杰氏病和非何杰氏病，骨癌和其转移瘤，和类风湿性关节炎。
根据本发明，进一步提供含有游离或配合物形式的本发明螯合化合物和一个或多个可药用载体或稀释剂的药物组合物。该组合物可以用常规方法生产，用于成象时，该组合物可以两个分开剂量的试剂盒形式出现，一个为放射性核素和另一个是未配合螯合剂，附有混合它们的说明书。对于放射治疗，以游离或配合形式的本发明螯合化合物优选为热液体制剂。
权利要求
1.含有式I的氨基酸序列的游离形式、或其盐或配合物形式的抑生长素类似物-(D/L)Trp-Lys-X1-X2- (I)其中X1是式(a)或(b)基团
或
其中R1是任意取代的苯基R2是-Z1-CH2-R1， -CH2-CO-O-CH2-R1，
其中Z1是O或S，和X2是在Cα侧链上具有芳香残基的α-氨基酸，或是选自Dab，Dpr，Dpm，His，(Bzl)HyPro，噻吩基-Ala，环己基-Ala和叔丁基-Ala的氨基酸单元，所述序列的残基Lys相应于天然抑生长素-14的残基Lys9。
2.根据权利要求1的游离形式、或其盐形式或配合物形式的抑生长素类似物，其中抑生长素-14的8到11位的残基是权利要求1定义的式I序列。
3.根据权利要求1或2含有编号为1到6的六肽单元的游离形式、或盐形式或配合物形式的抑生长素类似物，其中所述六肽单元的位置3到6的残基含有权利要求1定义的式I序列。
4.根据权利要求3的游离形式、或其盐形式或配合物形式的抑生长素类似物，其中六肽单元是通过在6位的α-羧基与1位的α-氨基间的一个直接的肽键环合的。
5.根据权利要求1至4之一的游离形式、或其盐形式或配合物形式的抑生长素类似物，其中该类似物是式(II)化合物
其中X1和X2定义如权利要求1，A是选自下列的二价残基Pro
其中R3是NR8R9-C2-6亚烷基，胍基-C2-6亚烷基或C2-6亚烷基COOH，R3a是H，C1-4烷基或独立地具有一个R3的定义。R3b是H或C1-4烷基，Ra是OH或NR5R6，Rb是-(CH2)1-3-或-CH(CH3)-，R4是H或CH3，R4a是任选的环-取代苄基，R5和R6各自独立地是H，C1-4烷基，ω-氨基-C1-4亚烷基，ω-羟基-C1-4亚烷基或酰基，R7是直接键或C1-6亚烷基，R8和R9各自独立地是H，C1-4烷基，ω-羟基-C2-4亚烷基，酰基或CH2OH-(CHOH)c-CH2-，其中c是0，1，2，3，或4，或R8和R9与和它们相连的氮原子共同形成杂环基，该杂环基还可以含有杂原子，和R11是任选环-取代的苄基，-(CH2)1-3-OH，CH3-CH(OH)-或-(CH2)1-5-NR5R6，和ZZa是天然或非天然的α-氨基酸单元。
6.根据权利要求5的游离形式、或其盐形式或与可检测元素配合的抑生长素类似物，其中A含有带螯合基团的氨基。
7.一种权利要求1的抑生长素类似物的生产方法，该方法包括a)除去至少一个出现在含有式I残基的抑生长素肽中的保护基，该抑生长素肽是被保护的形式，或b)通过酰胺键将两个肽单元连接在一起，其中每个肽单元至少含有一个被保护或未被保护的氨基酸，其中酰胺键是以得到所需的氨基酸序列的方式存在的，如果需要，进行方法步骤a)，或c)除去未保护或被保护的抑生长素肽的官能团或将其转化成另一种官能团以得到另一个未保护或被保护的肽并且在后一种情况进行方法步骤a)，或d)为生产螯合的抑生长素类似物，可将螯合剂与未螯合的保护或未被保护的并且含有螯合基固定在化合物所需氨基上的游离氨基的本发明化合物连接一起，然后任选地进行步骤a)，以游离形式，盐形式或任选地与可检测元素形成配合物回收抑生长素类似物。
8.用作药物的权利要求1至6之一的抑生长素类似物或其可药用盐或与可检测元素形成的配合物。
9.一种药物组合物，含有权利要求1至6之一的抑生长素类似物，或其可药用盐或与可检测元素形成的配合物和一个或多个可药用载体或稀释剂。
10.一种治疗下列由含有或与GH-分泌过量有关引起的病因学疾病的方法胃肠道疾病，恶性细胞增生疾病，血管生成，或预防或对抗移植血管疾病，再狭窄和血管损伤之后的血管闭合，该方法包括给所述患者使用有效量的权利要求1至6之一的抑生长素类似物或其可药用盐或其与可检测元素形成的配合物。
全文摘要
本发明涉及具有有益药理性质的游离形式,盐形式或与可检测元素配合的含有式Ⅰ氨基酸序列的抑生长素类似物其中X
文档编号A61P35/00GK1189166SQ96195120
公开日1998年7月29日 申请日期1996年6月28日 优先权日1995年6月29日
发明者R·阿尔伯特, W·包尔, C·布鲁斯, N·查德拉毛利, I·勒维斯, G·维克贝克尔 申请人:诺瓦蒂斯有限公司