专利名称：包含去酰基生长素释放肽或其衍生物作为活性成分的皮肤修复促进治疗剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及生长素释放肽(ghrelin)相关物质的皮肤细胞增殖活 性。更具体地，本发明涉及其中将所述物质用作活性成分的用于皮肤 损伤治疗的皮肤损伤治疗剂或组合物、皮肤再生促进剂和培养皮肤细 胞的方法。
背景技术：
无须回顾皮肤移植术的悠久历史，很明显，皮肤是最早尝试移植 治疗的组织。此外，展望对移植和再生的将来的研究，通过皮肤形成 研究、使用毛发的再生研究等，认为皮肤是允许最容易接近的组织， 并且其形成/再生过程已经得到充分验证。另外，皮肤移植和再生是可 以直接应用于各种皮肤病如热损伤、遗传性大疱性表皮松解和男性型
秃发的研究领域，并且预期在皮肤损伤或皮肤损害中起到重要作用(参 见，Kyoto University 21st Century Center of Excellence Program "Establishment of International COE for Integration of Transplantation Therapy and Regenerative Medicine" 的网址 -Study on Skin Transplantation and Regeneration, http: //www. kuhp. kyoto-u. ac. jp/~ coe/迈ember15. html)。
皮肤移植所需的培养的皮肤取决于疾病、伤害程度和移植面积而 不同。尽管在中等或轻度烧伤的情况中单独移植培养表皮是适合的， 但是对于全层皮肤破坏的患者，需要包含真皮层的培养皮肤。期望形 成的培养皮肤作为伤口敷料起作用并且可能释放生理活性物质用于治 疗患有包括糖尿病的疾病的患者的难治性皮肤溃疡(参见，Takamura: Bio Venture, 1: 58 (2001))。目前，有两类培养皮肤片用于皮肤移植 一种是根据Green等人 开发的方法的正常表皮角质形成细胞(参见，Rheinwald和Green: Cell, 6: 331 (I975));另一种是由Bell等人开发的皮肤等价组织(参见，Bell 等人Science, 211: 1052 (1981))。 Green等人使用3T3细胞作为支 持细胞，以抑制表皮角质形成细胞的分化，并且成功地获得了充分的 增殖。根据该方法，表皮角质形成细胞在培养过程中多层化，以形成 片状结构，并且已经证明与活体结构相似的培养细胞结构临床上可用 作皮肤组织代替物。使用材料例如胶原，Bell等人预先制备了相当于 真皮的部分，并且在其上面培养表皮角质形成细胞。在这种方法中， 必须使用促进用于人造组织形成的细胞三维掺入的材料，胶原凝胶是 用于该目的的适合材料(参见，Hata: Jikken Igaku Extra Number, 19: 2121 (2001))。
一旦制备了细胞的支架，下一个必需品是促进细胞增殖和分化的 物质(参见，Ueda: Bio Venture, 1: 32 (2001))。人们对于IGF、 TGF-P、 FGF等的临床应用保持谨慎，强调其可能引起人体其它部分中细 胞分化和形成的异常。因此期望发现/开发非常安全的具有这种活性的 物质。
在用于受损皮肤的移植治疗或再生药物中，未来的培养的胎儿皮 肤细胞的应用也是期望的，因为移植到受损区域的培养的胎儿皮肤细 胞分化和增殖为正常皮肤，也就是说，具有皮肤修复能力(参见， Hohfeld等人Lancet, 366: 788-790 (2005))。然而，因为胎儿皮肤 细胞的增殖速度緩慢，期望开发促进增殖的技术。
生长素释放肽是在1999年在胃中发现的激素。它是这样的肽，即， 具有由28个残基组成的氨基酸序列并且具有其中序列中N末端的第三 个氨基酸被脂肪酸酰化的非常罕见的化学结构(参见，Kojima等人 Nature, 402， 656-660 (1999);和参见W001/07475)。生长素释放肽 作用于生长激素促泌素-受体la (GHS-Rla，参见Haward等人Science 273: 974-977 (1996))并且被描述为促进垂体分泌生长激素(GH)的内 源性的脑-胃肠道激素(参见，Kojima等人Nature, 402，656-660 (1999))。近来的研究显示，生长素释放肽增进食欲，生长素 释放肽的皮下给药增加体重和体脂肪，并且生长素释放肽具有例如改 善心脏功能的活性(参见，Wren等人Endocrinology 141: 4325-4328 (2000); Nakazato等人Nature 409: 194-198 (2001); Shintani等人Diabetes 50: 227—232 (2001); Lely等人Endocr. Rev. 25: 426-457 (2004);和Korbonits等人Front Neuroendocrino. 25: 27-68 (2004))。
因为生长素释放肽具有GH分泌促进活性和食欲刺激活性，由此预 期生长素释放肽另外有效地发挥用于将脂肪转化为能量的脂肪燃烧活 性，和通过GH表现出的合成代谢活性强化肌肉的作用(参见，Akamizu 和Kangawa: Saishin Igaku， 60: 1569-1573 (2005))。
生长素释放肽最初从大鼠分离，并且作为作用于GHS-Rla的内源
性GHS纯化。从那以后，已经从除大鼠以外的多种脊推动物发现了具 有类似一级结构的生长素释放肽的氛基酸序列，例如人、小鼠、猪、 鸡、鳗鱼、牛、马、绵羊、牛蛙、鳟鱼和狗。人
