专利名称：疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及核酸构建体、含有这种构建体的宿主细胞以及它们在核酸疫苗中的应用。本发明进一步涉及含有这种构建体的疫苗制剂以及这种制剂在药物中的应用。本发明特别涉及用于HIV感染的预防和治疗的DNA疫苗，更特别的是以颗粒介导的释放方式施用疫苗。
背景技术：
HIV-1是获得性免疫缺陷综合症(AIDS)的主要原因，这种疾病被认为是全球主要的健康问题之一。尽管全世界为了生产相关疫苗进行了广泛的研究，但是迄今为止这些努力尚未获得成功。
已经描述了HIV-1的非包膜蛋白，包括例如内部结构蛋白，如gag和pol基因的产物，及其它非结构蛋白如Rev、Nef、Vif和Tat(Green等，New England J.Med，324，5，308以及下列等等(1991)和Bryant等，(Pizzo编辑)，Pediatr.Infect.Dis.J.，11，5，390以及下列等等(1992)。
Gag基因的全长RNA翻译产生多蛋白前体，随后该前体被酶切成为3-5个衣壳蛋白；基质蛋白、衣壳蛋白和核酸结合蛋白以及蛋白酶(1.Fundamental Virology，Fields BN，Knipe DM和Howley M 1996；2.Fields Virology，vol 2 1996)。
所述gag基因产生55-千道尔顿(kD)的Gag前体蛋白，也称为p55，它是从未剪接的病毒mRNA表达产生的。在翻译过程中，p55的N末端被十四酰化，使其与细胞膜的胞质相缔合。膜缔合的Gag多蛋白使两个拷贝的病毒基因组RNA连同其它病毒和细胞蛋白聚集而引起病毒颗粒在感染细胞的表面产生芽接。芽接后，在病毒成熟过程中p55被病毒编码的蛋白酶(pol基因的产物)酶切成为被称做MA(基质[p17])、CA(衣壳[p24])、NC(核壳[p9])和p6.(4)的四个较小蛋白质。
除了3个主要的Gag蛋白之外，所有的Gag前体含有一些其它的区域，它们被酶切成各种大小的肽，保留于病毒粒子中。这些蛋白质具有不同的作用，例如p2蛋白被认为在调节蛋白酶的活性方面具有作用，并有助于校正蛋白水解过程的时间。
MA多蛋白衍生自p55的十四酰化N末端。大多数MA分子保持与病毒粒子的脂双分子层的内表面连接，以稳定病毒颗粒。在病毒粒子较深层的内部聚集其它的MA，而成为携带病毒DNA进入细胞核的复合体的一部分。(5)这些MA分子促进病毒基因组的核转移，因为MA上的亲核信号可被细胞核输入系统所识别。这种情况使HIV可以感染未分裂的细胞，这是反转录病毒的一个不寻常的特性。
p24(CA)蛋白形成病毒颗粒的锥形核。已证实亲环蛋白A与p55的p24区域相互作用，而掺合到HIV颗粒中。因为环孢菌素可以阻止这种相互作用而抑制病毒的复制，所以Gag和亲环蛋白A之间的相互作用是必需的。
Gag的NC区域负责特异性识别所谓的HIV包装信号。所述包装信号由位于病毒RNA的5’末端附近的4个茎环结构组成，足以介导异源RNA整合到HIV-1病毒粒子中。NC通过由两个锌指基序介导的相互作用而与包装信号相结合。NC还促进逆转录进行。
p6多肽区域介导了p55 Gag和辅助蛋白Vpr之间的相互作用，使Vpr整合到组装好的病毒粒子中。p6区域还含有一个所谓的晚期结构域，这是芽接病毒粒子从感染细胞有效释放所需要的。
Pol基因编码包含病毒早期感染时所需要的具有各别活性的两种蛋白质，即将病毒DNA整合进入细胞DNA所需的RT和整合酶蛋白。Pol的最初产物被病毒粒子蛋白酶切割，产生含有DNA合成所必需的活性(RNA和DNA定向的DNA聚合酶，核酶H)的氨基端RT肽以及羧基端整合酶蛋白。
HIV RT是全长RT(p66)和缺乏羧基末端的RNA酶整合酶结构域的酶切产物(p51)的异源二聚体。
RT是反转录酶病毒基因组所编码的保守性最高的蛋白质之一。RT的两个主要活性是DNA Pol和核酶H。RT的DNA Pol活性可交替使用RNA和DNA为模板，并且如所有已知的DNA聚合酶一样，不能起始DNA的从头合成，而需要一个预先存在的分子作为引物(RNA)。
当DNA合成发生时，在所有的RT蛋白中所固有的RNA酶H的活性在除去RNA基因组复制早期中起着重要作用。它选择性地从所有RNA-DNA杂合分子中降解RNA。聚合酶和核酶H在结构上是分离的、具有非重叠结构域，其中Pol覆盖了Pol的三分之二的氨基。
p66催化亚基折叠成5个不同的亚结构域。这些亚结构域的氨基末端23包含具有RT活性的部分，羧基末端是RNA酶H结构域。
感染宿主细胞后，逆转录病毒RNA基因组通过感染颗粒中的反转录酶而被复制成线性双链DNA。整合酶(参见Skalka AM’99 Adv inVirus Res 52 271-273)识别和修饰病毒DNA的末端，并伴随病毒DNA进入宿主染色体位点以进行催化整合。宿主DNA中有许多位点可成为整合的靶标位点。尽管整合酶在体外足以催化整合，但在体内它不是唯一与病毒DNA结合的蛋白质，从感染的细胞中分离的大蛋白-病毒DNA复合体被称为预整合复合体。这促进子代病毒基因组获得宿主细胞的基因。
整合酶由3个不同的结构域组成，即N末端结构域、催化核心和C末端结构域。催化核心结构域中包含了多核苷酸转移化学反应的所有要素。
已知Nef蛋白可引起CD4、HIV受体从细胞表面的去除，但对于这种功能的生物学重要性还存在争议。此外，Nef与T细胞的信号途径相互作用并诱导成激活状态，这反过来可促进更有效的基因表达。一些HIV分离物在该区域存在突变，导致不编码有功能的蛋白而严重影响它们在体内的复制和致病过程。
DNA疫苗通常包括插入了强启动子的细菌质粒载体和感兴趣的基因所组成，所述基因编码抗原肽和聚腺苷酸化/转录终止序列。感兴趣的基因可编码全蛋白或仅编码与想要预防的病原体、肿瘤或其它病因有关的抗原肽序列。在施用给宿主之前，质粒可在细菌例如大肠杆菌中生长，然后分离并在适当介质中制备质粒，所用介质取决于施用途径。施用后，质粒为宿主细胞所摄取，并在其中产生编码的肽。为了防止质粒在哺乳动物宿主中复制和在有关动物中对染色体DNA的整合，优选地，质粒载体被制备成不具有在真核细胞中发挥功能的复制起点。
相对于传统的疫苗接种技术，DNA疫苗接种具有许多优越性。首先，由于DNA序列编码的蛋白质在宿主中合成，可预测蛋白质的结构和构象将与疾病有关的天然蛋白质相似。通过产生可以识别保守蛋白质的抗原决定簇的细胞毒素T淋巴细胞反应，DNA疫苗接种还可能抵抗不同病毒株系。而且，由于质粒为宿主细胞所摄取并在其中生产抗原蛋白，可激发长期的免疫反应。DNA疫苗接种还可结合各种不同的免疫原而可能制成单一制剂，因而促进对许多种疾病的同时免疫。
有关DNA疫苗接种的有用的背景资料描述于Donnelly等“DNAvaccines”Ann.Rev Immunol.1997 15617-648，本文引用该文公开的全部内容作为参考。
发明概述本发明提供用于预防和治疗HIV感染和AIDS的核酸疫苗的新构建体。
相应地，作为第一个方面，本发明提供了一种核酸分子，其含有编码HIV gag蛋白或其片段的核苷酸序列和与其连接的编码了其它HIV抗原或其片段的核苷酸序列，这些核苷酸序列与异源启动子可操作地连接。所述核苷酸序列的片段编码HIV表位，并典型地编码至少8个氨基酸的肽。核苷酸序列优选地是DNA序列，并优选地包含于没有复制起始的质粒中。这种核酸分子与药用的赋形剂、载体、稀释剂或佐剂一起配制，生产适合于治疗和/或预防HIV感染和AIDS的药物组合物。
在一个优选的实施方案中，DNA序列被配制在适合于以颗粒作为介质传递药物的惰性颗粒(particle)或小珠(bead)的表面。优选地，小珠是金的。
在本发明一个优选的实施方案中，提供含有gag蛋白高度表达的密码的DNA序列，所述序列已被优化成与哺乳动物细胞中基因所使用的密码子相似。具体地说，所述gag蛋白被优化成类似于高度表达的人类基因。
DNA密码分别由4个字母(A、T、C和G)表示，并使用它们拼写成代表生物体基因编码蛋白质的氨基酸的三个字母所表示的“密码子”。沿着DNA分子的顺序排列的密码子被翻译成由那些基因编码的蛋白质中氨基酸的序列。密码子具有高度简并性，其中61个密码子编码20个常见氨基酸(即蛋白质氨基酸)和3个密码子代表“终止”信号。因此，大多数氨基酸由不止一个密码子所编码-事实上，有些氨基酸是由四个或更多不同的密码子所编码。
不止一个密码子编码了同一个特定的氨基酸，人们已观察到生物体中密码子的使用模式是高度不随机的。不同物种，在密码子选择上显示了不同的偏好性，而且在同一物种中，在以高水平和低水平表达的基因之间的密码子使用模式可以非常不同。这种偏好性在病毒、植物、细菌和哺乳动物细胞中是不同的，并且某些物种比其他物种显示出更高的非随机密码子选择的偏好性。例如，人和其他哺乳动物比某些细菌或病毒的偏好性要弱。由于这些原因，在大肠杆菌中表达哺乳动物基因或在哺乳动物细胞中表达外源或重组基因时，对于有效表达而言密码子分布是非常有可能不适当。在异源DNA序列中存在的密码子簇或者丰富的密码子在将要用于表达的宿主中很少观察到，则往往预示着在该宿主中对该异源基因的表达水平将很低。
