专利名称：用于促进畜牧场动物生长的合成的促生长素抑制素免疫原的制作方法
技术领域：
本发明涉及肽组合物用作促进饲养场动物生长的免疫原。本发明组合物的免疫原肽含有辅助T细胞表位(Th)，其含有多种Ⅱ类MHC结合基元，并且在其C-或N-末端的任意一端具有促生长素抑制素(促生长素抑制素)。该肽，任选地，含有一种作为一般免疫刺激物的侵染素结构域。辅助T细胞表位和侵染素结构域使抗促生长素抑制素自身肽的免疫应答得以实现。
主要生长激素有生长激素(somatotropin)(生长激素(growthhormone),GH)、生长调节素-C(胰岛素样生长因子1,IGF-1)、somatocrinin(GH释放因子，GRF)和促生长素抑制素(促生长素抑制素)(GH释放抑制因子)。生长激素的主要可能应用在于生长和泌乳，然而，这些现象的激素控制依赖于一些不同激素之间的复杂相互作用(Spencer,Livest Prod Sci,1985,12:31)。因此，单一激素的简单应用可能不足以增强生产力。
GH可能发挥两种不同的作用。它在刺激肌肉蛋白质合成的增加方面表现积极效果(即使不是全部，也是大多数由IGF-1介导)，同时由于其分解脂肪的能力具有强效分解代谢作用。综合作用是增加畜体瘦肉，减少畜体脂肪，通常促进生长，普遍地说提高了食物转化率(Buttery and Dawson，自然科学进展，1990；49:459；and,Spencer,Reprod Nutr Develop,1987；27(2B):581)。
施用GH促进生长的作用在实践中的应用是不可靠的；可能因为施用外源性激素忽略了各种激素间的灵敏的相互作用，忽略了受体群中血浆水平升高造成的可能影响。GH的有效应用需要频繁注射，以便提供激素的连续生理有效血清浓度。其增加了这些平衡相互关系混乱和产生不良影响的风险。
因此，虽然能够通过重组DNA技术大量生产生长激素的纯化制品，但该技术不能提供理想的生长作用所需的传送调节机制。而且，重组生长激素在肉食动物中的应用，最近在奶牛中应用，已经招致广大消费者的反对和协调障碍。应用生长激素促进反刍动物和其它饲养场动物瘦肉累积，在欧洲经济委员会中没有得以协调通过。其协调状况和政治局势类似于应用IGF-1或GRF促进饲养场动物品种生长。
作为增加生长刺激激素水平的一种替换方法，它证明可以同样或更有效地除去内源性生长抑制物质。总肉类生长的主要抑制物质是促生长素抑制素。促生长素抑制素是一种十四个氨基酸的环型肽，其结构在物种间是保守的。它是以九十二个氨基酸的前促生长素抑制素分子形式合成，已经知道包括促生长素抑制素本身和一种二十八个氨基酸形式的促生长素抑制素在内的六种肽来源于前促生长素抑制素分子(Reichlin，实验室临床医学杂志(J Lab Clin Med),1987；109:320)。促生长素抑制素抑制一些胃肠道激素的释放，以及抑制GH、胰岛素、甲状腺激素的释放，由此影响动物吸收营养物的能力，并影响其随后引导这些营养物进入组织生长的能力。
在大鼠中应用促生长素抑制素拮抗剂发现刺激其生长(Spencer eta1.，生命的科学(Life Sci),1985,37:27)，但这种处理还存在需要每日注射GH、IGF-1和GRF的缺点。一种可实践的选择是应用免疫应答诱导促生长素抑制素的免疫中和。对消费者和协调机构来说，应用免疫系统促进生长比直接施用激素或合成类固醇可能更容易接受。Spencer等首先在绵羊中通过疫苗对促生长素抑制素进行免疫中和(Livest prodSci,1983,10:469)。
在一个初步研究中，使用孪生St.Kilda小羊，对促生长素抑制素的主动免疫导致处理小羊的生长速率为对照小羊的176％(Spencer etal.，动物生殖(Anim Prod),1981,32:376)。随后的研究不能重复该结果，但生长速率普遍提高15-20％。促生长素抑制素分子在所有牧场动物品种中都是相同的，已经显示抗促生长素抑制素的主动免疫能够刺激具有商业重要性的绵羊(Spencer et al.,Livest Prod Sci,1983,10:25；Laarveld et al.，加拿大动物科学杂志(Can J Anim Sci),1986,66:77)，牛(Lawrence et al.，动物科学杂志(J Anim Sci),1986,63:(Suppl)215)，猪和鸡(Spencer et al.,Dom Anim Endocr,1986,3:55)饲养的生长。表1显示了表明牧场动物抗促生长素抑制素有效免疫的成功实例的概述。
除了刺激生长速率和使饲养时间减少20％(Spencer,Reprod NutrDevelop,1987；27(2B):581)，抗促生长素抑制素的主动免疫还在食物的转化效率方面具有有益效果。除了由于动物更快速生长节省食物之外，实际上在生长过程中更有效地利用它们的食物(Spencer et al.,Livest Prod Sci,1983,10:469)，至少部分由于肠动力的改变(Fadlalla etal.,J Anim Sci,1985,61:234；Faichney et al.，加拿大动物科学杂志，1985,64(增刊)93)。该处理对畜体成分没有任何显著影响(Spencer etal.,1983，同上)，但指明，当杀死同重量的动物，处理动物可能更瘦。将所有实验数据结合起来来看，主动免疫可能是一种更有力、安全、有效的促进生长的工具(Spencer,Dom Anim Endocr,1986,3:55)。
已有文献报道设计和实验了促生长素抑制素的几种免疫原形式。例如，将促生长素抑制素与蛋白质载体结合，以增强免疫效力。然而，蛋白质载体对于牧场动物的经济应用来说太昂贵。而且，促生长素抑制素的有效免疫依赖于促生长素抑制素和载体的结合位点。即使不是全部也是大部分促生长素抑制素蛋白质载体结合物应用促生长素抑制素和载体蛋白质上赖氨酸残基之间通过戊二醛偶联交联制备。促生长素抑制素上用于偶联的两个赖氨酸存在于12-聚体功能环中，因此当该结合物用作疫苗时，可能导致天然促生长素抑制素结构的显著丧失和对促生长素抑制素交叉反应性的降低。
而且，蛋白质连接于促生长素抑制素是存在问题的，因为大多数免疫应答指向载体而不是促生长素抑制素(载体分子的质量远远大于促生长素抑制素分子的质量)，并且应用半抗原载体结合物的免疫通常导致载体诱导的免疫抑制(Schutz et al.，免疫学杂志，1985,135:2319)。因此，一直在寻找一种适用于家畜、便宜且能够刺激抗促生长素抑制素的早期强效免疫应答的免疫增强剂。该免疫增强剂应答避免载体诱导的抑制。
影响促生长素抑制素合成肽免疫原的免疫原性的一个重要因素是其经T辅助细胞表位向免疫系统的呈递。以前，这是通过伴随上述缺点的载体蛋白质提供的。也以作为经重组DNA表达系统的杂交多肽提供(Riggs,US 4,812,554；US 4,563,424；and Xu et al.，中国科学(Sciencein China)(B卷)，1994；37:1234)。还可以通过含有目标半抗原B细胞位点和适合宿主的T-辅助细胞表位(Th)的合成肽更简便和更方便地提供。该肽除了抗体结合位点还与辅助T-细胞受体和Ⅱ类MHC分子反应(Babbitt et al.，自然，1985,317:359)，因此刺激对目标抗体结合位点(目标位点)严格的位点特异性抗体应答。促生长素抑制素的完全合成肽免疫原将利用下列优越于载体结合物和重组多肽的优点该产品经化学定义，容易质量控制，它很稳定，不需要费事的下游处理，不需要精细的生产装置，产生的免疫应答是位点特异性的，从而避免了不期望的应答，例如表位抑制。