:GSS (正辛酰基) :GSS (正辛酰基) 大鼠
:GSS (正辛酰基) :GSS (正辛酰基) 小鼠
:GSS (正辛酰基)
猪
:GSS (正辛酖基)
牛
:GSS (正辛酰基)
羊
:GSS (正辛酰基) 狗
:GSS (正辛酰基) 鳗鱼
:GSS (正辛酰基)
:GSS (正辛酰基) :GSS (正辛酰基)
鸡
:GSS (正辛酰基) :GSS (正辛酰基) :GSS (正辛酰基) 牛蛙
:GLT (正辛酰基) :GLT (正癸酰基) :GLT (正辛酰基)
罗非鱼 :GSS (正辛酰基)
鲶鱼
:GSS (正辛酰基) :GSS (正辛酰基)
马
:GSS (正丁酰基) (上述表达中，
FLSPEHQ環QRKESKKPPAKLQPR FLSPEHQRVQRKESKKPPAKLQPR
FLSPEHQKAQQRKESKKPPAKLQPR FLSPEHQKAQRKESKKPPAKLQPR
F丄SPE,AQQRKESKKPPAKLQPR
FLSPEHQKVQQRKESKKPAAKLKPR
FLSPEHQKLQRKEAKKPSGRLKPR
FLSPEHQKLQRKEPKKPSGRLKPR
FLSPEHQKLQQRKESKKPPAKLQPR
FLSPSQRPQGKDKKPPRV-NH2
FLSPSQKPQVRQGKGKPPRV-NH2 FLSPSQKPQGKGKPPRV-NH2
FLSPHKNIQQQKGTRKPTAK FLSPTYKNIQQQKDTRKPTAR FLSPTYKNIQQQKDTRKPTARLH
FLSPADMQKIAERQSQNKLRHGNM FLSPADMQKIAERQSQNKLRHGNM FLSPADMQKIAERQSQNKLRHGNMN
FLSPSQKPQNKVKSSRI-NH2
FLSPTQKPQNRGDRKPPRV-NH2 FLSPTQKPQNRGDMPPRVG
(seq id no: 1 (seq id no: 2
(seq id no: 3 (seq id no: 4
(seq id no: 5
(seq id no: 6
(seq id no: 7
(seq id no: 8
(seq id no: 9
(seq id no: 10 )
(seq id no: 11 (seq id no: 12
(seq id no: 13 (seq id no: 14 (seq id no: 15
(seq id no: 16 (seq id no: 16 (seq id no: 17
(seq id no: 18
(seq id no: 19 (seq id no: 20
FLSPEHHKVQHRKESKKPPAKLKPR (seq id no: 21 )
氨基酸残基表示为单字符表示法)。上述的肽具有其中第三位的丝氨酸残基(S)或苏氨酸残基(T)的侧 链羟基被脂肪酸例如辛酸和癸酸酰化的特定结构。除了生长素释放肽 之外， 一直没有分离具有疏水性修饰结构的生理学活性肽的情况。
已经报道了去酰基形式(去酰基生长素释放肽)作为通过分解生长 素释放肽的修饰部位的酰基而产生的代谢物。已知其具有例如抑制心 肌细胞凋亡和抑制脂肪细胞中脂质分解的活性(参见，Baldanzi等人 J. Cell Biol., 195: 1029-1037 (2002)和Muccioli等人Eur. J. Pharmacol" 498: 27-35 (2004))。
就本发明人所知，还没有发现报道涉及去酰基生长素释放肽对皮
发明公开
本发明要解决的问题
本发明涉及利用具有皮肤细胞增殖活性的物质的用于皮肤损伤治 疗的皮肤损伤治疗剂、皮肤再生促进剂和培养皮肤细胞的方法。
解决问题的手段
本发明人已经发现，据报道是通过分解生长素释放肽的修饰部位 的酰基(例如第三位的丝氨酸残基的辛酰基)产生的代谢物的去酰基生 长素释放肽在怀孕的大鼠羊水和胎儿的血液中有存在。考虑到去酰基 生长素释放肽在羊水和胎儿血液中的功能和作用，预期去酰基生长素
释放肽具有胎儿皮肤细胞增殖活性。
本发明人研究了去酰基生长素释放肽如何作用于皮肤细胞，并且 发现在皮肤细胞中存在有去酰基生长素释放肽受体、去酰基生长素 释放肽作用于皮肤细胞以增加胞内的钙、并且去酰基生长素释放肽表 现出皮肤细胞的增殖活性。
也就是说，本发明涉及包含去酰基生长素释放肽作为活性成分的 用于皮肤损伤治疗的皮肤再生促进剂、用于通过培养皮肤细胞产生的 培养皮肤细胞片的形成促进剂、和在培养皮肤移植时使用的皮肤修复促进剂和治疗剂。
本发明还涉及皮肤损伤治疗方法、促进通过培养皮肤细胞生产的 培养皮肤细胞片形成的方法、和在移植培养皮肤时促进皮肤修复的方 法以及通过修复促进治疗上述疾病的方法，包括给予去酰基生长素释 放肽。
此外，本发明涉及去酰基生长素释放肽用于皮肤损伤治疗中的皮 肤再生促进剂、通过培养皮肤细胞生产的培养皮肤细胞片形成的促进 剂的应用，和用于生产在移植培养皮肤时使用的皮肤修复促进剂和治 疗剂的应用。
基于以上所述，本发明具体地涉及以下事项。
(1) 用于皮肤损伤的治疗剂，包含去酰基生长素释放肽或具有与 去酰基生长素释放肽实质上相同生理活性的肽、或其可药用盐作为活 性成分。
(2) (l)的治疗剂，其中活性成分为选自以下的肽或其可药用盐
(i) 具有如SEQ ID NO: 1到SEQ ID NO: 21所示氨基酸序列的肽，
(ii) 具有如SEQ ID NO: 1到SEQ ID NO: 21所示氨基酸序列的N末 端到第四个氨基酸残基的氨基酸序列并且从第五个氨基酸残基到C末 端的氨基酸序列中缺失、置换和/或添加一个或几个氨基酸的肽， (Ui) (1)和(2)的肽，其中C末端被酰胺化。