在本发明的一个实施方案中，提供了一个编码氨基酸序列的gag多核苷酸序列，其中多核苷酸序列的密码子使用模式与高度表达的哺乳动物基因的密码子使用模式相似。优选地，多核苷酸序列是DNA序列。理想地，多核苷酸序列的密码子使用模式是典型的高度表达的人类基因。
在本发明的多核苷酸中，密码子使用模式从人免疫缺陷病毒的密码子典型模式改变为更接近靶标生物体的密码偏好性的使用模式，例如哺乳动物，特别是人。“密码子使用系数(codon usage coefficient)”衡量给定的多核苷酸序列的密码子模式与靶标物种的密码子模式相似的程度。许多物种的高度表达基因的密码子出现频率可从已有文献资料中获得(参见，例如，Nakamura等，Nucleic Acids Rearch 1996，24214-215)。将61个密码子中每一个密码子的出现频率(用所选择基因类别中每1000个密码子中出现的数量来表示)对20个常见氨基酸中每一个进行标准化，将每一个氨基酸最频繁使用的密码子的值设定为1，使用较少的密码子的频率范围将在0和1之间。这样，对于靶标物种的高度表达基因，61个中的每一个密码子被确定为值1或更低。为了计算某一特定多核苷酸的密码子相对于该物种的高度表达基因的使用系数，记录该特定多核苷酸的各个密码子的测量值，并且计算出所有这些值的几何平均值(这些值的自然对数之和除以密码子的总数，并取反对数)。该系数的值在0和1之间，并且密码子的系数越高，多核苷酸中对该密码子的使用更为频繁。如果多核苷酸序列的某一密码子使用系数为1，对于靶标物种的高度表达基因而言，所有密码子均为“最频繁出现”的密码子。
依据本发明，多核苷酸的密码子利用模式优先地排除在靶标生物体的高度表达基因中RSCU值小于0.2的密码子。可选地，该密码子利用模式排除编码特定氨基酸少于10％的密码子。如果所述氨基酸的所有密码子利用频率相同，那么相对同义密码子利用率(RSCU)值是密码子的观测数量除以预测数量。对于高度表达的人类基因，本发明的多核苷酸一般具有大于0.3，优选大于0.4，最优选大于0.5的密码子使用系数(或RSCU)。人的密码子利用率表还可在Genebank中查到。
经比较，高度表达的β肌动蛋白基因的RSCU值为0.747。人(homosapiens)的密码子利用率表如下密码子利用率表1人(homo sapiens)[gbpri]27143 CDS’s(12816923个密码子)范围(fields)[三联体][频率每1000个]([数量])UUU 17.0(217684) UCU 14.8(189419) UAU 12.1(155645) UGU 10.0(127719)UUC 20.5(262753) UCC 17.5(224470) UAC 15.8(202481) UGC 12.3(157257)UUA 7.3( 93924) UCA 11.9(152074) UAA 0.7( 9195) UGA 1.3( 16025)UUG 12.5(159611) UCG 4.5( 57572) UAG 0.5( 6789) UGG 12.9(165930)CUU 12.8(163707) CCU 17.3(222146) CAU 10.5(134186) CGU 4.6( 59454)CUC 19.3(247391) CCC 20.0(256235) CAC 14.9(190928) CGC 10.8(137865)CUA 7.0( 89078) CCA 16.7(214583) CAA 12.0(153590) CGA 6.3( 80709)CUG 39.7(509096) CCG 7.0( 89619) CAG 34.5(441727) CGG 11.6(148666)AUU 15.8(202844) ACU 12.9(165392) AAU 17.0(218508) AGU 12.0(154442)AUC 21.6(277066) ACC 19.3(247805) AAC 19.8(253475) AGC 19.3(247583)AUA 7.2( 92133) ACA 14.9(191518) AAA 24.0(308123) AGA 11.5(147264)AUG 22.3(285776) ACG 6.3( 80369) AAG 32.6(418141) AGG 11.3(145276)
GUU 10.9(139611) GCU 18.5(236639) GAU 22.4(286742) GGU 10.8(138606)GUC 14.6(187333) GCC 28.3(362086) GAC 26.1(334158) GGC 22.7(290904)GUA 7.0( 89644) GCA 15.9(203310) GAA 29.1(373151) GGA 16.4(210643)GUG 28.8(369006) GCG 7.5( 96455) GAG 40.2(515485) GGG 16.4(209907)编码GC 52.51％第一个字母GC 56.04％第二个字母GC 42.35％第三个字母GC 59.13％。
密码子利用率表2(优选的)人(高度表达的)基因1/24/91的密码子利用率(human-high.cod)氨基酸 密码子数量 /1000分数(fraction)Gly GGG 905.0018.760.24Gly GGA 525.0010.880.14Gly GGT 441.009.14 0.12Gly GGC 1867.00 38.700.50Glu GAG 2420.00 50.160.75Glu GAA 792.0016.420.25Asp GAT 592.0012.270.25Asp GAC 1821.00 37.750.75Val GTG 1866.00 38.680.64Val GTA 134.002.78 0.05Val GTT 198.004.10 0.07Val GTC 728.0015.090.25Ala GCG 652.0013.510.17Ala GCA 488.0010.120.13Ala GCT 654.0013.560.17Ala GCC 2057.00 42.640.53Arg AGG 512.0010.610.18Arg AGA 298.006.18 0.10Ser AGT 354.007.34 0.10Ser AGC 1171.00 24.270.34Lys AAG 2117.00 43.880.82Lys AAA 471.009.76 0.18Asn AAT 314.006.51 0.22Asn AAC 1120.00 23.220.78Met ATG 1077.00 22.321.00Ile ATA 88.00 1.82 0.05Ile ATT 315.006.53 0.18Ile ATC 1369.00 28.380.77Thr ACG 405.008.40 0.15
ThrACA373.007.73 0.14ThrACT358.007.42 0.14ThrACC1502.00 31.13 0.57TrpTGG652.0013.51 1.00EndTGA109.002.26 0.55CysTGT325.006.74 0.32CysTGC706.0014.63 0.68EndTAG42.00 0.87 0.21EndTAA46.00 0.95 0.23TyrTAT360.007.46 0.26TyrTAC1042.00 21.60 0.74LeuTTG313.006.49 0.06LeuTTA76.00 1.58 0.02PheTTT336.006.96 0.20PheTTC1377.00 28.54 0.80SerTCG325.006.74 0.09SerTCA165.003.42 0.05SerTCT450.009.33 0.13SerTCC958.0019.86 0.28ArgCGG611.0012.67 0.21ArgCGA183.003.79 0.06ArgCGT210.004.35 0.07ArgCGC1086.00 22.51 0.37GlnCAG2020.00 41.87 0.88GlnCAA283.005.87 0.12HisCAT234.004.85 0.21HisCAC870.0018.03 0.79LeuCTG2884.00 59.78 0.58LeuCTA166.003.44 0.03LeuCTT238.004.93 0.05LeuCTC1276.00 26.45 0.26ProCCG482.009.99 0.17ProCCA456.009.45 0.16ProCCT568.0011.77 0.19ProCCC1410.00 29.23 0.48本发明的另一个方面提供了一种表达载体，含有并能够调控本发明第一个方面所述多核苷酸序列的表达，特别是gag多核苷酸序列的密码子使用模式是典型的高度表达的哺乳动物基因，优选地是高度表达的人类基因。所述载体可适合于在细菌、昆虫或哺乳动物细胞、特别是人细胞中的表达异源DNA。在一个实施方案中，所述表达载体是p7313(见
图1)。
在第三个实施方案中，提供了与编码NEF及其片段、或HIV反转录酶(RT)或其片段的DNA序列融合的异源启动子控制下的gag基因。所述基因的gag部分可以在融合体的N或C端部分。
在一个优选的实施方案中，gag基因不编码gag p6肽。优选地，NEF基因是截短的即除去了编码N末端区域的序列，也即除去30-85，优选地60-85，典型的约81，优选地N末端的65个氨基酸。