合成的促生长素抑制素免疫原的免疫原性可以如下优化(1)使促生长素抑制素与选择的混杂Th位点结合，以使大多数种群对其应答；(2)使促生长素抑制素与经组合化学形成的功能增强的Th结合，从而为一种种群提供可变的免疫应答；和(3)通过环状限制稳定促生长素抑制素的所需的构象特征。
被称为混杂Th的表位诱导有效的T细胞辅助，并能够与本身很低免疫原性而不能提供强效免疫原的B细胞表位结合。设计良好的混杂Th/B细胞表位嵌合肽能够在表现多样性MHC单体型的遗传多样性种群的大多数成员中诱导Th应答以及随后的抗体应答。混杂Th可以由来源于强效免疫原的特定序列提供，这些强效免疫原包括麻疹病毒F蛋白和乙肝病毒表面抗原。一些已知混杂Th已经显示在加强比十肽激素LHRH(US 5,759,551)更低免疫原性的肽方面有效。
强效Th表位的长度大小范围约为15-30个氨基酸残基，通常具有共同的结构特征，可能含有特定标记序列。例如，共同特征是是存在两性分子螺旋，它是疏水氨基酸残基占据螺旋一面，带电荷和极性残基占据周围面的α-螺旋结构(Cease等，美国国家科学院科学进展，1987,84:4249-4253)。Th表位通常还含有其它的一级氨基酸模式，例如一个Gly或带电荷残基跟着两到三个疏水残基，其后依次跟随一个带电荷或极性残基。该模式被称为Rothbard序列。还发现Th表位通常遵循1、4、5、8规则，其中一个带阳性电荷的残基后第四位、第五位和第八位跟随疏水残基。因为所有这些结构由共同的疏水、带电荷和极性氨基酸组成，每种结构可以同时在一个Th表位中存在(Partidos等，遗传病毒学杂志(J Gen Virol),1991,72:1293-99)。即使不是全部，但大多数混杂T细胞表位含有至少一种上述周期性。这些特征可以插入理想化人工Th位点的设计，包括组合的Th表位。关于组合Th位点的设计，提供了MHC-结合基元的可变位置和优选氨基酸的列表(Cease et al.，美国国家科学院科学进展(Proc Natl Acad SciUSA),1987；84:4249-4253)；并且公开了制备组合Th的被称为构建的合成抗原文库或SSAL的文库肽的方法(Wang等，WO 95/11998)。因此，可以将1、4、5、8规则与组合MHC-结合基元一起应用于SSAL的可变和简并位点的位置排列，以及选择这些位点的残基，以便最大程度的增大对人工Th的免疫应答范围(WO 95/11998)。
肽免疫原通常比蛋白质更柔韧，不易保留任何优选结构。因此通过引入环状限制稳定肽免疫原是有用的。正确环化的肽免疫原可以模拟和保留目标表位的构象，因此诱导对真正分子上那些位点具有交叉反应性的抗体(Moore，<合成肽——用户指南(Synthetic肽s A User’sguide)>第2章，Grant编，WH Freeman and Company:New York,1992,pp 63-67)。
用前面讨论的肽技术和肽设计元素设计的肽免疫原，即混杂的强效Th表位、Th SSAL组合肽、和环状限制的设计，是有效的合成促生长素抑制素免疫原的基础。该肽对于通过优化定位和环化呈递促生长素抑制素，以及广泛反应性Th应答是优选的。因此，已经发现含有单独Th表位或结合一种一般性免疫增强剂例如，一种侵染素结构域(US5759551)和12聚体环状结构中的功能位点没有被干扰的完整形式的促生长素抑制素(作为目标位点)的特定结构排列的肽在刺激产生抗促生长素抑制素抗体方面是有效的。
本发明的另一方面提供了一种抗原组合物，其含有一种免疫有效量的本发明的肽组合物和一种或多种药物可接受疫苗制剂，以及剂量说明，以至于产生针对目标促生长素抑制素位点的免疫治疗抗体。该肽组合物对于改善畜牧场动物生长是有用的。
本发明的进一步方面涉及通过在一定时间和足以诱导抗所述促生长素抑制素的功能性抗体的条件下给哺乳动物施用一种或多种本发明的肽，以增加哺乳动物循环系统中生长激素水平的方法。
本发明的再一方面涉及一种具有约30到约90个氨基酸的免疫合成肽，其含有一种辅助T细胞(Th)表位、促生长素抑制素(SEQ IDNO:1)或促生长素抑制素的肽类似物、分隔免疫原结构域的间隔区、和任选的一般性免疫刺激位点，例如侵染素结构域(SEQ ID NO:2)。该肽的这三种免疫原性结构域元件和间隔区可以以任何顺序共价连接，只要该肽半抗原的免疫反应性基本上保留或能够产生与促生长素抑制素自身肽的免疫反应。发明详述本发明涉及一种新的肽组合物，用于产生对促生长素抑制素具有特异性的高效价多克隆抗体。该肽组合物的高度位点特异性减小了针对载体蛋白质上不相关位点的抗体的产生。因此，本发明进一步涉及一种在畜牧场动物中促进生长的方法。
促生长素抑制素(SEQ ID NO:1)是一种短环状肽激素，其本身是非-免疫原性的、作为一个自身抗原更是如此。可以通过将该短肽化学偶联到一种载体蛋白质上，例如，匙孔帽贝血蓝蛋白(KLH)或通过重组DNA表达将其与一种载体多肽，例如，乙肝表面抗原融合，进行免疫加强。该“促生长素抑制素-载体”疫苗的主要缺点在于结合形成的抗体的绝大部分是针对载体蛋白质或多肽的非功能型抗体，以及存在表位抑制的可能。本发明的免疫原是完全合成肽，其减小了无关抗体的产生，从而诱导更针对促生长素抑制素的免疫应答。然而，因为促生长素抑制素是一种非-免疫原性T细胞-依赖性抗原，其免疫原性完全依赖于外源性Th表位。与混杂Th表位共价连接的本发明的肽提供了该特征。本发明的免疫原全部是位点特异性免疫反应，以便为家畜提供有效的生长促进。
本发明提供了作为本发明肽实施方式的具体实施例。这些实施例提供了合成的免疫刺激元件与促生长素抑制素肽连接，从而在遗传多样化宿主群中产生强效促生长素抑制素-反应性抗体。这些抗体接着导致促生长素抑制素功能的抑制，由此有效地促进牲畜的生长。
对于主动免疫，本发明指的术语“免疫原”涉及一种肽组合物，其能够诱导抗促生长素抑制素的抗体，导致哺乳动物中促生长素抑制素水平的抑制。本发明的肽组合物包括含有混杂辅助T细胞表位(Th表位)的肽。该肽通过一种间隔区(例如，Gly-Gly)共价连接于促生长素抑制素肽，从而使其连接于目标促生长素抑制素肽的N-或C-末端，以便诱导有效的抗体应答。免疫原还可以包括一种一般性免疫刺激元件，例如，一种来自耶尔森氏鼠疫杆菌属(Brett等，欧洲免疫学杂志，1993,23:1608-1614)(SEQ ID NO:2)的侵染素结构域。该侵染素结构域通过一种间隔区与Th肽结合。