(3) (2)的治疗剂，其中活性成分为具有由SEQ ID NO : 1表示
的氨基酸序列的肽或其可药用盐。
(4) (2)的治疗剂，其中活性成分是具有由SEQ ID NO : 1表示 的氨基酸序列的N末端到第15个氨基酸残基的氨基酸序列的肽或其可 药用盐，其中第15个氨基酸被酰胺化。
(5) (l)到(4)中任一项的治疗剂，包括每个单位制剂0.001 mg 到100 mg的量的活性成分。
(6) 皮肤再生促进剂，包含去酰基生长素释放肽或具有与去酰基
生长素释放肽实质上相同生理活性的肽、或其可药用盐作为活性成分。
(7) (6)的皮肤再生促进剂，其中活性成分为选自以下的肽或其可药用盐(i)具有如SEQ ID NO: 1到SEQ ID NO: 21所示氨基酸序列 的肽，(ii)具有如SEQ ID NO: 1到SEQ ID NO: 21所示氨基酸序列 的N末端到第四个氨基酸残基的氨基酸序列并且从第五个氨基酸残基 到C末端的氨基酸序列中缺失、置换和/或添加一个或几个氨基酸的 肽，(iii) (1)和(2)的肽，其中C末端被酰胺化。
(8) (7)的皮肤再生促进剂，其中活性成分为具有由SEQ ID NO : 1表示的氨基酸序列的肽或其可药用盐。
(9) (7)的皮肤再生促进剂，其中活性成分是具有由SEQ ID NO : 1表示的氨基酸序列的N末端到第15个氨基酸残基的氨基酸序列的肽 或其可药用盐，其中第15个氨基酸被酰胺化。
(10) (6)到(9)中任一项的皮肤再生促进剂，包括每个单位制剂 0.001 mg到100 mg的量的活性成分。
(11) 促进培养皮肤细胞增殖的方法，使用去酰基生长素释放肽或 具有与去酰基生长素释放肽实质上相同生理活性的肽、或其可药用盐 作为活性成分。
(12) (ll)的方法，其中活性成分为选自以下的肽或其可药用盐 (i)具有如SEQ ID NO: 1到SEQ ID NO: 21所示氨基酸序列的肽，(U) 具有如SEQ ID NO: 1到SEQ ID NO: 21所示氨基酸序列的N末端到第 四个氨基酸残基的氨基酸序列并且从第五个氨基酸残基到C末端的氨 基酸序列中缺失、置换和/或添加一个或几个氨基酸的肽，(iii)(l) 和(2)的肽，其中C末端被酰胺化。
(13) (12)的方法，其中活性成分为具有由SEQ ID NO : 1表示的
氨基酸序列的肽或其可药用盐。
(14) (12)的方法，其中活性成分是具有由SEQ ID NO : 1表示的 氨基酸序列的N末端到第15个氨基酸残基的氨基酸序列的肽或其可药 用盐，其中第15个氨基酸被酰胺化。
(15) (11)到(14)中任一项的方法，其中培养皮肤细胞的增殖在包 含0.0000001 mg/mL到0. 1 mg/mL量的活性成分的培养基中进行。
(16) 治疗皮肤损伤的方法，包括将去酰基生长素释放肽或具有与去酰基生长素释放肽实质上相同生理活性的肽、或其可药用盐作为活 性成分给予需要治疗皮肤损伤的哺乳动物。
(17) (16)的方法，其中活性成分为选自以下的肽或其可药用盐 (i)具有如SEQ ID NO: 1到SEQ ID NO: 21所示氨基酸序列的肽,(ii) 具有如SEQ ID NO: 1到SEQ ID NO: 21所示氨基酸序列的N末端到第 四个氨基酸残基的氨基酸序列并且从第五个氨基酸残基到C末端的氨 基酸序列中缺失、置换和/或添加一个或几个氨基酸的肽，(iii)(l) 和(2)的肽，其中C末端被酰胺化。
(18) (17)的方法，其中活性成分为具有由SEQ ID NO : 1表示的 氨基酸序列的肽或其可药用盐。
(19) (17)的方法，其中活性成分是具有由SEQ ID NO : 1表示的 氨基酸序列的N末端到第15个氨基酸残基的氨基酸序列的肽或其可药 用盐，其中第15个氨基酸被酰胺化。
(20) (16)到(19)中任一项的方法，其中活性成分以每次给药 0. 001 mg到100 mg的量给予。
(21) 促进皮肤再生的方法，包括将去酰基生长素释放肽或具有与 去酰基生长素释放肽实质上相同生理活性的肽、或其可药用盐作为活 性成分给予需要皮肤再生的哺乳动物。
(22) (21)的方法，其中活性成分为选自以下的肽或其可药用盐 (i)具有如SEQ ID NO: 1到SEQ ID NO: 21所示氨基酸序列的肽，(ii) 具有如SEQ ID NO: 1到SEQ ID NO: 21所示氨基酸序列的N末端到第 四个氨基酸残基的氨基酸序列并且从第五个氨基酸残基到C末端的氨 基酸序列中缺失、置换和/或添加一个或几个氨基酸的肽，(iii)(l) 和(2)的肽，其中C末端被酰胺化。
(23) (22)的方法，其中活性成分为具有由SEQ ID NO : 1表示的 氨基酸序列的肽或其可药用盐。
(24) (22)的方法，其中活性成分是具有由SEQ ID NO : 1表示的 氨基酸序列的N末端到第15个氨基酸残基的氨基酸序列的肽或其可药 用盐，其中第15个氨基酸被酰胺化。(25) (n)到(24)中任一项的方法，其中活性成分以每次给药
0. 001 mg到100 mg的量给予。
(26) 去酰基生长素释放肽或具有与去酰基生长素释放肽实质上相 同生理活性的肽、或其可药用盐作为活性成分用于生产皮肤损伤治疗 剂的应用。
(27) (26)的应用，其中活性成分为选自以下的肽或其可药用盐 (i)具有如SEQ ID NO: 1到SEQ ID NO: 21所示氨基酸序列的肽，(ii) 具有如SEQ ID NO: 1到SEQ ID NO: 21所示氨基酸序列的N末端到第 四个氨基酸残基的氨基酸序列并且从第五个氨基酸残基到C末端的氨 基酸序列中缺失、置换和/或添加一个或几个氨基酸的肽，(iii)(l) 和(2)的肽，其中C末端被酰胺化。