在另一个实施例中，RT基因也被优化成与高度表达的人类基因相似。所述RT优选地编码一个突变以基本上失活了任何反转录酶的活性。一个优选的失活突变包括用W色氨酸229代替K(赖氨酸)。
根据本发明的另一个方面，宿主细胞含有本发明所述的多核苷酸序列，或者本发明所提供的表达载体。所述宿主细胞可以是细菌，例如大肠杆菌；哺乳动物，例如人；或者是昆虫细胞。含有本发明提供的载体的哺乳动物细胞可以是培养细胞，可体外转染，或者可通过给予哺乳动物载体而发生体内转染。
本发明进一步提供了含有本发明的多核苷酸序列的药物组合物。优选地，所述组合物含有DNA载体。在优选的实施方案中，所述组合物含有大量颗粒，优选地是金颗粒，为含有编码本发明的多核苷酸序列的载体的DNA所包被。优选地，编码HIV gag氨基酸序列的多核苷酸序列的密码使用模式是典型的高度表达的哺乳动物基因，特别是人的基因。在可选的实施方案中，所述组合物含有药用的赋形剂以及根据本发明第二个方面的DNA载体。所述组合物还可包括佐剂。
因而，本发明的一个实施方案是本发明的载体与免疫刺激剂一起利用。优选地，免疫刺激剂与本发明的核酸载体同时给药，并且在优选的实施方案中它们一起配制。这种免疫刺激剂包括，但这里决非全面列举，也不排除其他的免疫刺激剂合成咪唑并喹啉(imidazoquinoline)例如咪喹莫特(imiquimod)(p14)[S-26308，R-837]，(Harrison等，“单独使用咪喹莫特或与糖苷配基蛋白质疫苗结合使用减少HSV疾病的复发”，Vaccine 191820-1826，(2001))；和resiquimod[S-28463，R-848](Vasilakos等，“免疫反应修饰基因R-848的佐剂活性与CpG ODN’的比较”，细胞免疫学(Cellularimmunology)20464-74(2000))，在抗原递呈细胞和T-细胞表面组成型表达的羰基和胺的Schiff碱基，例如tucaresol(Rhodes，J.等，“通过共刺激Schiff-碱基-形成药物免疫系统的治疗效果增强”，Nature 3777175(1995))，细胞因子、趋化因子和共-刺激分子的蛋白质或肽，包括促炎细胞因子例如GM-CSE、IL-1α、IL-1β、TGF-α和TGF-β，Th1诱导剂例如干扰素γ、IL-2、IL-12、IL-15和IL-18，Th2诱导剂例如IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和IL-13和其它趋化因子以及共-刺激基因例如MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、RANTES、TCA-3、CD80、CD86和CD40L，以及其它免疫刺激靶向配基例如CTLA-4和L-选择蛋白、细胞程序死亡刺激蛋白和肽例如Fas，(49)、合成脂基佐剂，例如vaxfectin，(Reyes等，“Vaxfectin增强抗原特异性抗体的效价并保持对质粒DNA免疫的Th1型的免疫反应”，Vaccine193778-3786)角鲨烯、α-生育酚、聚山梨醇酯80、DOPC和胆固醇、内毒素、[LPS](Beutler，B，“内毒素，Toll-样受体4和先天免疫性的传入支”，现代微生物学观点(Current Opinion inMicrobiology)，323-30(2000))；CpG寡-和二-核苷酸(Sato，Y.等，“有效皮内基因免疫所必需的免疫刺激DNA序列”，Science 273(5273)352-354(1996)。Hemmi，H等，“一种Toll-样受体识别细菌DNA”，Nature 408740-745，(2000))、以及其它引发Toll受体产生Th1-诱导细胞因子的潜在的配基，例如合成的分枝杆菌脂蛋白、分枝杆菌蛋白p19、肽聚糖磷壁质和类脂A。
激发主要的Th1-型反应的某些优选的佐剂包括，例如，类脂A的衍生物，例如单磷酰类脂A，或优选地3-去-O-酰化单磷酰类脂A。MAL佐剂可从Corixa Corporation购得(Seattle，WA；见例如，美国专利4,436,727、4,877,611、4,866,034和4,912,094)。包含CpG的寡核苷酸(其中CpG二核苷酸未甲基化)也诱导主要的Th1反应。这种寡核苷酸是众所周知的，并描述于例如，WO 96/02555、WO99/33488和美国专利6,008,200和5,856,462。免疫刺激DNA序列也在例如Sato等，Science 273352，1996中有描述。另一种优选的佐剂包括皂苷，例如Quil A，或其衍生物，包括QS21和QS7(AquilaBiopharmaceuticals Inc.，Framingham，MA)、七叶皂苷、毛地黄皂苷、或Gypsophila或奎藜籽皂苷(Chenopodium quinoa saponins)。
还提供了根据本发明的多核苷酸或根据本发明的载体在治疗或预防HIV感染的应用。
本发明还提供了治疗HIV或预防HIV感染、及任何与之有关的症状或疾病的方法，包括给予有效量的本发明多核苷酸、载体或药物组合物。药物组合物可采取一或多个单独剂量方式给予，例如用相同DNA质粒的重复剂量，或以一种“初次免疫-加强免疫”(prime-boost)的治疗接种方式。在某些情况下，“初次”接种可通过颗粒介导DNA释放本发明的多核苷酸，优选地整合到质粒衍生载体中，而“加强免疫”通过给予含有同样的多核苷酸序列的重组病毒载体进行，或者用佐剂中的蛋白质加强。相反地，初次免疫可使用病毒载体或典型地在佐剂中配制蛋白质的蛋白质制剂，而加强免疫使用本发明的DNA疫苗。可采用多次剂量的初次免疫和/或加强免疫。
涉及gag、nef或RT蛋白的片段的实施方案也得到了考虑。例如，本发明的多核苷酸可编码HIV gag、nef或RT蛋白的片段。一种多核苷酸编码至少8个氨基酸的片段，例如长度为8-10个氨基酸或高达20、50、60、70、80、100、150或200个氨基酸，只要所编码的寡肽或多肽显示了HIV抗原性，均认为属于本发明的范围。特别地，但并不是唯一的，本发明的这一方面包含多核苷酸编码完全HIV蛋白序列的片段，其代表着HIV蛋白质的一个或多个分离(discrete)表位时的情况。这种片段可以含优化密码子，以使该片段就具有与高度表达的哺乳动物基因相似的密码子使用模式。
根据本发明的优选构建体包括1.p17、p24，与截短的NEF融合(缺乏编码末端氨基酸1-65的核苷酸)2.p17、p24、RT截短的NEF(缺乏编码末端氨基酸1-65的核苷酸)3.p17、p24(优化的gag)截短的NEF(缺乏编码末端氨基酸1-65的核苷酸)4.p17、p24(优化的gag)RT(优化的)截短的NEF(缺乏编码末端氨基酸1-85的核苷酸)5.p17、p24、RT(优化的)截短的NEF(缺乏编码末端氨基酸1-65的核苷酸)6.截短的NEF-(缺乏核苷酸1-65)与优化的p17、p24 gag融合。
7.本发明特别优选的构建体包括三重融合RT-NEF-Gag，尤其是RT-Gag-Nef；8.优化的RT、截短的NEF和优化的p17、p24(gag)(RNG)和9.优化的RT、优化的p17、24(gag)、Nef截短物(缺乏氨基酸1-65)RGN优选地，HIV构建体衍生自HIV分化体(Clade)B或分化体C，尤其是分化体B。
如上所述，本发明包括含有本发明核苷酸序列的表达载体。这种表达载体可用分子生物学领域的常规技术进行构建，并可能例如涉及利用质粒DNA和适当的起始子、启动子、增强子、和其它元件例如多聚腺苷酸化信号，它可能是必需的并位于正确的位置和方向，以能够使蛋白质表达。其它适合的载体是本领域熟练的技术人员已知的。关于这一点的其它的实施例我们参考Sambrook等，分子克隆实验室手册(Molecular Cloninga Laboratory Manual)，第二版，CSHLaboratory Press.(1989)。
优选地，本发明多核苷酸，或在本发明中用于载体的多核苷酸，与能够在宿主细胞中表达编码序列的控制序列可操作地连接，即该载体是一种表达载体。术语“可操作地连接”是指所描述的成分毗邻并以允许它们以其预定的方式发挥功能的关系存在。调控序列如启动子与编码序列“可操作地连接”，意指以这样的方式连接，即在与调控序列相容的条件下使编码序列的成功表达。
载体可以是，例如，有复制起点的质粒、人工染色体(例如BAC、PAC、YAC)、病毒或噬菌体载体，任选地含有用于多核苷酸表达的启动子和任选地含有该启动子的调节子。该载体可包括一种或多种可选择的标记基因，例如在细菌质粒中可包含氨苄青霉素或卡那霉素抗性基因，或用于真菌载体的抗性基因。载体可在体外使用，例如用于DNA或RNA的生产或用于转染或转化宿主细胞，例如哺乳动物宿主细胞，如用于生产由载体编码的蛋白质。该载体也可适应于体内使用，例如用于DNA疫苗接种或基因治疗中。
选择的启动子和其它表达调节信号与用于表达的宿主细胞相兼容。例如，哺乳动物启动子包括可诱导对重金属例如镉的反应的金属硫蛋白启动子，以及β-肌动蛋白启动子。病毒启动子例如SV40大T抗原启动子，人细胞肥大病毒(CMV)立即早期(IE)启动子、劳氏肉瘤病毒LTR启动子、腺病毒启动子或HPV启动子，特别是还可使用HPV上游调节区(URR)。所有这些启动子在本领域中已被详细描述，并可容易地获得。