本发明的肽可以由下式表示H2N-(A)n-(促生长素抑制素肽)-(B)o-(Th)m-X或H2N-(A)n-(Th)m-(B)o-(促生长素抑制素)-X其中H2N是肽偶合物的N-末端α-NH2,各A独立地为一种氨基酸，或一种一般性免疫刺激肽；各B选自氨基酸、-NHCH(X)CH2SCH2CO-、-NHCH(X)CH2SCH2CO(ε-N)Lys-、-NHCH(X)CH2S-琥珀酰亚胺基(ε-N)Lys-、和-NHCH(X)CH2S-(琥珀酰亚胺基)-；每个Th独立地为一种含有辅助T细胞表位的氨基酸序列，或其免疫增强类似物或片段；促生长素抑制素肽是促生长素抑制素或其交叉反应性和免疫功能类似物；X为一种氨基酸的α-COOH或α-CONH2；n为从1到约10；m为从1到约4；和o为从0到约10。
本发明的肽免疫原包括约20到100个氨基酸残基，优选约25到约80个氨基酸残基，更优选约25到60个氨基酸残基。
如果A是一种氨基酸或一种一般性免疫刺激元件，例如，Inv，它可以共价连接于肽免疫原的N-末端(如通式所示)或连接到C-末端(未显示)。
如果A为一种氨基酸，它可以是任何天然的或非天然的氨基酸。非天然的氨基酸包括但不限于D-氨基酸、β-丙氨酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、羟脯氨酸、甲状腺氨酸、γ-氨基丁酸、高丝氨酸、瓜氨酸等。天然氨基酸包括丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、和缬氨酸。而且，如果m大于1，二个或三个A基团为氨基酸，那么每个氨基酸可以独立地相同或不同。
如果A为一种侵染素的结构域，则它可以是来自耶尔森氏鼠疫杆菌种侵染素蛋白的免疫刺激表位。这种免疫刺激特性来源于这种侵染素结构域与T细胞，特别是活化的免疫或记忆T细胞上存在的β1整联蛋白分子相互作用的能力。Brett等描述了与β1整联蛋白相互作用的侵染素结构域的特定序列(欧洲免疫学杂志，1993；23:1608)。在US 5759551中已经描述过用于连接混杂Th表位的侵染素结构域(Inv)的一种优选实施方式，其经参考插入本文。Inv结构域优选具有如下序列Thr-Ala-Lys-Ser-Lys-Lys-Phe-Pro-Ser-Tyr-Thr-Ala-Thr-Tyr-Gln-Phe(SEQ ID NO:2)或为来源于另一种耶尔森氏鼠疫杆菌种侵染素蛋白相应区域的其免疫刺激类似物。因此这种类似物可以含有氨基酸残基的取代、缺失或插入，以适应株系变异，只要类似物保留免疫刺激特性。
在一个实施方式中，n是1,A是α-NH2。在另一个实施方式中，n是4,A是α-NH2，侵染素结构域(Inv)、甘氨酸和甘氨酸依次连接。
B为一种间隔区，是一种上述的天然氨基酸或非天然氨基酸。每个B独立地相同或不同。B的氨基酸还可以在混杂Th表位和促生长素抑制素肽(例如，SEQ ID NOS:1)或其交叉反应性和免疫功能类似物之间提供一种间隔区，例如Gly-Gly。除了使Th表位与B细胞表位，即促生长素抑制素肽和免疫类似物物理分隔之外，Gly-Gly间隔区还可以破坏Th表位与促生长素抑制素肽和其交叉反应性和免疫功能类似物结合产生的所有人工二级结构，因此减弱了Th和/或B细胞应答之间的干扰。B的氨基酸还可以构成一种作为增强Th和IgE结构域分隔作用的弹性绞链的间隔区。在免疫球蛋白重链绞链区发现了编码弹性绞链的序列的实例。柔韧性绞链序列通常富含脯氨酸。一种特别有用的柔韧性绞链为序列Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro(SEQID NO:3)，其中Xaa为任意氨基酸，优选为天冬氨酸。由B的氨基酸提供的构象间隔使本发明的肽免疫原和合适Th细胞和B细胞之间的相互作用更为有效，由此增强了对Th表位和抗体-诱导性表位以及它们的交叉相互反应性和免疫功能类似物的免疫应答。
Th是一种含有Th表位的氨基酸序列(天然或非天然氨基酸)。Th表位可以由连续或不连续表位构成。因此不是Th的每一个氨基酸一定是表位的一部分。因此，Th表位，包括Th表位的类似物和片段，能够增强或刺激对促生长素抑制素肽及其免疫功能类似物的免疫应答。表现为免疫结构域和混杂的Th表位在具有广泛分歧MHC类型的动物和人群中具有高度和广泛的反应性(Partidos等，1991；US5759551)。本发明肽的Th结构域约具有10到50个氨基酸，优选约具有10到30个氨基酸。当出现多个Th表位(即m≥2)，则每个Th表位独立地相同或不同。Th片段是Th表位的连续部分，其足以增强或刺激对促生长素抑制素肽(SEQ ID NO:1)及其免疫功能类似物的免疫应答。
本发明的表位包括来源于外源病原体的Th，包括但不限于，例如乙肝表面抗原和核心抗原辅助T细胞表位(HBs Th和HBc Th)、百日咳毒素辅助T细胞表位(PT Th)、破伤风毒素辅助T细胞表位(TTTh)、麻疹病毒F蛋白辅助T细胞表位(MVFTh)、沙眼衣原体主要外膜蛋白辅助T细胞表位(CT Th)、白喉毒素辅助T细胞表位(DT Th)、镰状疟原虫环孢子体辅助T细胞表位(PF Th)、曼森氏血吸虫三糖磷酸盐异构酶辅助T细胞表位(SM Th)，及大肠杆菌TraT辅助T细胞表位(TraT Th)。本发明选择作为混杂Th的代表性实例的病原体衍生的Th在US 5759551中的SEQID NOS:2-9和42-52列出；CT Th P11在Stagg等，免疫学，1993,79:1-9中列出；HBc肽50-69在Ferrari等，临床研究杂志，1991,88:214-222中列出，它们经参考插入本文。另外，Th表位包括理想化人工Th(例如，SEQ ID NOS:14)和人工SSAL Th(例如，SEQ ID NOS:7、30、31)。包括SSAL Th的肽在一个固相肽合成中与促生长素抑制素和其它序列按顺序同时合成。Th位点还包括功能性免疫类似物。免疫功能Th类似物包括免疫增强类似物、交叉反应性类似物和任何这些Th表位的片段。功能性Th类似物进一步包括在Th表位中的保守取代、附加、删除、和插入一到10个氨基酸残基，而基本上不改变Th表位的Th刺激功能。
由下式描述的本发明的合成肽(A)n-(Th)m-(B)o-(促生长素抑制素肽)或(A)n-(促生长素抑制素肽)-(B)o-(Th)m具有通过间隔区B与促生长素抑制素肽及其交叉反应性和功能性免疫类似物的N端或C端共价结合的Th表位。
按照本发明，促生长素抑制素肽(例如，SEQ ID NO:1)的交叉反应性和功能性免疫类似物可以进一步包括保守取代、附加、删除、或插入一到约四个氨基酸残基，只要该肽类似物能够诱导与促生长素抑制素肽交叉反应的免疫应答。保守取代、附加、和插入可以用本发明定义的天然或非天然氨基酸实现。
本发明的优选的肽免疫原是含有促生长素抑制素肽或其交叉反应性和功能性免疫类似物；间隔区(例如，Gly-Gly)；TH表位即HBs Th(SEQID NO:1 5)、HBc Th(SEQ ID NO:4)、MVF Th(SEQ ID NOS:21,29)、PT Th(SEQ ID NO:6)、TT Th(SEQ ID NO:5)、CT Th(SEQID NO:27)、DTTh(SEQ ID NO:28)、人工Th(例如，SEQ ID NOS:7、14、30、31)或其类似物；以及任选地，一种Inv结构域(SEQ ID NO:2)或其类似物的肽。