(28) (27)的应用，其中活性成分为具有由SEQ ID NO : 1表示的
氨基酸序列的肽或其可药用盐。
(29) (27)的应用，其中活性成分是具有由SEQ ID NO : 1表示的 氨基酸序列的N末端到第15个氨基酸残基的氨基酸序列的肽或其可药 用盐，其中第15个氨基酸被酰胺化。
(30) (26)到(29)中任一项的应用，其中皮肤损伤治疗剂的每个单 位制剂包含0. 001 mg到100 mg的量的活性成分。
(31) 去酰基生长素释放肽或具有与去酰基生长素释放肽实质上相 同生理活性的肽、或其可药用盐作为活性成分用于生产皮肤再生促进 剂的应用。
(32) (31)的应用，其中活性成分为选自以下的肽或其可药用盐 (i)具有如SEQ ID NO: 1到SEQ ID NO: 21所示氨基酸序列的肽，(ii) 具有如SEQ ID NO: 1到SEQ ID NO: 21所示氨基酸序列的N末端到第 四个氨基酸残基的氨基酸序列并且从第五个氨基酸残基到C末端的氨 基酸序列中缺失、置换和/或添加一个或几个氨基酸的肽，(iii)(l) 和(2)的肽，其中C末端被酰胺化。
(33) (32)的应用，其中活性成分为具有由SEQ ID NO : 1表示的
氨基酸序列的肽或其可药用盐。(3W(32)的应用，其中活性成分是具有由SEQ ID NO : 1表示的 氨基酸序列的N末端到第15个氨基酸残基的氨基酸序列的肽或其可药 用盐，其中第15个氨基酸被酰胺化。
(3" (31)到(3W中任一项的应用，其中皮肤再生促进剂的每个单 位制剂包含0. 001 mg到100 mg的量的活性成分。
本发明的有利效果
本发明揭示了去酰基生长素释放肽具有皮肤细胞增殖活性。因此， 本发明通过加入该物质以便在培养皮肤细胞时促进细胞增殖，使得能 够为治疗迅速应用培养皮肤细胞。也就是说，有可能在其中培养皮肤 细胞以制备片状人造皮肤并且用其覆盖受损的皮肤表面的皮肤修复治 疗过程中更快地为患者提供由培养皮肤细胞制成的人造皮肤片。此外， 通过将皮肤细胞直接移植到裂伤或创伤部位、随后对移植部位给予去 酰基生长素释放肽，使得促进愈合变为有可能。
此外，本发明人发现，在皮肤细胞中存在有以前未知的去酰基生
长素释放肽受体。这个发现使得使用胎儿皮肤细胞筛选作用于去酰基
生长素释放肽受体的物质和使用该细胞制备去酰基生长素释放肽受体 抗体成为有可能。
附图简述
图1为显示去酰基生长素释放肽增加单个培养的胎儿皮肤细胞中 胞内钙的活性的图。-
图2为显示去酰基生长素释放肽和去酰基生长素释放肽 (1-15)-冊2在培养的胎儿皮肤细胞中的增殖活性的图。
实施发明的最佳模式
本发明的药物可用作用于哺乳动物(个体生物)的药物，哺乳动物 包括人。用于本发明的物质的实例包括没有在生长素释放肽的修饰部 位的酰基(例如第三位的丝氨酸残基的辛酰基)的去酰基生长素释放肽。
作为去酰基生长素释放肽，如上所述，可使用具有与来源于人类 的生长素释放肽以及来源于大鼠、小鼠、猪、牛及其它动物的生长素
释放肽相同氨基酸序列的肽及其衍生物。
优选地，对于个体生物，使用来源于相同个体生物的去酰基生长 素释放肽。例如，优选将具有与来源于人的生长素释放肽相同氨基酸
序列的去酰基生长素释放肽用于人体。去酰基生长素释放肽为包括28 个氨基酸的肽(SEQ ID NO: 1)。
去酰基生长素释放肽的衍生物包括选自以下的肽(a)具有如SEQ ID NO: 1到SEQ ID NO: 21所示氨基酸序列的N末端到第四个氨基酸 残基的氨基酸序列并且从第五个氨基酸残基到C末端的氨基酸序列中 缺失、置换和/或添加一个或几个氨基酸的肽，(b)具有SEQ ID NO : 1 到SEQ ID NO : 21所示氨基酸序列的肽，和(a)的肽，其中C末端被 酰胺化，该肽具有实质上与去酰基生长素释放肽相同的生理活性。这 其中，优选的肽是例如具有如下氨基酸序列的肽，其中SEQ ID NO: 1 所示氨基酸序列的氨基末端第5到第28个氨基酸残基中一个或几个氨 基酸被置换、添加和/或缺失，并且其具有增加胞内钓离子浓度的活性。 可添加的氨基酸残基的优选的实例包括碱性氨基酸，特别是赖氨酸。 期望衍生物的氨基酸序列与天然氨基酸序列相比的同源性为70%，优 选为80%，更优选为90%,更优选为95%,最优选为97%。这些条件在 具有与来源于其它动物的生长素释放肽相同氨基酸序列的去酰基生长 素释放肽(SEQ ID NO : 2到SEQ ID NO : 22)中是一样的。其C末端
中。 、- 、 土 、 —
本发明的去酰基生长素释放肽和衍生物可通过常规方法制备。例 如，它们可以从天然的原料分离、或通过重组DNA技术和/或化学合成 产生。在氨基酸残基中需要修饰(酰化)时，可根据已知的方法进行修 饰反应。例如，在使用重组DNA技术的生产方法中，可以通过培养用 表达栽体转化的宿主细胞、然后从培养物收集目标肽得到本发明的去酰基生长素释放肽及其衍生物，所述表达载体具有编码本发明的肽的腿。
掺入基因的载体的实例包括大肠杆菌载体(例如，pBR322， pUC18 和pUC19)、枯草杆菌栽体(例如pUB110、 pTP5和pC194)、酵母载体(例 如YEp、 YRp和YIp)、和动物细胞载体(例如逆转录病毒和痘苗病毒)。 可以使用任何其它载体，只要它们在宿主细胞中稳定地保持目的基因。 将载体引入到适合的宿主细胞中。作为将目的基因掺入质粒或将其引 入宿主细胞的方法，可使用例如在Molecular Cloning (Sambrook等人， 1989)中描述的方法。