一种优选的启动子元件是CMV立即早期启动子，它缺乏内含子A但包括外显子1。启动子元件可以是最小的启动子元件或增强的启动子，增强的启动子是优选的。因此，这里提供包含了在HCMV IE早期启动子控制下的含本发明多核苷酸的载体。
适合的病毒载体例如包括单纯疱疹病毒载体、牛痘或α-病毒载体和逆转录病毒，包括慢病毒、腺病毒和腺伴随病毒。利用这些病毒的基因转移技术是本领域技术人员所熟知的。例如逆转录病毒载体可用于将本发明多核苷酸稳定地整合到宿主基因组，尽管这种重组不是优选的。相反，复制-缺陷型腺病毒载体保持游离状态，并因此允许瞬时表达。可使用能在昆虫细胞(例如杆状病毒载体)、人细胞、酵母或细菌中表达的载体，以产生大量的由本发明多核苷酸编码的HIV蛋白，例如可用做亚单位疫苗或用于免疫测定。
根据本发明多核苷酸可用于表达生产编码的蛋白质，其表达可在体外、体内进行或来自体内。因此，核苷酸可涉及重组蛋白质合成，例如增加产量，或实际上可凭其自身的特性用做治疗剂，用于DNA疫苗接种技术。本发明的多核苷酸用于体外或来自体内、细胞中生产编码的蛋白质，例如在细胞培养物中进行，则这些细胞被修饰以包含被表达的多核苷酸。这种细胞包括瞬时的、或优选稳定的哺乳动物细胞系。关于插入编码本发明多肽的载体而修饰的细胞例如包括哺乳动物HEK293T、CHO、HeLa、293和COS细胞。优选地，所选择的细胞系不仅仅是稳定的，而且能对多肽进行成熟糖基化和在细胞表面表达。表达可通过转化卵母细胞来达到。可在转基因非-人动物，优选地是小鼠细胞中表达本发明多核苷酸以获得多肽。将本发明多核苷酸表达成多肽的转基因非-人动物包含于本发明的范围中。
本发明进一步提供接种哺乳动物受检者的方法，包括给予有效量的这种疫苗或疫苗组合物。最优选地，用于DNA疫苗、疫苗组合物和免疫疗法的表达载体为质粒载体。
DNA疫苗可以“裸DNA”的形式给药，例如配制成液体用注射器或高压喷射器进行给药，或将DNA与脂质体或刺激性转染增强子一起配制，或通过颗粒介导DNA释放(PMDD)给药。所有这些释放系统为本领域所熟知的。例如通过病毒载体释放系统可将载体导入哺乳动物。
本发明的组合物可通过许多途径来给药释放，例如通过肌肉内、皮下、腹膜内、静脉内或粘膜。
在一个优选的实施方案中，组合物通过皮内给药释放。具体地，组合物通过基因枪给予，尤其是粒子轰击进行给药，它包括在粒子(例如金颗粒)上包被载体，然后该粒子在高压下进入表皮；例如，其方法如Haynes等，J Biotechnology 4437-42(1996)中所描述。
在一个说明性的实施例中，气体-推动颗粒加速可利用例如由Powderject Pharmaceuticals PLC(Oxford，UK)和Powderject VaccinesInc.(Madison，WI)生产的设备来达到，其中某些例子描述于美国专利5,846,796、6,010,478、5,865,796、5,584,807和欧洲专利0500799中。这种方法提供了无针给药方法，其中显微颗粒的干粉制剂，例如多核苷酸，在由手动仪器产生的氦气喷射器中被加速到高速，将颗粒推进感兴趣的靶组织，典型的是皮肤。
优选的颗粒是0.4-4.0μm的金颗粒，更优选地直径为0.6-2.0μm，并且DNA合成物包被在这些颗粒上，然后装入药筒或弹夹而放入“基因枪”中。
在一个相关的实施方案中，可用于本发明组合物的气体-推动无针注射的其它设备和方法包括由Bioject，Inc.(Portland，OR)提供的设备，其中的具体例子描述于美国专利4,790,824、5,064,413、5,312,335、5,383,851、5,399,163、5,520,639和5,993,412中。
含有编码抗原肽的核苷酸序列的载体将以预防或治疗有效量进行给药。对于颗粒介导释药，给予的量通常为每剂核苷酸为1微微克(picogram)到1毫克，优选地为1微微克到10微克，而对于其它途径，剂量为100纳克到1毫克，优选地为10微克到1毫克。精确剂量很大程度上取决于被免疫的受检者的体重和给药途径。
对于含有编码抗原肽的核苷酸序列的免疫原成分可以一次给予或重复多次给予，例如1-7次，优选地1-4次，间隔为1天到18个月。然而这种治疗方式将很大程度上根据有关受检者的大小(size)、给予核苷酸序列的数量、给予的途径以及其它为熟练兽医或医师所熟知的因素而进行调整。受检者可接受一种或多种其它抗HIV逆转录病毒药物作为它们整个治疗方式中的一部分。此外，核酸免疫原可与佐剂一起给予。
类似地，本文列举的佐剂成分可通过各种不同的途径给予，例如通过口、鼻、肺、肌内、皮下、皮内或体表给予。优选地，佐剂成分通过皮内或体表途径给予。最优选通过体表给予。佐剂的给予可在核苷酸序列给予前约14天到给予后约14天之间进行，优选地在核苷酸序列给予前约1天到给予后约3天之间。在一个实施方案中，佐剂成分与核苷酸序列的给予基本上同时进行。“基本上同时”是指佐剂成分优选地在核苷酸序列给予的同一时间给予，否则，至少在核苷酸序列给予的前后几个小时内进行给予。在最优选的治疗方案中，佐剂成分与核苷酸序列的给予基本上同时进行。显而易见，根据上述变量的类型，该方案可随需要而改变。优选地佐剂是1H-咪唑并[4，5c]喹啉-4-胺衍生物例如咪喹莫特。典型地，咪喹莫特为体表的膏状制剂，并根据上述方案进行给予。
同样，衍生物给予的剂量也依据这些变量进行调整，但是可在例如，从约0.1mg/kg到约100mg/kg之间，这里“每千克(/kg)”指相关哺乳动物的体重。1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺衍生物的给予优选地随每次核苷酸序列给予后或加强给予而重复。最优选地，给予剂量为约1mg/kg到50mg/kg。在如本文所描述的“初次-加强”方案的情况下，咪喹莫特或其它1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺衍生物可随初次免疫、或加强免疫给予、或在初次和加强免疫中都进行给予。
虽然，佐剂成分可能含有以原始化学状态给予唯一的1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺衍生物，以药物制剂的形式给予是优选的。即佐剂成分优选地含有与一种或多种药用载体结合的1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺衍生物，以及任选的其它治疗成分。载体必须是“可接受的”，是指与制剂中其它成分相兼容，并对其接受者无害。制剂特性将根据给予途径自然地进行调整，并可通过制药领域熟知的方法来制备。所有方法都包括将1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺衍生物与适当的载体结合的步骤。通常，通过均匀和紧密地将衍生物与液体载体或良好分离的固体载体或二者结合制备制剂，然后如果需要，将产品制成预期的剂型。适合于口服的本发明制剂可制成分离的单位，例如制成每一个均含有预定量活性成分的胶囊、扁囊剂或片剂；粉剂或颗粒；溶液或存在于水成液或非水成液中的悬浮液；或为水包油性液体乳液或油包水性乳状液。活性成分还可制成大丸剂(bolus)、药糖剂或软膏。
可任选地与一种或多种助剂压缩或塑形(moulding)制备成片剂。压缩的片剂可通过在一个合适的机器中以自由流动形式如粉剂或颗粒的活性成分压缩制备而成，任选地与粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、润滑剂、表面活性剂或分散剂混合。塑形片剂可通过在适当的机器中将惰性液体稀释剂润湿的粉状化合物的混合物塑模制成。
片剂可任选地包被或刻划，并可配制成活性成分缓慢或控制释放的片剂。
用于通过例如肌内、腹膜内或皮下途径注射的制剂包括水性和非水性无菌注射溶液，可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和与预定的接受者的血液等渗的溶质；而水性和非水性无菌悬浮液可包括悬浮剂和增稠剂。该制剂可制成单剂量或多剂量的容器中，例如密封的安瓿和管瓶，并可保存于仅需要添加无菌液体载体的冻干条件下，例如在使用前立即添加注射用水。可从前面描述的无菌粉剂、颗粒和片剂类型制备临时的注射液和悬浮液。适合于通过口或鼻进行肺部给予的制剂被制成理想地具有0.5到7微米直径的含有活性成分的颗粒，被释放到接受者的树状支气管。这种制剂可以精细研磨的粉剂形式存在，可方便地制成可穿透(piercable)的胶囊，合适地如明胶，以用于吸入设备，或者可选地，作为一种含有活性成分、一种适当的液体推进剂和任选地其它成分如表面活性剂和/或一种固体稀释剂的自我推进制剂。也可采用活性成分以溶液或悬浮液液滴的形式配制成自我推进制剂。这种自我推进制剂类似于本领域已知的那些制剂，并可通过成熟方法来制备。手工操作或者用具有所需喷雾特征的自动功能阀来制备，优选地，该阀是具有能测量传递固定体积的类型，例如每次操作的固定体积为50-100μL。