含有本发明肽免疫原和一种或多种Th表位的混合物的肽组合物可以在更广泛的种群中增强免疫效力，并由此产生对促生长素抑制素肽的改进的免疫应答。
本发明的肽免疫原可以通过本领域普通技术人员公知的化学合成法制备。参见，例如，Fields等，《合成肽用户指南》第三章，Grant,W.H.编，Freeman和Co.,NewYork,NY,1992,p.77。因此，可以应用固相合成法——自动匹配Merrifield技术，用t-Boc或Fmoc化合物保护α-NH2，并应用侧链保护的氨基酸，在例如，430A或431型应用生物系统肽合成仪(the Applied Biosystems肽Synthesizer Models430A或431)上合成肽。可以通过提供用于结合到一个特定可变位置上的选择氨基酸混合物，制备含有Th表位的SSAL的肽构建体。
完成所需肽免疫原的组装后，按照标准程序处理树脂，以从树脂上切除肽，并使氨基酸侧链上的功能基团脱封闭。通过HPLC纯化游离肽，通过例如氨基酸分析或通过测序鉴定生化特征。肽的纯化和特征鉴定方法对于本领域技术人员是公知的。
本发明的免疫原还可以是聚合的。可以通过，例如利用常规方法使戊二醛和赖氨酸残基的-NH2之间发生反应实现。通过另一种方法，即通过将一个附加的半胱氨酸加到合成的“A-Th-间隔区-(促生长素抑制素肽)”或“(生长激抑制素肽)-间隔区-(Th)m-(A)n”免疫原的N-末端，使合成的“A-Th-间隔区-(促生长素抑制素肽)”或“(生长激抑制素肽)-间隔区-(Th)m-A”免疫原聚合或共聚合。还可以通过在一种分支的多聚赖氨酰核心树脂上直接合成所需的肽结构，制备一种分支聚合物的本发明的免疫原(Wang等，科学，1991；254:285-288)。
或者，较长的合成肽免疫原可以通过公知的重组DNA技术合成。任何有关DNA技术的标准手册提供了详细的制备本发明肽的方法。为了构建编码本发明肽的基因，将氨基酸序列逆向翻译成一种核酸序列，优选利用应用于基因将在其中表达的有机体的优化密码子。接着，制备合成基因，通常通过合成编码肽和一些必要的调控元件的重叠寡核苷酸。将合成基因插入适当的克隆载体，得到重组体并对其鉴定。然后在选择的表达系统和宿主适合的适当条件下表达肽。利用标准方法纯化肽和鉴定特征。
本发明肽组合物的效果可以通过将含有本发明肽例如，SEQ IDNOS:8-13、16-20、22的免疫原组合物注射动物，例如大鼠，然后监测对促生长素抑制素及其交叉反应性和功能性免疫类似物的激素免疫应答，来证实，如实施例中的详细说明。
本发明的另一方面提供了一种在一种药物可接受的传送系统中含有一种免疫有效量的一种或多种本发明的肽免疫原的药物组合物。因此，可以应用佐剂、药物可接受载体或其它疫苗组合物中提供的其它常规成分将本发明的肽配制成一种肽组合物。可以用于本发明的佐剂或乳化剂包括明矾、不完全弗氏佐剂、liposyn、皂甙、角鲨烯、L121、emulsigen、单磷脂酰脂类A(MPL)、二甲基-二-十八烷基溴化氨(DDA)、QS21、ISA51、ISA35、ISA206和ISA 720，以及其它的有效佐剂和乳化剂。所述制剂包括速释和/或缓释制剂，以及诱导系统免疫的制剂，其可以通过，例如例如，用微粒包封免疫原或将免疫原与微粒共同给药实现。本领域普通技术人员能够容易地确定所述制剂。本发明的免疫原可以通过任何常规途径给药，包括皮下、口服、肌内、或其它非肠道或肠道途径给药。同样，免疫原可以作为单剂量或多剂量给药。本领域普通技术人员能够容易地确定免疫方案。
本发明的肽组合物含有一种有效量的一种或多种本发明的肽免疫原和一种药物可接受的载体。在一种适当剂量单位剂型中的组合物通常含有每公斤体重约0.5μg到约1 mg的免疫原。如果以多剂量给药，可以方便地分成每剂量单位制剂适当量。例如，初始剂量，例如0.2-2.5 mg；优选1 mg由本发明的肽组合物表示的免疫原将通过注射优选肌肉内注射给药，然后施用重复剂量(增强量)。剂量将根据患者的年龄、体重和一般健康状况而定，正如疫苗和治疗领域公知的那样。
对合成促生长素抑制素肽免疫原的免疫应答可以通过捕获在O’Hagan等(疫苗，1991；9:768)描述的生物可降解微粒中或其上传送来改进。可以将免疫原与或不与佐剂包封入生物可降解微粒，以强化免疫应答，包括局部粘膜免疫，并提供用于口服给药和用于具备给药的延时或周期应答的时间控制释放(O’Hagan等，1991；和Eldridge等，1991；28:287-294)。
在下面的实施例中提供了具体肽免疫原和组合物，用于举例说明本发明。这些实施例的目的仅在于说明，不对本发明的范围构成任何方式的限制。
实施例1合成促生长素抑制素肽构建体的一般方法通过Merrifield固相合成技术，在应用生物系统自动匹配肽合成仪(430、431和433A型)上，用Fmoc化合物分别合成表2和3列出的肽。可以通过提供用于化学偶联到一个设计中指明的特定位置上的所需氨基酸混合物，制备含有构建的合成抗原文库(SSAL)，例如被称为“1、4、9PALINDROMIC”(SEQ ID NO:7)的人工Th位点的肽构建体。完成所需肽的组装后，应用三氟乙酸按照标准程序处理树脂，以从树脂上切除肽，并使氨基酸侧链上的保护基团脱封闭。对于环状肽，将切除下来的肽在15％DMSO的水溶液中溶解48小时，以促进半胱氨酸之间链间二硫键的形成。
切除、提取和清洗的肽通过HPLC纯化，通过质谱和反相HPLC鉴定特征。
肽代码栏中标记为“b”的肽合成为所示的目标抗原肽顺序连接Th位点。使用的TH位点包括，例如，来自乙肝病毒的HBs Th(SEQ IDNO:15)、和称之为“1、4、9PALINDROMIC”的新的人工Th位点。标记为“c”的肽是与Inv结构域免疫刺激肽(SEQ ID NO:2)顺序合成的“b”构建体的变异体。标记为“d”的肽是“b”构建体的反向物(例如，促生长素抑制素-Th)，标记为“e”的肽是“c”构建体的反向物(例如，促生长素抑制素-Th-Inv)。合成的“b”、“c”、“d”和“e”构建体具有Gly-Gly间隔区，分隔目标抗原位点和Th位点，分隔Th和Inv免疫刺激位点。
实施例2评价促生长素抑制素肽的免疫原性的一般方法如下面列出的实验免疫方案和确定免疫原性的血清学分析的说明，在每组4或5只大鼠中评价促生长素抑制素肽免疫原(例如，如表2和3所示的SEQ ID NOS:8-13、16-20、22和24)。标准实验设计免疫原(1)个体肽免疫原；或(2)含有如各实施例具体说明的等摩尔肽免疫原的混合物。剂量每次免疫0.5 mL中100μg，除非另有说明。途径肌内，除非另有说明佐剂(1)弗氏完全佐剂(CFA)/不完全佐剂(IFA)；或(2)0.4％明矾(氢氧化铝)；CFA/IFA组在0周接受CFA，在随后的几周接受IFA。明矾组所有剂量接受同样的制剂。给药方案0、2、和4周；0、3、和6周，或另有说明。采血方案0、3、6、和8周，或另有说明。动物品种Sprague-Dawley大鼠每组动物数4或5只大鼠/组分析分析各免疫血清的抗-肽活性的特定ELISA，固相底物是环化促生长素抑制素肽(SEQ ID NO:1)。