为了允许目标肽基因在质粒中表达，以使其起作用的方式将启动 子连接于基因的上游。
用于本申请的启动子可为任何启动子，只要它适合于用于表达目
的基因的宿主细胞。例如，当被转化的宿主细胞是埃希氏杆菌属时， 可^f吏用lac启动子、trp启动子、lpp启动子、人PL启动子、recA启 动子等；当宿主细胞是杆菌属时，可使用SP01启动子、SP02启动子 等；当宿主细胞是酵母菌时，可使用GAP启动子、PH05启动子、ADH 启动子等；和当宿主细胞为动物细胞时，可使用SV40-来源的启动子、 逆转录病毒来源的启动子等。
使用包含目的基因的上述得到的载体转化宿主细胞。要使用的宿 主细胞可为细菌(例如埃希氏杆菌属和杆菌属)、酵母菌(例如酵母菌 属、毕赤氏酵母属和假丝酵母属)、和动物细胞(例如CHO细胞和COS 细胞)。液体培养基作为培养基是适合的，并且特别优选培养基包含要 培养的转化细胞生长所需的碳源和氮源。如果期望，可加入维生素、 生长促泌素、血清等。
在培养之后，从培养物分离本发明的肽并且通过常规方法纯化。 例如，从培养的细菌形式或细胞提取目标物质如下进行通过在培养 之后收集细菌形式或细胞、将其悬浮在包含蛋白改性剂(例如盐酸胍) 的緩冲溶液中、用超声等将细菌形式或细胞粉碎、和将其离心。为了 从上清液纯化目标物质，可以使用几种分离和纯化方法，例如凝胶渗透、超滤、透(渗)析、SDS-PAGE和各种色i普技术，根据目标物质的 分子量、溶解度、电荷(等电点)和亲和力，以适当的组合使用上述分 离和纯^1方法。
本发明的去酰基生长素释放肽及其衍生物可以通过常规方法化学 合成。例如，该物质可以如下制备通过液相方法和/或固相方法将具 有保护基的氨基酸缩合、延长肽链、用酸除去全部保护基、和通过上 述纯化方法纯化得到的粗产物。
对于肽的生产方法，已经已知各种方法。本发明的肽还可以通过 已知的方法容易地制备，例如，经典的肽合成方法或固相方法。
对于用于本发明的去酰基生长素释放肽及其衍生物的盐，优选可
药用盐。其实例包括无机碱的盐、有机碱的盐、无机酸的盐、有机酸 的盐、碱性氨基酸的盐和酸性氨基酸的盐。
优选的无机碱的盐的实例包括碱金属盐，例如钠盐和钾盐；碱土 金属盐，例如钓盐和镁盐；铝盐；铵盐；等等。
优选的有机碱的盐的实例包括三甲胺、三乙胺、吡啶、曱基吡啶、 乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、二环己基胺、N，N， -二苄基乙二胺等 的盐。
优选的无机酸的盐的实例包括盐酸、氢溴酸、硝酸、硫酸、磷酸 等的盐。
优选的有机酸的盐的实例包括甲酸、醋酸、三氟乙酸、富马酸、 草酸、酒石酸、马来酸、柠檬酸、琥珀酸、苹果酸、甲磺酸、苯磺酸、 对甲苯磺酸等的盐。
优选的碱性氨基酸的盐的实例包括精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸等的 盐，而优选的酸性氨基酸的盐的实例包括天冬氨酸、谷氨酸等的盐。
在上述盐中，最优选钠盐和钾盐。
关于去酰基生长素释放肽的生理活性，有可能将胞内钙增加活性 用作为指标选择衍生物，使用其中已经发现去酰基生长素释放肽受体
的大鼠胎儿皮肤细胞。作为测量胞内钙离子浓度的方法，可使用已知 的方法。例如，可使用FLIPR(Fluorometric Imaging Plate Reader,Molecular Devices Co. ， Ltd.)，其利用由钓离子浓度波动引起的 Fluo-4 AM (Molecular Probe Co. ， Ltd.)的荧光强度变动(Ko j ima等 人Nature, 402: 656-660 (1999))。此外，为了证实具有钩增加活 性的肽在体外或体内是否具有去酰基生长素释放肽活性，可使用已知 的方法。例如，可以在使[1251]标记的去酰基生长素释放肽结合于大鼠 胎儿的皮肤细胞之后，在结合测定法中通过驱逐实验(ejection experiment)来测量体外活性。为了确认体内去酰基生长素释放肽活 性，在将具有钙增加活性的肽注射到动物的外周静脉中之后测量心肌 细胞凋亡、或脂肪组织或血清中的脂质浓度，或者测量胎儿皮肤中的 钙浓度。对于去酰基生长素释放肽衍生物及其制备方法，可参考例如 J. Med. Chem.， 43, pp. 4370-4376， 2000。
已经发现本发明的去酰基生长素释放肽具有皮肤细胞增殖活性， 并且特别地显著增加胎儿皮肤细胞的数目。
也就是说，本发明的去酰基生长素释放肽可用作皮肤损伤治疗(例 如创伤、擦伤和灼伤)的皮肤再生促进剂的活性成分、用作通过培养皮 肤(例如表皮、真皮、和皮肤)细胞生产培养皮肤细胞片的形成促进剂 的活性成分、和用作在灼伤损伤、难治性皮肤溃疡、遗传性大疱性表 皮松解、褥疮、肥满性瘢痕、胎记、重症过敏性皮肤病和脱发中移植 培养的皮肤时的皮肤修复促进剂和治疗剂的活性成分。
此外，本发明的去酰基生长素释放肽对个体生物的给药用于皮肤 损伤治疗(例如创伤、擦伤和灼伤)的方法；通过培养皮肤(例如表皮、
真皮、和皮肤)细胞生产培养皮肤细胞片的形成促进的方法；在灼伤损
伤、难治性皮肤溃疡、遗传性大疱性表皮松解、褥疮、肥满性瘢痕、 胎记、重症过敏性皮肤病和脱发中移植培养的皮肤时促进皮肤l务复的
方法；和通过修复促进治疗上述疾病的方法。