另一种可能性，佐剂成分可以液体的形式用于喷雾器或雾化器，其中利用加速气流或超声搅拌产生用于吸入的微滴薄雾。
适合于经鼻给予的制剂通常包括与上述用于肺部给予的制剂相似的制剂，对于这种制剂优选地具有约10-200微米的颗粒直径，使之能够保持于鼻腔内。相应地，可通过使用颗粒大小适当的粉剂或选择适当的阀来获得。其它适当的制剂包括具有颗粒直径为约20-500微米的粗粉，用于从与鼻靠近的容器中迅速吸入鼻内而经鼻通道给予，以及在水溶液或油性溶液中含有约0.2-5％w/w的活性成分的鼻滴剂。在本发明的一个实施方案中，含有编码抗原肽的核苷酸序列的载体可以与1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺衍生物采用相同的制剂中给予。因此，在这个实施方案中，免疫原性成分和佐剂成分并存于相同的制剂中。
在一个实施方案中，佐剂成分以适合于基因枪给予的形式制备，并经该途径与核苷酸序列基本上同时施用。为了配制适合于以这种方式使用的制剂，对于1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺衍生物可能需要冻干并附着在例如适合于基因枪给予的金小珠上。
在另一可选实施方案中，佐剂成分可作为干粉经高压气体推进器给予。
即使没有配制在一起，对于佐剂成分可能在核苷酸序列给予位点或者其基本上相同的给予位点进行给予是合适的。
药物制备的其它细节可在Remington’s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Company，Easton，Pennysylvania(1985)中找到，其公开的全部内容被本文引入作为参考。
用于将裸多核苷酸或载体引入患者的合适技术也包括以适当的方式进行局部给予。核酸可经皮肤局部给予，或粘膜表面，例如经鼻内、口腔、阴道内或直肠内给予。裸多核苷酸或载体可与药用的赋形剂例如磷酸缓冲盐(PBS)一起存在。通过使用易化剂例如丁呱卡而进一步促进DNA的摄取，该易化剂或者单独使用或者包含于DNA制剂中。其它将核酸直接给予接受者的方法包括超声、电刺激、电穿孔和显微接种，在美国5,697,901中对此有描述。
可通过一些已知的转染技术增强对核酸构建体的吸收，例如包括使用转染试剂的技术。这些试剂的例子包括阳离子试剂，例如，磷酸钙和DEAE-葡聚糖和脂转染试剂(lipofectant)，例如lipofectam和transfectam。给予核酸的剂量可以进行调整。
本发明的核酸序列还可通过基因疗法中使用的特异性释放载体给予。基因治疗方法例如由Verme等在Nature 1997，389239-242中描述。病毒和非病毒载体系统均可使用。基于病毒的系统包括基于逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒、Canarypox和痘苗-病毒系统。基于非病毒的系统包括核酸的直接给予、微球包囊技术(聚(丙交酯-共-乙交酯)和基于脂质体的系统。病毒和非病毒释放系统可结合使用，其中在初始接种后进行强化注射是理想的，例如使用非病毒载体例如质粒进行最初的“初次”DNA接种，随后使用病毒载体或基于非病毒的系统进行一次或多次“加强”接种。同样地，本发明设计了具有本发明多核苷酸的初次免疫导入系统，随后用存在于佐剂中的蛋白质进行加强免疫，反之亦然。
本发明的核酸序列还可通过转化细胞给予。这种细胞包括从被试者收集的细胞。在体外将本发明的裸多核苷酸或载体导入这种细胞，随后将该转化的细胞返回到被试者体内。本发明的多核苷酸可通过同源重组整合进入细胞中已存在的核酸中。如果需要，转化细胞可在体外生长，并且获得的一个或多个细胞可用于本发明。可通过已知的外科或显微外科技术(例如移植、显微注射等)在患者适当的部位给予这种细胞。
本发明的药物组合物可包括如上所述的佐剂化合物，或其它可用于提高由DNA编码的蛋白质诱导的免疫反应的物质。这些物质可由DNA编码，或者单独存在或与抗原进行了融合，或者作为非DNA元件包含在制剂中。可包含于本发明制剂中的佐剂型物质的例子包括泛素、溶酶体伴随膜蛋白(LAMP)、乙肝病毒核心抗原、FLT3-配体(一种在消化性抗原呈递细胞发生中重要的细胞因子，具体是树枝状细胞)以及其它细胞因子例如IFN-γ和GMCSF。其它优选的佐剂包括咪喹莫特、Resimquimod和Tucarasol。咪喹莫特是特别优选的。
在本发明一个优选的实施方案中，提供了如本文所描述的核酸分子在治疗或预防HIV感染中的用途。核酸分子优选地与咪喹莫特配合给予。咪喹莫特优选局部给予，而核酸分子优选通过颗粒介导释放的方式给予。
因此，本发明提供了治疗患有HIV或易于遭受HIV感染的被检者的方法，包括给予本发明描述的核酸分子和咪喹莫特。
现在本发明将参考如下实施例作进一步的描述实施例实施例1优化p55 gag(p17、p24、p13)以与高度表达的人类基因的密码子利用率相似感兴趣的基因用于哺乳动物细胞中表达的编码HIV-1分化体B菌株HXB2的p55gag抗原的优化合成基因(GenBank记录号K03455)，利用PCR扩增的重叠寡核苷酸进行装配。
优化涉及改变病毒基因的密码子使用模式以获得与在高度表达的人类基因中发现的密码子频率接近的密码子频率。利用被称做Syngene的统计学Visual Basic程序确定密码子(由R.S.Hale和G.Thompson编写的Calcgene的最新版本，蛋白质表达和纯化，12卷，185-188页，1998)。
克隆1528bp的gag PCR产物通过凝胶纯化，用限制性核酸内切酶NotI和BamHI酶切，并连接到NotI/BamHI酶切的载体WRG7077中。即将基因置于CMV启动子/内含子A和牛生长素多腺苷酸化信号之间。
对克隆进行测序并检查存在的错误。没有一个克隆是100％正确的。因此，通过重叠PCR将两个克隆中正确序列的区域结合，其重叠PCR利用优化的寡组合的适当组合以得到密码子优化的全长gag基因。随后发现最终克隆中含有一个核苷酸缺失，这导致移码和翻译提前终止。通过切除含有不正确序列的基因区域，并将另一个克隆中含有正确序列的相应区域克隆进来，而修复了上述缺失。这样得到密码子被优化p55 gag的最终克隆Gagoptrpr2。(见图2)。
实施例2制备p17/p24截短的Nef融合基因感兴趣的基因通过PCR从质粒pHXB？Pr(B.Maschera，E Furfine和E.D.Blair1995J.Virol 69 5431-5436)扩增衍生自HIV-1分化体B菌株HXB2的p55gag基因的p17和p24部分。从该质粒中扩增来自HXB2 nef基因的3’末端的pHXB？Pr.426bp。由于HXB2 nef基因含有提前的终止密码子，因此用两个重叠PCR修复密码子(TGA[终止]到TGG[Trp])。
p17/p24接头和trNEF接头的PCR产物通过一个PCR反应而接合形成p17p24trNEF融合基因(图3)(反义)。
1542bp的产物通过凝胶纯化，用限制性核酸内切酶NotI和BamHI酶切，并克隆进载体WRG7077的NotI BamHI位点。即将基因置于CMV启动子/内含子A和牛生长素多腺苷酸化信号之间。
实施例3制备Gag p17/24opt/trNef1(’Gagopt/Nef’)融合基因感兴趣的基因以质粒pGagOPTrpr2为模板进行PCR扩增，获得密码子优化的衍生自HIV-1分化体B菌株HXB2的p55gag基因的p17和p24部分。通过PCR从质粒7077trNef20扩增具有修复的提前终止密码子(TGA[终止]到TGG[Trp])的截短的HXB2 Nef基因。这两个PCR产物被设计成具有重叠的末端，因而这两个基因在第二轮PCR中发生接合。
1544bp的产物通过凝胶纯化，用限制性核酸内切酶NotI和BamHI酶切，并克隆(见图)进载体WRG7077的NotI BamHI位点。即将基因置于CMV启动子/内含子和牛生长素多腺苷酸化信号之间。
实施例4质粒p7077-RT3克隆#A感兴趣的基因编码HIV-1分化体B菌株HXB2的pol基因的RT部分，被优化用于在哺乳动物细胞中表达的合成基因是通过PCR扩增的重叠寡核苷酸进行装配。克隆的序列与HXB2参考序列(GeneBank记录号K03455)的位置2550-4222相应。为了确保表达，在克隆序列的5’末端具有两个附加的不存在于原来基因中的密码子-AUG GGC(MetGly)。
优化涉及改变病毒基因的密码子使用模式，以得到与在高度表达的人类基因中发现的密码子频率相接近的密码子频率，但不包括很少使用的密码子。使用被称做Syngene的统计学Visual Basic程序确定密码子(由R.S.Hale和G.Thompson编写的Calcgene的最新版本，蛋白质表达和纯化，12卷，185-188页，1998)。
通过两个中间克隆，即#16和#21而构建成最终克隆。