采集血液，处理成血清，储存，用于通过具有目标抗原肽的ELISA测定效价。
通过ELISA(酶联免疫吸附分析)在预先用环化的促生长素抑制素肽(SEQ ID NO:1)作为免疫吸附剂涂布的96孔平底微滴平板上，确定抗-促生长素抑制素抗体的活性。将浓度为5μg/ml的肽免疫原溶液等分液(100μL)于37℃保温1小时。用3％明胶/PBS溶液加入肽涂布孔中，于37℃再次保温1小时，封闭平板。然后干燥封闭的平板，用于分析。实验免疫血清的等分液(100μL)，在样品稀释缓冲液中从1∶100稀释度开始进行十倍连续稀释，然后加入肽涂布平板中。平板于37℃保温1小时。
用0.05％PBS/TWEEN的冲洗平板6次。加入在结合稀释缓冲液(含有0.5M NaCl的磷酸盐缓冲液，和正常山羊血清)中适当稀释的100μL辣根过氧化酶标记的山羊-抗-种属特异性抗体。将平板于37℃保温1小时，然后如上述冲洗。然后加入间-苯二胺底物溶液的等分液(100μL)。颜色反应进行5-15分钟，然后加入50μL 2N H2SO4中止酶的颜色反应。在平板读数仪上测定各孔在A492nm的含量。在对吸收度进行线性回归分析，并将截止点A492nm设置为0.5的基础上，计算ELISA效价。该截止值是精确的，因为各分析处理的稀释正常对照样品的该值低于0.15。
基于Th肽的ELISA。基于Th肽的ELISA基本上如本发明前面描述的促生长素抑制素ELISA同样进行，除了抗原涂布步骤，其中微滴平板用指定的来源于其相应促生长素抑制素疫苗构建体(例如，SEQ IDNOS:14和15的肽)的个体Th肽以5μg/ml的浓度于37℃涂布1小时。
实施例3组合有各种免疫刺激元件的促生长素抑制素抗原肽的免疫原性研究表2所示的促生长素抑制素肽免疫原举例说明了下式表示的本发明的肽变异体(A)n-(Th)m-(B)o-(促生长素抑制素肽)或(A)n-(促生长素抑制素肽)-(B)o-(Th)m其中A是一种氨基酸，α-NH2，或Inv(SEQ ID NO:2)；当A是一种氨基酸或Inv时，可以将它连接到N-端或C-端的任意一端；B是甘氨酸；Th是一种来源于外源病原体的辅助T细胞表位，例如，HBc50-69Th(SEQ ID NO:4)、TT615-631Th(SEQ ID NO:5)、PT147-176Th(SEQID NO:6)、或和人工Th，例如，1、4、9 PALIDROMIC Th(SEQ IDNO:7)；n是1,m是1,o是2。
这些肽连同其它肽一起合成，产生的免疫血清用于进行免疫原性评价。表2所示的整合有各种形式和取向的Th表位的大多数肽在免疫宿主中诱导高效价的促生长素抑制素-特异性抗体。相比较而言，不含Th的促生长素抑制素肽(p1348a,SEQ ID NO:1)没有免疫原性。然而，某些Th与其它Th相比是优选的。例如，在表2中，具有HBc Th(SEQ ID NO:4)的p2134b(SEQ ID NO:8)、具有SynTh(1、2、3)(SEQ ID NO:14)的p2384b(SEQ ID NO:20)、人工Th位点、和具有PT149-167Th(SEQ ID NO:6)的p2138b(SEQ ID NO:10)比具有TT Th(SEQ ID NO:5)的p2135b(SEQ ID NO:9)有更强的免疫原性，所有这些均优选于几乎根本没有免疫原性的具有CTA8 Th(SEQ ID NO:23)的p2136b(SEQ ID NO:24)。另外，对于优化的免疫原性，Th位点与促生长素抑制素目标位点的连接方向必须是特定的。比较p2253b(SEQ ID NO:11)和p2255d(SEQ ID NO:12)的抗体应答动力学。将1、4、9PALINDROMIC Th(SEQ ID NO:7)置于促生长素抑制素的C-末端是优选的。从p1344b(SEQ ID NO:16)和p1349b(SEQ ID NO:22)的比较来看，MVF258-277(SEQ ID NO:21)的较好位置是在促生长素抑制素的N-末端。显然每个Th位点的选择和排列对于本发明的优选肽必须是特定的。
对于表3所示的促生长素抑制素肽，已经发现含有混杂Th表位的促生长素抑制素构建体具有免疫原性，并且Inv与“Th”构建体结合，它们能够提高促生长素抑制素肽的免疫原性。P1344b(SEQ ID NO:16)与p1343c(SEQ ID NO:17)的比较以及p1346b(SEQ ID NO:16)与p1345c(SEQID NO:19)的比较表明，将Inv结构域(SEQ IDNO:2)添加到Th构建体的N-末端，提高了用应答动物百分率、促生长素抑制素-特异性抗体效价的强度、以及抗体应答的持续时间(＞35周)表现的免疫原性。然而，p2134b(SEQ ID NO:8)与p2134c(SEQID NO:25)以及与p2134d(SEQ ID NO:26)的免疫原性比较说明，与特定Th位点结合后，Inv可能不具备免疫刺激作用，对于Inv与HBcTh位点(SEQ ID NO:4)的结合N-末端上的特定取向比C-末端的取向更优选。对于p2135e(SEQ ID NO:13)的例子，Inv与TT615-631Th(SEQ ID NO:5)在C-末端的结合产生一种有效的免疫原。因此，附加Inv以及Th与Inv的取向对于本发明的优选肽是特定的。
对于具备强效位点导向免疫原性的促生长素抑制素构建体，针对免疫刺激元件，例如，表3的p1343c(SEQ ID NO:17)的Inv-MVF258-277Th和p1346b(SEQ ID NO:18)的KKK-HBs19-32Th-GG，的抗体效价为＜1 Log10，相比较而言促生长素抑制素的抗体效价＞3 Log10。因此，由本发明的合成肽产生的免疫应答几乎专门指向促生长素抑制素目标位点。
实施例4本发明的其它抗原肽合成了由下式表示的本发明的肽变异体的促生长素抑制素肽抗原示例，并产生免疫血清。
(A)n-(Th)m-(B)o-(促生长素抑制素肽)或(A)n-(促生长素抑制素肽)-(B)o-(Th)m其中Th是一种表4所示的来源于外源病原体的辅助T细胞表位；或者，一种来源于表5所示的人工Th表位的辅助T细胞表位；A是一种氨基酸，α-NH2，或Inv(SEQ ID NO:2)；当A是一种氨基酸或Inv时，可以将它连接到N-端或C-端的任意一端；B是甘氨酸；n是1,m是1,o是2。
表1用于促进生长的抗促生长素抑制素免疫
将载体蛋白质-促生长素抑制素结合物用作接种的疫苗。
表2整合了各种Th的促生长素抑制素抗原肽的免疫原性
a促生长素抑制素的序列AGCKNFFWKTFISCbELISA-反应性动物收集的血清的实验结果。
表3结合侵染素结构域的促生长素抑制素抗原肽的免疫原性的提高
表3(续页)
a促生长素抑制素的序列AGCKNFFWKTFTSC(Seq.ID No.1)bInv的序列(i.e.侵染素结合区)TAKSKKFPSYTATYQF(Seq.ID No.2)c从ELISA-反应性动物收集的血清的实验结果。
表4病原体来源的Th表位的氨基酸序列
表5人工Th表位的氨基酸序列
序列表(1)一般信息(ⅰ)申请人UNITED BIOMEDICAL INC.,ET AL.