此外，本发明的去酰基生长素释放肽可用于生产皮肤损伤治疗(例 如创伤、擦伤和灼伤)的皮肤再生促进剂、用于生产通过培养皮肤(例 如表皮、真皮、和皮肤)细胞生产培养皮肤细胞片的形成促进剂、和用 于生产在灼伤损伤、难治性皮肤溃疡、遗传性大疱性表皮松解、褥疮、肥满性瘢痕、胎记、重症过敏性皮肤病和脱发中移植培养的皮肤时的 皮肤修复促进剂和治疗剂。
包含去酰基生长素释放肽或其药理学可接受的盐的本发明的药物 可通过将其与药理学可接受的载体、赋形剂、补充剂等混合用于个体 生物(例如人、小鼠、大鼠、兔、狗、猫、牛、马、猪和灵长类动物)。
优选本发明的药物通过非肠道途径例如静脉内、皮下和肌肉注射 以预定量的单次剂量或多次剂量给予进行皮肤再生治疗的个体。当个 体是成年人，特别是家庭治疗的成年人时，优选经鼻、经肺或栓剂给 药。
在本发明中，对于药物的剂量没有具体限制，并且可以取决于预 定的用途、和个体的年龄、体重、种类、要给药的个体的症状、营养 状况、和并用药物而适当选择。当药物以单次或多次剂量给予成年人
时，作为活性成分的去酰基生长素释放肽的量优选为0. 001 mg到100 mg，更优选为0. 01 fflg到10 mg。
优选将上述剂量每天给药一次或几次，持续1到24周、更优选1 到12周。
可药用载体的实例包括通常用作药物配制材料的各种有机或无机 的栽体物质。将这种载体作为用于固体制剂的赋形剂、润滑剂、粘合 剂或崩解剂混合；和作为用于液体制剂的溶剂、增溶剂、助悬剂、张 力调节剂、緩冲剂和无痛化剂混合。
如果期望，可以使用制剂添加剂例如防腐剂、抗氧化剂、着色剂、 和甜味剂。
优选的赋形剂的实例包括乳糖、蔗糖、D-甘露醇、淀粉、结晶纤 维素、轻质无水硅酸等。
优选的润滑剂的实例包括硬脂酸镁、硬脂酸钙、滑石粉、胶态氧 化硅等。
优选的粘合剂的实例包括结晶纤维素、蔗糖、D-甘露醇、糊精、 羟基丙基纤维素、羟基丙基甲基纤维素、聚乙烯基吡咯烷酮等。
优选的崩解剂的实例包括淀粉、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钙、交联羧曱纤维素钠、羧曱淀粉钠等。
优选的溶剂的实例包括注射溶剂、醇类、丙二醇、聚乙二醇、芝 麻油、玉米油等。
优选的增溶剂的实例包括聚乙二醇、丙二醇、D-甘露醇、苯曱酸 爷酯、乙醇、三氨基曱烷(trisaminomethane)、胆固醇、三乙醇胺、 碳酸钠、柠檬酸钠等。
优选的助悬剂的实例包括表面活性剂，例如硬脂酰三乙醇胺、月 桂硫酸酯钠、月桂酰基氨基丙酸、卵磷脂、苯扎氯铵、节索氯铵、和 单硬脂酸甘油酯；亲水聚合物，例如聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷酮、 羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟甲基纤维素、羟乙基纤维素、和羟 基丙基纤维素；等等。
优选的张力调节剂的实例包括氯化钠、甘油、D-甘露醇等。
优选的緩冲剂的实例包括磷酸盐、乙酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐等。
优选的无痛化剂的实例包括苯曱醇等。
优选的防腐剂的实例包括对羟基苯甲酸酯类、三氯叔丁醇、苯甲 醇、苯乙醇、脱氢乙酸、山梨酸等。
优选的抗氧化剂的实例包括亚硫酸盐、抗坏血酸等。
本发明的药物的优选形式是适于非肠道给药的制剂。适合于非肠 道给药的制剂形式的实例包括用于静脉内、皮内、皮下或肌肉内给药 的可注射溶液；静脉内液体；栓剂；经皮吸收剂；经粘膜吸收剂和吸 入剂。在这些剂型中，优选可注射溶液的形式；特别是在个体是家庭 治疗的成年人时，优选经粘膜的吸收剂、吸入剂和栓剂的剂型。因为 这些制剂形式是本领域技术人员公知的，他们有可能选择适合于预定 给药途径的制剂形式，并且如果期望，他们有可能使用可用于制药工 业的一种或多种添加剂将药物配制为药物组合物的形式。
例如，如下制备和提供可注射溶液或静脉内液体形式的药物通
应用的一种或多种添加剂(例如緩冲溶液、糖溶液、张力调节剂、PH 调节剂、无痛化剂和防腐剂)一起溶解在注射用蒸馏水中、使溶液经过灭菌过滤并将滤液置于安瓿或小瓶中，或者将得到的滤液冻干以生产 冻干剂型。添加剂的实例包括糖类，例如葡萄糖、甘露醇、木糖醇和
乳糖；亲水聚合物，例如聚乙二醇；醇类，例如甘油；氨基酸，例如 甘氨酸；蛋白质，例如血清白蛋白；盐，例如NaCl和柠檬酸钠；酸类， 例如醋酸、酒石酸和抗坏血酸；表面活性剂，例如吐温80;还原剂， 例如亚硫酸钠；等等。这些制剂通过在使用时将它们溶解于注射用蒸 馏水或盐水溶液中而作为可注射溶液或静脉内液体使用。用于鼻内给 药(经鼻给药)的药剂例如滴鼻剂和鼻内喷雾剂对于经粘膜给药来说也 是优选的，并且对于经肺给药还优选吸入剂等。
优选每个单位制剂的活性成分(例如去酰基生长素释放肽、其衍生 物、或其药理学可接受的盐)的含量为0. OOlmg到100mg，优选为0.01 mg到10 mg，将其每天给药一次或几次。
如下处理分离的皮肤细胞将分离的皮肤细胞在培养溶液中培养， 随后将0. 1 nM到1 uM、优选1 nM到100 nM的去酰基生长素释放肽、 其衍生物、或其药理学可接受的盐加入到通过灭菌过滤或高压灭菌制 备的培养溶液中。也就是说，优选使用的培养溶液包含0.0000001 mg/mL到0. 1 mg/fflL的作用于GHS-Rla的物质用于增殖皮肤细胞。如 实施例2中所示，这种处理促进了皮肤细胞的增殖，所述皮肤细胞在 正常情况下几乎没有增殖进展。
实施例
以下通过实施例具体地描述本发明。
(实施例1) 去酰基生长素释放肽在培养的大鼠胎儿皮肤细胞中
的胞内钙增加活性