克隆1.7kb的PCR产物通过凝胶纯化，用NotI和BamHI酶切并PCR净化，然后与NotI/BamHI酶切的pWRG7077连接。这将基因置于CMV启动子和牛生长素多腺苷酸化信号之间。对克隆进行测序。没有任何克隆是100％正确的，但通过用来自克隆#21的正确的KpnI-BamHI片段取代克隆#16中含有3个错误的403bp的KpnI-BamHI片段，这样克隆#16被修复。通过测序证实最终克隆。(见图5)实施例5优化的RT感兴趣的基因编码HIV-1分化体B菌株HXB2的pol基因的RT部分，被优化用于在哺乳动物细胞中表达的的合成基因是从质粒p7077-RT3切割获得，即1697bp的NotI/BamHI片段，通过凝胶纯化，并克隆进入p7313-ie(衍生自pspC31)的NotI和BamHI位点，而将基因置于Iowa长HCWV启动子+外显子1的下游，和兔球蛋白多腺苷酸化信号的上游。(R7004 p27)(图6)实施例6质粒7077trNef20感兴趣的基因插入片段含有来自HIV-1分化体B菌株HXB2的Nef基因部分。从基因的5’末端去除195bp，即除去Nef的最初65个氨基酸的密码子。另外，如前面描述的质粒p17/24trNEF1的构建中，将已公开的HXB2 nef序列中的提前终止密码子进行了修复(TAG到TGG[Trp])。截短的nef序列是从质粒p17/24trNef1扩增获得。克隆序列与HXB2参考序列(GenBank记录号K03455)的位置8992-9417相应。为了确保表达，在克隆序列5’末端具有附加的在原来基因中不存在的密码子-AUG(Met)。
引物StrNef(有义) ATAAGAATGCGGCCGCCATGGTGGGTTTTCCAGTCACACCTT[SEQ ID No1]AStrNef(反义)CGCGGATCCTCAGCAGTTCTTGAAGTACTCC[SEQ ID NO2]PCR94℃2分钟，然后按如下参数进行25个循环94℃30秒，50℃30秒，72℃2分钟，最后72℃5分钟。
克隆455bp的RT PCR产物通过凝胶纯化，用限制性核酸内切酶NotI和BamHI酶切，并连接到NotI/BamHI酶切的载体WRG7077上。即将基因置于CMV启动子/内含子A和牛生长素多腺苷酸化信号之间。
实施例7质粒7077RT 8感兴趣的基因pol基因的RT部分衍生自HIV-1分化体B菌株HXB2。通过PCR从质粒p7077Pol14扩增获得。
克隆序列与HXB2参考序列(GeneBank记录号K03455)的位置2550-4234相应。为了确保表达，克隆序列在5’末端具有两个附加的不存在于原来基因中的密码子-AUG GGC(Met Gly)。
引物
SRT(有义) ATAAGAATGCGGCCGCCATGGGCCCCATTAGCCCTATTGAGACT[SEQ ID NO3]ASRT(反义)CGCGGATCCTTAATCTAAAAATAGTACTTTCCTGATT[SEQ ID NO4]PCR94℃2分钟，然后按如下参数进行25个循环94℃30秒，50℃30秒，72℃4分钟，最后72℃5分钟。
克隆1720bp的RT PCR产物通过凝胶纯化，用限制性核酸内切酶NotI和BamHI酶切，并连接到NotI/BamHI酶切的载体WRG7077上。即将基因置于CMV启动子/内含子A和牛生长素多腺苷酸化信号之间。
实施例8p17/24opt/RT/trNef13(’Gagopt/RT/Nef’)该构建体含有引起由R到H氨基酸改变的PCR产物。
感兴趣的基因衍生自HIV-1分化体B菌株HXB2的优化p55gag基因的密码子的p17/p24部分从质粒pGagOPTrpr2经PCR扩增获得。RT编码序列从质粒7077RT 8经PCR扩增获得。具有修复的提前终止密码子(TGA[终止]到TGG[Trp])的截短的HXB2 Nef基因经PCR从质粒7077trNef20扩增得到。三个PCR产物被设计为具有重叠末端，因此这三个基因在第二轮PCR中发生连接。
引物(P17/24)Sp17p24opt(有义)ATAAGAATGCGGCCGCCATGGGTGCCCGAGCTTCGGT[SEQ ID NO5]ASp17p24optRT接头(反义)TGGGGCCCATCAACACTCTGGCTTTGTGTC[SEQ ID NO6]PCR94℃1分钟，然后按如下参数进行20个循环94℃30秒，50℃30秒，72℃2分钟，最后72℃4分钟。
1114bp的p17/24opt产物通过凝胶纯化。
(RT)
Sp17p24optRT接头(有义)CAGAGTGTTGATGGGCCCCATTAGCCCTAT[SEQ ID NO7]ASRTtrNef接头(反义)AACCCACCATATCTAAAA TAGTACTTTCC[SEQ ID NO8]PCR如上文1711bp的RT PCR产物通过凝胶纯化。
(5’截短的nef)SRTtrNef接头(有义)CTATTTTTAGATATGGTGGGTTTTCCAGTCAC[SEQ ID NO9]AStrNef(反义)CGCGGATCCTCAGCAGTTCTTGAAGTACTCC[SEQ ID NO10]PCR如上文448bp的产物通过凝胶纯化。
然后Sp17/24opt和AstrNef为引物进行第二轮PCR将上述三个PCR产物接合在一起。
PCR94℃1分钟，然后按如下参数进行30个循环94℃30秒，50℃30秒，72℃4分钟，最后72℃4分钟。
3253bp的产物通过凝胶纯化，用限制性核酸内切酶NotI和BamHI酶切，并克隆到载体WRG7077的NotI BamHI位点。即将基因置于CMV启动子/内含子A和牛生长素多腺苷酸化信号之间。
实施例9质粒pGRN#16(p17/p24opt corr/RT/trNef.)感兴趣的基因由于在p24中氨基酸270附近存在不利的密码子簇，由p17/24opt/RT/trNef13(’Gagopt/RT/Nef’)产生的多蛋白被表达为约30kDa的截短产物。这些密码子被PCR接合诱变产生的优选密码子所取代。以p17/24opt/RT/trNef13作模板，Sp17/p24opt和GTR-A为引物扩增Gag 5′端的部分以产生突变体，和以GTR-S和Asp17/p24optRT接头为引物扩增Gag 3′端的部分以产生突变体。利用Sp17/p24opt和Asp17/p24optRT接头引物将包含了改变的密码子的重叠产物和凝胶纯化的产物连接在一起。所得到的产物用NotI和AgeI酶切，并插入用相同酶切割的p17/24opt/RT/trNef 13中，获得pGRN。对克隆#16进行验证并用于进一步的研究。
引物5＇PCR:
Sp17p24opt(有义)ATAAGAATGCGGCCGCCATGGGTGCCCGAGCTTCGGT[SEQ ID NO11]GTR-A(反义)GCGCACGATCTTGTTCAGGCCCAGGATGATCCACCGTTTATAGATTTCTCC[SEQID NO12]3′PCR有义GTR-S(有义)ATCCTGGGCCTGAACAAGATCGTGCGCATGTACTCTCCGACATCCATCC[SEQ IDNO13]ASp17p24optRT接头(反义)TGGGGCCCATCAACACTCTGGCTTTGTGTC[SEQ ID NO14]用于各个产物和连接，使用PWO DNA聚合酶(Roche)的PCR条件是95℃1分钟，然后按下述参数进行20个循环95℃30秒，55℃30秒，72℃180秒，最后72℃120秒，在4℃保持。
1114bp的产物通过凝胶纯化，并用NotI和AgeI酶切产生6647bp的片段，经凝胶纯化后连接到NotI/AgeI酶切的、凝胶纯化的p17/24opt/RT/trNef13中，获得pGRN#16。
实施例10质粒p73i-GRN2克隆#19
(p17/p24(opt)/RT(opt)trNef)-修复的感兴趣的基因来自于HIV-1分化体B菌株HXB2的密码子被优化的gag的p17/p24部分、密码子优化的RT和截短的Nef基因位于Iowa长HCMV启动子+外显子1的下游和兔β-球蛋白多腺苷酸化信号的上游之间。
包含衍生自质粒p17/24trNef1的trNef基因的质粒包含一个PCR错误，导致从nef末端的19个氨基酸的R到H的氨基酸改变。这通过PCR诱变得以校正，校正的nef PCR与p7077-RT3的密码子优化RT进行连接，并用ApaI和BamHI酶切连接的片段，并克隆到用ApaI/BamHI酶切的p73i-GRN中。
引物利用引物进行PCR以从p7077-RT3获得coRT(聚合酶＝全部为PWO(Roche))有义U1GAATTCGCGGCCGCGATGGGCCCCATCAGTCCCATCGAGACCGTGCCGGTGAAGCTGAAACCCGGGAT[SEQ ID NO15]AScoRT-NefGGTGTGACTGGAAAACCCACCATCAGCACCTTTCTAATCCCCGC[SEQ ID NO16]循环95℃(30秒)，然后如下参数进行25个循环95℃(30秒)，55℃(30秒)，72℃(180秒)，然后72℃(120秒)，最后保持在4℃。
1.7kp的PCR产物通过凝胶纯化。
利用下述引物进行PCR以从p17/24trNef1获得5’Nef有义S-NefATGGTGGGTTTTCCAGTCACACC[SEQ ID NO17]反义ASNef-GGATGAAATGCTAGGCGGCTGTCAAACCTC[SEQ ID NO18]循环95℃(30秒)，然后按如下参数进行15个循环95℃(30秒)，55℃(30秒)，72℃(60秒)，然后72℃(120秒)，最后保持在4℃。