(ⅱ)发明名称用于促进畜牧场动物生长的合成的促生长素抑制素免疫原(ⅲ)序列数目45(ⅳ)通讯地址(A)地址Morgan＆Finnegan(B)街道345 Park Avenue(C)城市New York(D)州NY(E)国家USA(F)邮政编码10154-0054(ⅴ)计算机可读形式(A)媒体类型软盘(B)计算机IBM PC兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release#1.0,Version#1.25(ⅵ)在先申请数据(A)申请号09/100,415(B)申请日20 JUNE 1998(C)分类号(ⅶ)当前申请数据(A)申请号TBA(B)申请日21-JUN-1999(C)分类号(ⅷ)律师/代理人资料(A)姓名MARIA C.H.LIN
(B)注册号29,323(C)参考/案卷号1151-4155PCI(ⅸ)电讯信息(A)电话212-758-4800(B)传真212-751-6849(2)SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)序列特征(A)长度14氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1:Ala Gly Cys Lys Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr1 5 10Ser Cys(2)SEQ ID NO:2的信息(ⅰ)序列特征(A)长度16氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2:Thr Ala Lys Ser Lys Lys Phe Pro Ser Tyr Thr Ala1 5 10Thr Tyr Gln Phe15(2)SEQ ID NO:3的信息(ⅰ)序列特征(A)长度6氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:3:Pro Pro Xaa Pro Xaa Pro1 5(2)SEQ ID NO:4的信息(ⅰ)序列特征(A)长度20氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:4:Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp1 5 10Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu15 20(2)SEQ ID NO:5的信息(ⅰ)序列特征(A)长度17氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:5:Trp Val Arg Asp Ile Ile Asp Asp Phe Thr Asn Glu1 5 10Ser Ser Gln Lys Thr15(2)SEQ ID NO:6的信息(ⅰ)序列特征(A)长度30氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:6:Lys Lys Leu Arg Arg Leu Leu Tyr Met Ile Tyr Met1 5 10Ser Gly Leu Ala Val Arg Val His Val Ser Lys Glu15 20Glu Gln Tyr Tyr Asp Tyr25 30(2)SEQ ID NO:7的信息(ⅰ)序列特征(A)长度15氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型肽(ⅸ)特性(A)名称/关键词修饰位点(B)位置1(D)其它信息/注=″Ile,Met或Leu″(ⅸ)特性(A)名称/关键词修饰位点(B)位置2(D)其它信息/注=″Ser或Thr″(ⅸ)特性(A)名称/关键词修饰位点(B)位置4(D)其它信息/注=″Ile或Arg″(ⅸ)特性(A)名称/关键词修饰位点(B)位置5(D)其它信息/注=″Lys或Thr″(ⅸ)特性(A)名称/关键词修饰位点(B)位置10(D)其它信息/注=″His或Thr″(ⅸ)特性(A)名称/关键词修饰位点
(B)位置11(D)其它信息/注=″Lys或Arg″(ⅸ)特性(A)名称/关键词修饰位点(B)位置12(D)其它信息/注=″Ile,Met或Leu″(ⅸ)特性(A)名称/关键词修饰位点(B)位置14(D)其它信息/注=″Gly或Thr″(ⅸ)特性(A)名称/关键词修饰位点(B)位置15(D)其它信息/注=″Ile,Met或Val″(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:7:Xaa Xaa Glu Xaa Xaa Gly Val Ile Val Xaa Xaa Xaa1 5 10Glu Xaa Xaa15(2)SEQ ID NO:8的信息(ⅰ)序列特征(A)长度36氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:8:Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp1 5 10Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Gly Gly Ala Gly15 20Cys Lys Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr Ser Cys25 30 35(2)SEQ ID NO:9的信息(ⅰ)序列特征(A)长度33氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:9:Trp Val Arg Asp Ile Ile Asp Asp Phe Thr Asn Glu1 5 10Ser Ser Gln Lys Thr Gly Gly Ala Gly Cys Lys Asn15 20Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr Ser Cys25 30(2)SEQ ID NO:10的信息(ⅰ)序列特征(A)长度46氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性
(ⅱ)分子类型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:10:Lys Lys Leu Arg Arg Leu Leu Tyr Met Ile Tyr Met1 5 10Ser Gly Leu Ala Val Arg Val His Val Ser Lys Glu15 20Glu Gln Tyr Tyr Asp Tyr Gly Gly Ala Gly Cys Lys25 30 35Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr Ser Cys40 45(2)SEQ ID NO:11的信息(ⅰ)序列特征(A)长度31氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型肽(ⅸ)特性(A)名称/关键词修饰位点(B)位置1(D)其它信息/注=″Ile,Met或Leu″(ⅸ)特性(A)名称/关键词修饰位点(B)位置2(D)其它信息/注=″Ser或Thr″(ⅸ)特性(A)名称/关键词修饰位点(B)位置4
(D)其它信息/注=″Ile或Arg″(ⅸ)特性(A)名称/关键词修饰位点(B)位置5(D)其它信息/注=″Lys或Thr″(ⅸ)特性(A)名称/关键词修饰位点(B)位置10(D)其它信息/注=″His或Thr″(ⅸ)特性(A)名称/关键词修饰位点(B)位置11(D)其它信息/注=″Lys或Arg″(ⅸ)特性(A)名称/关键词修饰位点(B)位置12(D)其它信息/注=″Ile,Met或Leu″(ⅸ)特性(A)名称/关键词修饰位点(B)位置14(D)其它信息/注=″Gly或Thr″(ⅸ)特性(A)名称/关键词修饰位点(B)位置15(D)其它信息/注=″Ile,Met或Val″(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:11:Xaa Xaa Glu Xaa Xaa Gly Val Ile Val Xaa Xaa Xaa1 5 10Glu Xaa Xaa Gly Gly Ala Gly Cys Lys Asn Phe Phe15 20Trp Lys Thr Phe Thr Ser Cys25 30(2)SEQ ID NO:12的信息(ⅰ)序列特征(A)长度31氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型肽(ⅸ)特性(A)名称/关键词修饰位点(B)位置17(D)其它信息/注=″Ile,Met或Leu″(ⅸ)特性(A)名称/关键词修饰位点(B)位置18(D)其它信息/注=″Ser或Thr″(ⅸ)特性(A)名称/关键词修饰位点(B)位置21(D)其它信息/注=″Ile或Arg″(ⅸ)特性(A)名称/关键词修饰位点(B)位置22(D)其它信息/注=″Lys或Thr″(ⅸ)特性
(A)名称/关键词修饰位点(B)位置26(D)其它信息/注=″His或Thr″(ⅸ)特性(A)名称/关键词修饰位点(B)位置27(D)其它信息/注=″Lys或Arg″(ⅸ)特性(A)名称/关键词修饰位点(B)位置28(D)其它信息/注=″Ile,Met或Leu″(ⅸ)特性(A)名称/关键词修饰位点(B)位置30(D)其它信息/注=″Gly或Thr″(ⅸ)特性(A)名称/关键词修饰位点(B)位置31(D)其它信息/注=″Ile,Met或Val″(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:12:Ala Gly Cys Lys Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr1 5 10Ser Cys Gly Gly Xaa Xaa Glu Ile Xaa Xaa Val Ile15 20Val Xaa Xaa Xaa Glu Xaa Xaa25 30(2)SEQ ID NO:13的信息