将妊娠第17天的Wistar大鼠在麻醉下进行剖腹手术，取出胎儿。 从胎儿取得一小片皮肤，用在冷的Hank's溶液中的胶原酶处理，用 木瓜蛋白酶消化，并且通过移液管吸取机械分离。这样得到胎儿皮肤 细胞的分散液。从分散液得到单个细胞，向其中加入生长素释放肽，并且进行钩成像。对于钓成像，使用钓成像设备(IMACS, Hamamatsu Photonics)。也就是说，在通过340 nm/380 nm光进行激发时测量510 認波长的发射的比例。将Fura-2用作钙显像剂。使用得自大鼠的去 酰基生长素释放肽(SEQ ID NO: 3)。
结果表示在图1中。在图1中，I、 II和III是拍照的点，但是 在本说明书中省略了照片。实线曲线显示响应生长素释放肽的细胞， 而虛线曲线显示响应去酰基生长素释放肽的另一细胞。分别将生长素 释放肽和去酰基生长素释放肽加入到不同的细胞中。
当去酰基生长素释放肽(l x l(T6 M)作用于单个大鼠胎儿的皮肤细 胞时，观察到胞内4丐增加。这表明在大鼠胎儿的皮肤细胞中存在有响 应去酰基生长素释放肽的受体，并且加入去酰基生长素释放肽增加胞 内钙，诱导去酰基生长素释放肽的活性。
(实施例2) 去酰基生长素释放肽和去酰基生长素释放肽 (1-15)-冊2在培养的胎儿皮肤细胞中的增殖活性
从妊娠第17天的Wistar大鼠取得大鼠胎儿的皮肤细胞，并以与 实施例l相同的方法得到其分散液。将分散的细胞悬浮在包含2%胎牛 血清、青霉素(100U/mL)、链霉素(100 jiig/mL)和表皮生长因子EGF(5 ng/mL)的MCDB15 3HAA培养基(F-Peptide Co. ， Ltd., Yamagata, Japan) 中，并且以3x 104细胞/孔的量接种在聚乙烯亚胺涂层的96孔多孔 板上。向其中加入去酰基生长素释放肽(O. 05到500 pmol/mL(nM))或 去酰基生长素释放肽(1-15)-NH2(SEQ ID NO: 22) (0. 001到1 pmol/mL(nM))和5-溴-2，-脱氧尿苷(BrdU)(，)，然后培养24小时。
a-i5)、-NH2的培养l用作对照。在培养:束之后，:集细胞:然后使
用 Proliferation ELISA Kit (Roche Diagnostic GmbH. Manheim， Germany)测量摄入到胎儿皮肤细胞中的BrdU的量，以研究皮肤细胞生 长活性。
结果如图2中所示。当去酰基生长素释放肽和去酰基生长素释放肽(1-15) -NH2作用于 培养的胎儿皮肤细胞时，BrdU的摄入增加。因此，证实了去酰基生长 素释放肽或去酰基生长素释放肽(1-15)-冊2具有允许胎儿皮肤细胞增 殖的活性。
本发明的皮肤损伤治疗剂、皮肤再生促进剂、培养皮肤细胞的生 长促进方法、和皮肤再生促进方法可以应用于药学和医学领域。
权利要求
1.用于皮肤损伤的治疗剂，包含去酰基生长素释放肽或具有与去 酰基生长素释放肽实质上相同生理活性的肽、或其可药用盐作为活性成
2. 权利要求l的治疗剂，其中活性成分为选自以下的肽或其可药 用盐(i)具有如SEQ ID NO: 1到SEQ ID NO: 21所示氨基酸序列的肽， (ii)具有如SEQ ID NO: 1到SEQ ID NO: 21所示氨基酸序列的N末端 到第四个氨基酸残基的氨基酸序列并且从第五氨基酸残基到C末端的氨 基酸序列中缺失、置换和/或添加一个或几个氨基酸的肽，(iii)(l)和 (2)的肽，其中C末端被酰胺化。
3. 权利要求2的治疗剂，其中活性成分为具有由SEQ ID NO 1 表示的氨基酸序列的舦或其可药用盐。
4. 权利要求2的治疗剂，其中活性成分是具有由SEQ ID NO 1 表示的氨基酸序列的N末端到第15个氨基酸残基的氨基酸序列的肽或 其可药用盐，其中笫15个氨基酸被酰胺化。
5. 权利要求1到4中任一项的治疗剂，包括每个单位制剂0. 001 mg 到100 mg的量的活性成分。
6. 皮肤再生促进剂，包含去酰基生长素释放肽或具有与去酰基生 长素释放肽实质上相同生理活性的肽、或其可药用盐作为活性成分。
7. 权利要求6的皮肤再生促进剂，其中活性成分为选自以下的肽 或其可药用盐(i)具有如SEQ ID NO: 1到SEQ ID NO: 21所示氨基酸 序列的肽，(ii)具有如SEQ ID NO: 1到SEQ ID NO: 21所示氨基酸序列的N末端到第四个氨基酸残基的氨基酸序列并且从第五氨基酸残基到 C末端的氨基酸序列中缺失、置换和/或添加一个或几个氨基酸的肽， (iii) (1)和(2)的肽，其中C末端被酰胺化。
8. 权利要求7的皮肤再生促进齐'J，其中活性成分为具有由SEQ ID NO: 1表示的氨基酸序列的肽或其可药用盐。
9. 权利要求7的皮肤再生促进剂，其中活性成分是具有由SEQ ID NO : 1表示的氨基酸序列的N末端到第15个氨基酸残基的氨基酸序列 的肽或其可药用盐，其中第15个氨基酸被酰胺化。
10. 权利要求6到9中任一项的皮肤再生促进剂，包括每个单位制 剂0. 001 mg到100 mg的量的活性成分。
11. 用于促进培养皮肤细胞增殖的方法，使用去酰基生长素释放肽 或具有与去酰基生长素释放肽实质上相同生理活性的肽、或其可药用盐作为活性成分。
12. 权利要求11的方法，其中活性成分为选自以下的肽或其可药 用盐(i)具有如SEJJ ID NO: 1到SEQ ID NO: 21所示氨基酸序列的肽， (ii)具有如SEQ ID NO: 1到SEQ ID NO: 21所示氨基酸序列的N末端剖第四个氨基酸残基的氨基酸序列并且从第五氨基酸残基到C末端的氨 基酸序列中缺失、置换和/或添加一个或几个氨基酸的肽，(iii)(l)和 (2)的肽，其中C末端被酰胺化。