利用如下引物进行PCR以从p17/24trNef1获得3’Nef有义SNEF-GGAGGTTTGACAGCCGCCTAGCATTTCATC[SEQ ID NO19]反义AStrNef(反义)CGCGGATCCTCAGCAGTTCTTGAAGTACTCC[SEQ ID NO20]循环95℃(30秒)，然后按如下参数进行15个循环95℃(30秒)，55℃(30秒)，72℃(60秒)，然后72℃(120秒)，最后保持在4℃。
PCR产物通过凝胶纯化。使用5’(S-Nef)和3’(AstrNef)引物将两个最初Nef产物连接。
循环95℃(30秒)，然后按如下参数15个循环95℃(30秒)，55℃(30秒)，72℃(60秒)，然后72℃(180秒)，最后保持在4℃。
PCR产物被PCR净化，并用U1和AstrNef引物将其与RT产物连接循环95℃(30秒)，然后按如下参数进行20个循环95℃(30秒)，55℃(30秒)，72℃(180秒)，然后72℃(180秒)，最后保持在4℃。
2.1kb的产物通过凝胶纯化，并用ApaI和BamHI酶切。质粒p73I-GRN也用ApaI和BamHI酶切、凝胶纯化并与ApaI-Bam RT3trNef连接产生p17/p24(opt)/RT(opt)trNef基因。
实施例11p73i-GN2克隆#2(p17/p24opt/trNef)-修复的感兴趣的基因来自于HIV-1分化体B菌株HXB2的密码子优化的gag的p17/p24部分、截短的Nef基因位于Iowa长HCMV启动子+外显子1的下游和兔β-球蛋白多腺苷酸化信号的上游之间。
包含衍生自质粒p17/24trNef1的trNef基因的质粒含有一个PCR错误，导致从nef末端的19个氨基酸R到H的氨基酸改变。这通过PCR诱变得以校正，校正的片段用BglII和BamHI酶切，并克隆进BglII/BamHI酶切的p73I-GN中。(图12)重建了Iowa长HCMV启动子+外显子1的下游以及兔β-球蛋白多腺苷酸化信号的上游之间经校正的p17/p24opt/trNef所产生的融合基因。
利用下述引物以从p17/24trNef1获得5’Nef聚合酶＝全部为PWO(Roche)有义S-NefATGGTGGGTTTTCCAGTCACACC[SEQ ID NO21]反义ASNef-GGATGAAATGCTAGGCGGCTGTCAAACCTC[SEQ ID NO22]循环95℃(30秒)，然后按如下述参数进行15个循环95℃(30秒)，55℃(30秒)，72℃(60秒)，然后72℃(120秒)，最后保持在4℃。
利用下述引物以从p17/24trNef1获得3’Nef有义SNEF-GGAGGTTTGACAGCCGCCTAGCATTTCATC[SEQ ID NO23]反义AStrNefCGCGGATCCTCAGCAGTTCTTGAAGTACTCC [SEQ ID NO24]循环95℃(30秒)，然后按如下参数进行15个循环95℃(30秒)，55℃(30秒)，72℃(60秒)，然后72℃(120秒)，最后保持在4℃。
PCR产物通过凝胶纯化，并用5’(S-Nef)和3’(AstrNef)引物进行连接。
循环95℃(30秒)，然后按如下参数进行15个循环95℃(30秒)，55℃(30秒)，72℃(60秒)，然后72℃(180秒)，最后保持在4℃。
PCR产物经PCR净化，用BglII/BamHI酶切，得到的367bp片段经凝胶纯化后，克隆到BglII/BamHI酶切、凝胶纯化的p73i-GN中。
实施例12质粒p73I-RT w229k(失活的RT)感兴趣的基因获得Iowa长HCMV启动子+外显子1的下游和兔β-球蛋白多腺苷酸化信号的上游之间的失活RT基因。
考虑到在治疗性疫苗中使用活性HIV RT的种类，需要将该基因失活。这可通过PCR诱变而将RT(衍生自P73I-GRN2)第229位氨基酸从Trp改变为Lys(R7271 p1-28)来达到。
引物PCR 5’RT+突变用引物(聚合酶＝全部为PWO(Roche))有义RT3-u1GAATTCGCGGCCGCGATGGGCCCCATCAGTCCCATCGAGACCGTGCCGGTGAAGCTGAAACCCGGGAT[SEQ ID NO25]反义AScoRT-Trp229LysGGAGCTCGTAGCCCATCTTCAGGAATGGCGGCTCCTTCT[SEQ ID NO26]循环1×[94℃(30秒)]15×[94℃(30秒)/55℃(30秒)/72℃(60秒)]1×[72℃(180秒)]PCR凝胶纯化
PCR 3’RT+突变用引物反义RT3-11GAATTCGGATCCTTACAGCACCTTTCTAATCCCCGCACTCACCAGCTTGTCGACCTGCTCGTTGCCGC[SEQ ID NO27]有义ScoRT-Trp229LysCCTGAAGATGGGCTACGAGCTCCATG[SEQ ID NO28]循环1×[94℃(30秒)]15×[94℃(30秒)/55℃(30秒)/72℃(60秒)]1×[72℃(180秒)]PCR凝胶纯化PCR产物经凝胶纯化，用5’(RT3-U1)和3’(RT3-L1)引物将RT的5’和3’末端连接。
循环1×[94℃(30秒)]15×[94℃(30秒)/55℃(30秒)/72℃(120秒)]1×[72℃(180秒)]PCR产物经凝胶纯化，并利用NotI和BamHI限制性位点克隆进入p7313ie，产生p73I-RT w229k。(见图13)实施例13质粒p73i-Tgrn(#3)感兴趣的基因来自HIV-1分化体B菌株HXB2的密码子被优化的gag的p17/p24部分、密码子优化RT和截短的Nef基因位于Iowa长HCMV启动子+外显子1的下游和兔β-球蛋白多腺苷酸化信号的上游之间。
含有活性形式RT的三重融合的构建体对于用于人类的调节目的可能不被接受，因此通过将p73i-RT w229k的NheI和ApaI酶切片段插入到NheI/ApaI酶切的p73i-GRN2#19中而获得失活的RT(图14)。这导致在RT的位置229上发生W改变为K。
实施例14p73I-Tnrg(#16)感兴趣的基因来自HIV-1分化体B菌株HXB2的截短的Nef、密码子优化的失活RT和密码子优化的gag基因的p17/p24部分位于Iowa长度HCMV启动子+外显子1的下游以及兔β-球蛋白多腺苷酸化信号的上游之间。
由p73i-Tgrn编码的多蛋白中的基因顺序通过PCR和PCR结合重排以产生p73I-Tnrg(图15)。在基因的PCR结合以形成单一的多蛋白之前，每个基因都经PCR扩增并经凝胶纯化。该产物经凝胶纯化、用NotI/BamHI消化后连接到NotI/BamHI酶切的p7313ie中。
引物trNef PCRS-Nef(NotI)CATTAGAGCGGCCGCGATGGTGGGTTTTCCAC[SEQ ID NO29]AS-Nef-coRT接头GATGGGACTGATGGGGCCCATGCAGTTCTTGAACTACTCCGG[SEQ ID NO30]RTw229k PCRS-coRTATGGGCCCCATCAGTCCCATCGAG[SEQ ID NO31]AS-coRT-p17p24接头CAGTACCGAAGCTCGGGCACCCATCAGCACCTTTCTAATCCCCGC[SEQ ID NO32]
p17p24opt PCRS-p17p24optATGGGTGCCCGAGCTTCGGTACTG[SEQ ID NO33]AS-p17p24opt(BamHI)GATGGGGGATCCTCACAACACTCTGGCTTTGTGTCC[SEQ ID NO34]用VENT DNA聚合酶(NEB)的对于各个产物和连接的PCR条件如下1×[94℃(30秒)]25×[94℃(30秒)/55℃(30秒)/72℃(120秒[p17p24或RT]或60秒[trNef])]1×[72℃(240秒)]PCR产物经凝胶纯化，并用引物S-trNef(NotI)和AS-p17p24opt(BamHI)进行PCR结合。
1×[94℃(30秒)]25×[94℃(30秒)/55℃(30秒)/72℃(210秒)]1×[72℃(240秒)]3000bp的产物经凝胶纯化，并用NotI和BamHI酶切后经PCR净化，连接到NotI/BamHI消化的、凝胶纯化的p7313ie中以产生p73i-Tnrg。
实施例151.质粒P73i-Tngr(#3)感兴趣的基因来自HIV-1分化体B菌株HXB2的截短的Nef、密码子优化的gag的p17/p24部分、密码子优化的失活RT基因位于Iowa长HCMV启动子+外显子1的下游的兔β-球蛋白多腺苷酸化信号的上游之间获得的。
p73i-Tgrn编码的多蛋白中的基因顺序通过PCR重排以产生p73I-Tngr(图16)。密码子优化的p17/p24和RT产生单一产物，并经PCR接合到扩增的trNef上。该产物经凝胶纯化、NotI/BamHI消化并连接到NotI/BamHI酶切的p7313ie中。