(ⅰ)序列特征(A)长度51氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:13:Ala Gly Cys Lys Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr1 5 10Ser Cys Gly Gly Trp Val Arg Asp Ile Ile Asp Asp15 20Phe Thr Asn Glu Ser Ser Gln Lys Thr Gly Gly Thr25 30 35Ala Lys Ser Lys Lys Phe Pro Ser Tyr Thr Ala Thr40 45Tyr Gln Phe50(2)SEQ ID NO:14的信息(ⅰ)序列特征(A)长度18氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:14:Lys Lys Lys Ile Ile Thr Ile Thr Arg Ile Ile Thr1 5 10Ile Ile Thr Thr Ile Asp15(2)SEQ ID NO:15的信息(ⅰ)序列特征(A)长度15氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:15:Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln1 5 10Ser Leu Asp15(2)SEQ ID NO:16的信息(ⅰ)序列特征(A)长度36氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:16:Gly Ile Leu Glu Ser Arg Gly Ile Lys Ala Arg Ile1 5 10Thr His Val Asp Thr Glu Ser Tyr Gly Gly Ala Gly15 20Cys Lys Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr Ser Cys25 30 35(2)SEQ ID NO:17的信息(ⅰ)序列特征(A)长度38氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:17:Thr Ala Lys Ser Lys Lys Phe Pro Ser Tyr Thr Ala1 5 10Thr Tyr Gln Phe Gly Ile Leu Glu Ser Arg Gly Ile15 20Lys Ala Arg Ile Thr His Val Asp Thr Glu Ser Tyr25 30 35Gly Gly(2)SEQ ID NO:18的信息(ⅰ)序列特征(A)长度20氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:18:Lys Lys Lys Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr1 5 10Ile Pro Gln Ser Leu Asp Gly Gly15 20(2)SEQ ID NO:19的信息(ⅰ)序列特征(A)长度38氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:19:Thr Ala Lys Ser Lys Lys Phe Pro Ser Tyr Thr Ala1 5 10Thr Tyr Gln Phe Gly Gly Lys Lys Lys Phe Phe Leu15 20Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu Asp25 30 35Gly Gly(2)SEQ ID NO:20的信息(ⅰ)序列特征(A)长度34氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:20:Lys Lys Lys Ile Ile Thr Ile Thr Arg Ile Ile Thr1 5 10Ile Ile Thr Thr Ile Asp Gly Gly Ala Gly Cys Lys15 20Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr Ser Cys25 30(2)SEQ ID NO:21的信息(ⅰ)序列特征(A)长度20氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:21:Gly Ile Leu Glu Ser Arg Gly Ile Lys Ala Arg Ile1 5 10Thr His Val Asp Thr Glu Ser Tyr15 20(2)SEQ ID NO:22的信息(ⅰ)序列特征(A)长度36氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:22:Ala Gly Cys Lys Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr1 5 10Ser Cys Gly Gly Gly Ile Leu Glu Ser Arg Gly Ile15 20Lys Ala Arg Ile Thr His Val Asp Thr Glu Ser Tyr25 30 35(2)SEQ ID NO:23的信息(ⅰ)序列特征(A)长度25氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:23:Ala Leu Asn Ile Trp Asp Arg Phe Asp Val Phe Ser1 5 10Thr Leu Gly Ala Thr Ser Gly Tyr Leu Lys Gly Asn15 20Ser25(2)SEQ ID NO:24的信息(ⅰ)序列特征(A)长度41氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型肽
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:24:Ala Leu Asn Ile Trp Asp Arg Phe Asp Val Phe Ser1 5 10Thr Leu Gly Ala Thr Ser Gly Tyr Leu Lys Gly Asn15 20Ser Gly Gly Ala Gly Cys Lys Asn Phe Phe Trp Lys25 30 35Thr Phe Thr Ser Cys40(2)SEQ ID NO:25的信息(ⅰ)序列特征(A)长度54氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:25:Thr Ala Lys Ser Lys Lys Phe Pro Ser Tyr Thr Ala1 5 10Thr Tyr Gln Phe Gly Gly Ser Asp Phe Phe Pro Ser15 20Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser Ala Leu Tyr25 30 35Arg Glu Gly Gly Ala Gly Cys Lys Asn Phe Phe Trp40 45Lys Thr Phe Thr Ser Cys50(2)SEQ ID NO:26的信息
(ⅰ)序列特征(A)长度54氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:26:Ala Gly Cys Lys Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr1 5 10Ser Cys Gly Gly Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg15 20Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu25 30 35Gly Gly Thr Ala Lys Ser Lys Lys Phe Pro Ser Tyr40 45Thr Ala Thr Tyr Gln Phe50(2)SEQ ID NO:27的信息(ⅰ)序列特征(A)长度12氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:27:Thr Ile Asn Lys Pro Lys Gly Tyr Val Gly Lys Glu1 5 10(2)SEQ ID NO:28的信息(ⅰ)序列特征(A)长度22氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:28:Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys Thr Val1 5 10Ala Ala Leu Ser Ile Leu Pro Gly His Gly15 20(2)SEQ ID NO:29的信息(ⅰ)序列特征(A)长度15氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:29:Leu Ser Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Leu1 5 10Glu Gly Val15(2)SEQ ID NO:30的信息(ⅰ)序列特征(A)长度15氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型肽(ⅸ)特性(A)名称/关键词修饰位点(B)位置2(D)其它信息/注=″Ser或Thr″(ⅸ)特性(A)名称/关键词修饰位点(B)位置5(D)其它信息/注=″Lys或Arg″(ⅸ)特性(A)名称/关键词修饰位点(B)位置6(D)其它信息/注=″Gly或Thr″(ⅸ)特性(A)名称/关键词修饰位点(B)位置10(D)其它信息/注=″His或Thr″(ⅸ)特性(A)名称/关键词修饰位点(B)位置11(D)其它信息/注=″Lys或Arg″
(ⅸ)特性(A)名称/关键词修饰位点(B)位置14(D)其它信息/注=″Gly或Thr″(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:30:Ile Xaa Glu Ile Xaa Xaa Val Ile Val Xaa Xaa Ile1 5 10Glu Xaa Ile15(2)SEQ ID NO:31的信息(ⅰ)序列特征(A)长度19氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型肽(ⅸ)特性(A)名称/关键词修饰位点(B)位置4(D)其它信息/注=″Ser或Thr″(ⅸ)特性(A)名称/关键词修饰位点(B)位置7(D)其它信息/注=″Lys或Arg″(ⅸ)特性(A)名称/关键词修饰位点(B)位置8(D)其它信息/注=″Gly或Thr″