13. 权利要求12的方法，其中活性成分为具有由SEQ ID NO : 1 表示的氨基酸序列的肽或其可药用盐。
14. 权利要求12的方法，其中活性成分是具有由SEQ ID NO : 1表示的氨基酸序列的N末端到第15个氨基酸残基的氨基酸序列的肽或 其可药用盐，其中第15个氨基酸被酰胺化。
15. 权利要求11到14中任一项的方法，其中培养皮肤细胞的增殖 在包含0.0000001 mg/mL到0. 1 mg/mL量的活性成分的培养基中进行。
16. 皮肤损伤的治疗方法，包括对需要治疗皮肤损伤的哺乳动物给 实质上相同生理活性的肽、或其可药用盐。
17. 权利要求16的方法，其中活性成分为选自以下的肽或其可药 用盐(i)具有如SEQ ID NO: 1到SEQ ID NO: 21所示氨基酸序列的肽， (ii)具有如SEQ ID NO: 1到SEQ ID NO: 21所示氨基酸序列的N末端 到第四个氨基酸残基的氨基酸序列并且从第五氨基酸残基到C末端的氨 基酸序列中缺失、置换和/或添加一个或几个氨基酸的肽，(iii)(l)和 (2)的肽，其中C末端被酰胺化。
18. 权利要求17的方法，其中活性成分为具有由SEQ ID NO : 1 表示的氨基酸序列的肽或其可药用盐。
19. 权利要求17的方法，其中活性成分是具有由SEQ ID NO : 1 表示的氨基酸序列的N末端到第15个氨基酸残基的氨基酸序列的肽或 其可药用盐，其中第15个氨基酸被酰胺化。
20. 权利要求16到19中任一项的方法，其中活性成分以每次给药 0. 001 mg到100 mg的量给药。
21.促进皮肤再生的方法，包括对需要皮肤再生的哺乳动物给予作上相同生理活性的肽、或其可药用盐。
22. 权利要求21的方法，其中活性成分为选自以下的肽或其可药 用盐(i)具有如SEQ ID N0: 1到SEQ ID NO: 21所示氨基酸序列的肽， (ii)具有如SEQ ID NO: 1到SEQ ID NO: 21所示氨基酸序列的N末端 到第四个氨基酸残基的氨基酸序列并且从第五氨基酸残基到C末端的氨 基酸序列中缺失、置换和/或添加一个或几个氨基酸的肽，(iii)(l)和 (2)的肽，其中C末端被酰胺化。
23. 权利要求22的方法，其中活性成分为具有由SEQ ID NO : 1 表示的氨基酸序列的肽或其可药用盐。
24. 权利要求22的方法，其中活性成分是具有由SEQ ID NO : 1 表示的氨基酸序列的N末端到第15个氨基酸残基的氨基酸序列的肽或 其可药用盐，其中第15个氨基酸被酰胺化。
25. 权利要求21到24中任一项的方法，其中活性成分以每次给药 0. 001 mg到100 mg的量给药。
26. 去酰基生长素释放肽或具有与去酰基生长素释放肽实质上相 同的生理活性的肽、或其可药用盐作为活性成分用于生产皮肤损伤治疗 剂的用途。
27. 权利要求26的应用，其中活性成分为选自以下的肽或其可药 用盐(i)具有如SEQ ID NO: 1到SEQ ID NO: 21所示氨基酸序列的肽，(ii)具有如SEQ ID NO: 1到SEQ ID NO: 21所示氨基酸序列的N末端 到第四个氨基酸残基的氨基酸序列并且从第五氨基酸残基到C末端的氨 基酸序列中缺失、置换和/或添加一个或几个氨基酸的肽，(iii)(l)和(2)的肽，其中C末端被酰胺化。
28. 权利要求27的应用，其中活性成分为具有由SEQ ID NO : 1 表示的氨基酸序列的肽或其可药用盐。
29. 权利要求27的应用，其中活性成分是具有由SEQ ID NO : 1 表示的氨基酸序列的N末端到第15个氨基酸残基的氨基酸序列的肽或 其可药用盐，其中第15个氨基酸被酰胺化。
30. 权利要求26到29中任一项的应用，其中皮肤损伤治疗剂包含 每个单位制剂0. 001 mg到100 mg的量的活性成分。
31. 去酰基生长素释放肽或具有与去酰基生长素释放肽实质上相 同生理活性的肽、或其可药用盐作为活性成分用于生产皮肤再生促进剂 的用途。
32. 权利要求31的应用，其中活性成分为选自以下的肽或其可药 用盐(i)具有如SEQ ID NO: 1到SEQ ID NO: 21所示氨基酸序列的肽，(ii)具有如SEQ ID NO: 1到SEQ ID NO: 21所示氨基酸序列的N末端 到第四个氨基酸残基的氨基酸序列并且从第五氨基酸残基到C末端的氨 基酸序列中缺失、置换和/或添加一个或几个氨基酸的肽，(iii)(l)和(2)的肽，其中C末端被酰胺化。
33. 权利要求32的应用，其中活性成分为具有由SEQ ID NO : 1 表示的氨基酸序列的肽或其可药用盐。
34. 权利要求32的应用，其中活性成分是具有由SEQ ID NO : 1 表示的氨基酸序列的N末端到笫15个氨基酸残基的氨基酸序列的肽或 其可药用盐，其中第15个氨基酸被酰胺化。
35.权利要求31到34中任一项的应用，其中皮肤再生促进剂包含 每个单位制剂0. 001 mg到100 mg的量的活性成分。
全文摘要
本发明提供新颖的皮肤损伤治疗剂和皮肤再生促进剂。所述皮肤损伤治疗剂和皮肤再生促进剂包含去酰基生长素释放肽或其可药用盐作为活性成分。
文档编号A61P17/00GK101312739SQ20068004343
公开日2008年11月26日 申请日期2006年11月21日 优先权日2005年11月21日
发明者中原桂子, 寒川贤治, 村上昇, 林友二郎 申请人:国立大学法人宫崎大学;国立循环器病中心总长代表的日本国;阿斯比奥制药株式会社