(ⅸ)特性(A)名称/关键词修饰位点(B)位置12(D)其它信息/注=″His或Thr″(ⅸ)特性(A)名称/关键词修饰位点(B)位置13(D)其它信息/注=″Lys或Arg″(ⅸ)特性(A)名称/关键词修饰位点(B)位置16(D)其它信息/注=″Gly或Thr″(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:31:Ile Ser Ile Xaa Glu Ile Xaa Xaa Val Ile Val Xaa1 5 10Xaa Ile Glu Xaa Ile Leu Phe15(2)SEQ ID NO:32的信息(ⅰ)序列特征(A)长度17氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:32Lys Lys Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile1 5 10Gly Ile Thr Glu Leu15(2)SEQ ID NO:33的信息(ⅰ)序列特征(A)长度22氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:33:Lys Lys Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu1 5 10Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu15 20(2)SEQ ID NO:34的信息(ⅰ)序列特征(A)长度27氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:34:Tyr Asp Pro Asn Tyr Leu Arg Thr Asp Ser Asp Lys1 5 10Asp Arg Phe Leu Gln Thr Met Val Lys Leu Phe Asn15 20Arg Ile Lys25(2)SEQ ID NO:35的信息(ⅰ)序列特征(A)长度24氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:35:Gly Ala Tyr Ala Arg Cys Pro Asn Gly Thr Arg Ala1 5 10Leu Thr Val Ala Glu Leu Arg Gly Asn Ala Glu Leu15 20(2)SEQ ID NO:36的信息(ⅰ)序列特征(A)长度21氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:36:Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala1 5 10Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu15 20(2)SEQ ID NO:37的信息(ⅰ)序列特征(A)长度20氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:37:Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys1 5 10Trp Gly Glu Leu Met Thr Leu Ala15 20(2)SEQ ID NO:38的信息(ⅰ)序列特征(A)长度19氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:38:Arg Ala Gly Arg Ala Ile Leu His Ile Pro Thr Arg1 5 10Ile Arg Gln Gly Leu Glu Arg15(2)SEQ ID NO:39的信息(ⅰ)序列特征(A)长度21氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:39:Ala Val Ala Glu Gly Thr Asp Arg Val Ile Glu Val1 5 10Leu Gln Arg Ala Gly Arg Ala Ile Leu15 20(2)SEQ ID NO:40的信息(ⅰ)序列特征(A)长度39氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:40:Glu Glu Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu Ser Ser1 5 10Leu Met Val Ala Gln Ala Ile Pro Leu Val Gly Glu15 20Leu Val Asp Ile Gly Phe Ala Ala Thr Asn Phe Val25 30 35Glu Ser Cys(2)SEQ ID NO:41的信息(ⅰ)序列特征(A)长度21氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:41:Asp Ile Glu Lys Lys Ile Ala Lys Met Glu Lys Ala1 5 10Ser Ser Val Phe Asn Val Val Asn Ser15 20(2)SEQ ID NO:42的信息(ⅰ)序列特征(A)长度17氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:42:Lys Trp Phe Lys Thr Asn Ala Pro Ash Gly Val Asp1 5 10Glu Lys Ile Arg Ile15(2)SEQ ID NO:43的信息(ⅰ)序列特征(A)长度14氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:43:Gly Leu Gln Gly Lys Ile Ala Asp Ala Val Lys Ala1 5 10Lys Gly(2)SEQ ID NO:44的信息(ⅰ)序列特征(A)长度19氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQID NO:44:Gly Leu Ala Ala Gly Leu Val Gly Met Ala Ala Asp1 5 10Ala Met Val Glu Asp Val Asn15(2)SEQ ID NO:45的信息(ⅰ)序列特征(A)长度20氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:45:Ser Thr Glu Thr Gly Asn Gln His His Tyr Gln Thr1 5 10Arg Val Val Ser Asn Ala Asn Lys15 20
权利要求
1．一种肽偶合物，含有共价结合于促生长素抑制素或其交叉反应性和免疫功能类似物的辅助T细胞表位序列(Th)。
2．权利要求1的肽偶合物，其中所述肽偶合物由下式表示H2N-(A)n-(促生长素抑制素肽)-(B)o-(Th)m-X或H2N-(A)n-(Th)m-(B)o-(促生长素抑制素肽)-X其中H2N是肽偶合物的N-末端α-NH2，各A独立地为一种氨基酸或一种一般性免疫刺激序列；各B选自氨基酸、-NHCH(X)CH2SCH2CO-、-NHCH(X)CH2SCH2CO(ε-N)Lys-、-NHCH(X)CH2S-琥珀酰亚胺基(ε-N)Lys-、和-NHCH(X)CH2S-(琥珀酰亚胺基)-；各Th独立为含有辅助T细胞表位的氨基酸序列或其免疫增强类似物或片段；促生长素抑制素肽是促生长素抑制素或其交叉反应性和免疫功能类似物；X为一种氨基酸的α-COOH或α-CONH2；n为1到约10；m为1到约4；和o为0到约10。
3．权利要求1的肽偶合物，其中所述肽偶合物由下式表示H2N-(促生长素抑制素肽)-(B)o-(Th)m-(A)n-X或H2N-(Th)m-(B)o-(促生长素抑制素肽)-(A)n-X其中H2N是肽偶合物的N-末端α-NH2，各A独立地为一种氨基酸或一种一般性免疫刺激序列；各B选自氨基酸、-NHCH(X)CH2SCH2CO-、-NHCH(X)CH2SCH2CO(ε-N)Lys-、-NHCH(X)CH2S-琥珀酰亚胺基(ε-N)Lys-、和-NHCH(X)CH2S-(琥珀酰亚胺基)-；各Th独立为含有辅助T细胞表位的氨基酸序列或其免疫增强类似物或片段；促生长素抑制素肽是促生长素抑制素或其交叉反应性和免疫功能类似物；X为一种氨基酸的α-COOH或α-CONH2；n为1到约10；m为1到约4；和o为0到约10。
4．权利要求2或3的肽偶合物，其中各B选自天然氨基酸或非天然氨基酸。
5．权利要求1-4之一的肽偶合物，其中所述促生长素抑制素肽是促生长素抑制素。
6．权利要求1-4之一的肽偶合物，其中所述Th是一种SSAL表位。
7．权利要求1-4之一的肽偶合物，其中所述Th具有选自SEQ IDNO:4、EQ ID NO:5、SEQID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:14、SEQID NO:15、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:27、SEQ IDNO:28、和SEQ ID NO:29 SEQ ID NO:30、和SEQ ID NO:31的氨基酸序列。
8．权利要求2的肽偶合物，其中所述肽偶合物具有选自SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ IDNO:25、和SEQ ID NO:26的氨基酸序列。
9．权利要求2或3的肽偶合物，其中至少一个A是一种侵染素结构域。
10．权利要求2的肽构建体，其中n是3,(A)3是(侵染素结构域)-Gly-Gly。
11．权利要求9或10的肽偶合物，其中所述侵染素具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
12．一种约有25到约90个氨基酸的合成肽，其含有下列氨基酸序列(a)一种侵染素结构域，(b)一种辅助T细胞(Th)表位，和(c)促生长素抑制素或其交叉反应性和免疫功能类似物。
13．一种含有选自SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:25的氨基酸序列的肽。
14．权利要求1至13之一的肽或肽偶合物，其中所述肽刺激哺乳动物产生对促生长素抑制素的免疫应答。
15．权利要求14的肽或肽偶合物，其中用所述肽偶合物对哺乳动物的免疫导致所述哺乳动物中促生长素抑制素水平减少。
16．一种药物组合物，含有一种免疫有效量的权利要求1-15之一的肽或肽偶合物，以及一种药物可接受载体。
17．权利要求16的药物组合物，其中所述肽或肽偶合物的所述免疫有效量为每剂量每公斤体重约0.5μg到约1 mg。
18．一种诱导哺乳动物产生抗-促生长素抑制素抗体的方法，包括给所述哺乳动物施用权利要求16或17的药物组合物。
19．一种提高哺乳动物生长速率的方法，包括给所述哺乳动物施用权利要求16或17的药物组合物。
20．一种提高哺乳动物生长速率的方法，包括给哺乳动物施用剂量足以减少促生长素抑制素水平的权利要求16或17的药物组合物。
21．一种含有两种或多种权利要求1-15的肽或肽偶合物的混合物的组合物。
22．一种药物组合物，其含有一种免疫有效量的权利要求21的组合物和一种药物可接受的载体。
23．权利要求22的药物组合物，其中所述组合物的所述免疫有效量为每剂量每公斤体重约0.5μg到约1 mg。
24．一种诱导哺乳动物产生促生长素抑制素抗体的方法，包括给所述哺乳动物施用权利要求22或23的药物组合物。
25．一种提高哺乳动物生长速率的方法，包括给所述哺乳动物施用权利要求22或23的药物组合物。
26．一种提高生长速率的方法，包括给哺乳动物施用剂量足以减少促生长素抑制素水平的权利要求22或23的药物组合物。
27．一种含有一个赖氨酸、三个赖氨酸、或七个赖氨酸核心分别共价连接有两个、四个、或八个权利要求1-15之一的肽偶合物的分支聚合物。
28．一种含有权利要求1-3和权利要求5-15之一的一种或多种肽偶合物的、通过双功能交联剂交联的聚合物。
29．一种选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:14、SEQID NO:15、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、和SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、和SEQ ID NO:31的Th表位肽。
全文摘要
本发明提供了一种含有促生长素抑制素、或促生长素抑制素的序列同源物的肽,其共价连接于一种辅助T细胞表位,以及任选地,其它免疫刺激序列。本发明提供了该肽作为免疫原的应用,用于在哺乳动物中诱导产生高效价的、特异于促生长素抑制素的多克隆抗体。预期该肽在降低哺乳动物体内促生长素抑制素水平方面有用,由此提高生长速率和食物利用率。
文档编号C07K16/28GK1311688SQ99807401
公开日2001年9月5日 申请日期1999年6月21日 优先权日1998年6月20日
发明者王长怡 申请人:美国联合生物医学公司