引物P17/p24-RT 3’PCRSp17p24opt(有义)ATGGGTGCCCGAGCTTCGGTACTG[SEQ ID NO35]RT3 11(反义)GAATTCGGATCCTTACAGCACCTTTCTAATCCCCGCACTCACCAGCTTGTCGACCTGCTCGTTGCCGC[SEQ ID NO36]TrNef 5′PCRS-Nef(NotI)CATTAGAGCGGCCGCGATGGTGGGTTTTCCAC[SEQ ID NO37]AS-Nef-p17p24CAGTACCGAAGCTCGGGCACCCATGCAGTTCTTGAACTACTCCGG[SEQ ID NO38]用VENT DNA聚合酶(NEB)的对于各个产物和连接的PCR条件如下1×[94℃(30秒)]25×[94℃(30秒)/55℃(30秒)/72℃(180秒[p17p24+RT]或60秒[trNef]或210秒[连接])]1×[72℃(240秒)]3000bp的产物经凝胶纯化，并用NotI和BamHI酶切，经PCR净化后，连接到NotI/BamHI消化的、凝胶纯化的p7313ie中以产生p73i-Tngr。
实施例16质粒p73I-Trgn(#6)
感兴趣的基因来自HIV-1分化体B菌株HXB2密码子优化的失活RT、密码子优化的gagp17/p24部分和截短的Nef基因位于Iowa长HCMV启动子+外显子1的下游和兔β-球蛋白多腺苷酸化信号的上游之间。
构建体内基因的顺序通过PCR分别扩增来自质粒p73I-GN2和p73I-RTw229k的p17p24-trNef和RTw229k达到。进行PCT连接反应，其产物经凝胶纯化并用NotI/BamHI酶切，然后与NotI/BamHI消化的p7313ie进行连接。序列测定揭示p17p24没有被完全优化，故用AgeI/MunI从编码区切去700bp的片段，被而用来自含有正确编码序列的p73i-Tgrn#3的MunI/Age片段进行取代。(见图17)引物p17p24-trNefPCRS-p17p24optATGGGTGCCCGAGCTTCGGTACTG[SEQ ID NO39]AstrNef(BamHI)RTw229kRT3-U1GAATTCGCGGCCGCGATGGGCCCCATCAGTCCCATCGAGACCGTGCCGGTGAAGCTGAAACCCGGGAT[SEQ ID NO40]AS-coRT-p17p24opt接头CAGTACCGAAGCTCGGGCACCCATCAGCACCTTTCTAATCCCCGC[SEQ ID NO41]用VENT DNA聚合酶(NEB)的对于各个产物和连接的PCR条件如下1×[94℃(30秒)]25×[94℃(30秒)/55℃(30秒)/72℃(120秒(PCR)或180秒(连接)]
1×[72℃(240秒)]PCR接合产生的3000bp产物经凝胶纯化，并用NotI和BamHI酶切，经PCR净化后，连接到NotI/BamHI消化的、凝胶纯化的p7313ie中以产生p73i-Tngr。序列分析显示从p73I-GN2获得的p17p24序列密码子没有完全被优化，这被携带到新的质粒中。从MunI和AgeI酶切的p73i-Tngr中切掉700bp的片段，用来自p73i-Tgrn的700bp的MunI/AgeI消化产物进行连接而取代它，产生构建体p73I-Tngr#6。
实施例17质粒p73i-Trng(#11)感兴趣的基因Iowa长度HCMV启动子+外显子1下游，以及兔β-球蛋白多腺苷酸化信号上游的、从HIV-1分化体B菌株HXB2获得的密码子优化的失活RT、截短的Nef和密码子优化的gag基因的p17/p24部分。
构建体内基因的顺序通过PCR扩增来自p73i-Tgrn的RT-trNef和p17p24基因而获得。进行两个DNA片段的PCT连接反应，其3kb的产物经凝胶纯化，并用NotI/BamHI酶切，然后与NotI/BamHI消化的p7313ie进行连接，产生p73I Trng(#11)引物RTw229k-trNefRT3-u1GAATTCGCGGCCGCGATGGGCCCCATCAGTCCCATCGAGACCGTGCCGGTGAAGCTGAAACCCGGGAT[SEQ ID NO42]AS-Nef-p17p24opt接头CAGTACCGAAGCTCGGGCACCCATGCAGTTCTTGAACTACTCCGG[SEQ ID NO43]p17p24S-p17p24opt
ATGGGTGCCCGAGCTTCGGTACTG[SEQ ID NO44]AS-p17p24opt(BamHI)GATGGGGGATCCTCACAACACTCTGGCTTTGTGTCC[SEQ ID NO45]用VENT DNA聚合酶(NEB)的对于各个产物和连接的PCR条件如下1×[94℃(30秒)]25×[94℃(30秒)/55℃(30秒)/72℃(120秒(基因的PCR)或180秒(连接)]1×[72℃(240秒)]PCR接合产生的3000bp产物经凝胶纯化，用NotI和BamHI酶切，经PCR净化后，连接到NotI/BamHI消化的、凝胶纯化的p7313ie中，以产生p73i-Tngr。
实施例18p73i-Tgnr(#f1)感兴趣的基因Iowa长度HCMV启动子+外显子1下游以及兔β-球蛋白多腺苷酸化信号上游的、从HIV-1分化体B菌株HXB2获得的密码子优化的gag的p17/p24部分、截短的Nef和密码子优化的失活RT基因。
构建体内基因的顺序通过PCR分别扩增来自质粒p73I-GN2和p73I-RTw229k的p17p24-trNef和RTw229k来获得。其对PCR产物进行PCT连接反应，经凝胶纯化，并用NotI/BamHI酶切后，与NotI/BamHI消化的p7313ie进行连接。在序列(p17p24和RT)中发现两个序列错误，随后这种错误通过利用多蛋白中的限制性位点用正确的基因部分进行取代而得到修复。(见图19)引物p17p24-trNefPCRS-p17p24opt
ATGGGTGCCCGAGCTTCGGTACTG[SEQ ID NO46]AS-Nef-coRT接头GATGGGACTGATGGGGCCCATGCAGTTCTTGAACTACTCCGG[SEQ ID NO47]RTw229kS-coRTATGGGCCCCATCAGTCCCATCGAG[SEQ ID NO48]RT3-11GAATTCGGATCCTTACAGCACCTTTCTAATCCCCGCACTCACCAGCTTGTCGACCTGCTCGTTGCCGC[SEQ ID NO49]用VENT DNA聚合酶(NEB)的对于各个产物和连接的PCR条件如下1×[94℃(30秒)]25×[94℃(30秒)/55℃(30秒)/72℃(120秒(PCR)或180秒(连接)]1×[72℃(240秒)]3000bp的产物经凝胶纯化，用NotI和BamHI酶切，经PCR净化后，连接到NotI/BamHI消化的、凝胶纯化的p7313ie中，以产生p73i-Tngr。序列测定揭示p17p24的密码子不是完全优化的，进而用AgeI/MunI将编码区中的一个700bp的片段切掉，并用来自含有正确编码序列的p73i-Tgrn#3的MunI/Age片段取代。该多蛋白还含有一个点突变(G2609A)，导致多蛋白的RT部分中产生Thr改变成Ala的氨基酸取代。该突变通过ApaI/BamHI消化构建体并经PCR净化而除去突变的序列，并用来自p73i-Tgnr的RT的ApaI/BamHI消化部分连接而取代该序列而得到校正。
实施例19制备用于“基因枪”DNA药筒(cartridges)的质粒包被“金浆液”
质粒DNA(大约1μg/μl)，例如100μg，和2μm的金颗粒，例如50mg(PowderJect)，悬浮于例如100μl的0.05M的亚精胺中(Sigma)。通过加入例如100μl 1M的CaCl2(American PharmaceuticalPartners，Inc.，USA)使DNA沉淀到金颗粒上。该DNA/金颗粒复合物在室温下保持10分钟，用无水乙醇洗涤3次，例如3×1ml，(事先在分子筛3A(BDH)上干燥)。样品重悬浮于含有0.05mg/ml的聚乙烯吡咯烷酮(PVP，Sigma)的无水乙醇中，并将其分成三等份于1.5ml的显微离心管中(Eppendorf)。该等分试样分别用于(a)“金浆液”的分析，(b)洗出液-从(a)洗提出的质粒的分析和(c)制备用于“基因枪”的包被乙烯-四氟乙烯共聚物(Tefzel)药筒的金颗粒/质粒(见下文的实施例3)。为了制备样品(a)和(b)，含有质粒DNA/乙醇中的“金浆液”/PVP的离心管在Eppendorf 5418显微离心机中高速旋转2分钟，除去上清液，“金浆液”在室温下干燥10分钟。样品(a)在TE pH8.0中重悬浮到质粒DNA为0.5-1.0μg/μl，假定大约50％被包被。对于洗出液，样品(b)在TE pH8.0中重悬浮到质粒DNA为0.5-1.0μg/μl，并在37℃温育30分钟，激烈摇动，然后在Eppendorf 5418显微离心机中高速旋转2分钟，其上清液、洗出液被除去后，储藏在-20℃。洗提的精确DNA浓度用GenequantII(Pharmacia Biotech)通过分光光度法定量测定。
实施例20用于DNA免疫的药筒的制备如以前所描述的制备用于Accell基因转移装置的药筒(Eisenbraun等，DNA和细胞生物学(DNA and Cell Biology)，1993 vol 12 No 9，791-797页；Pertner等)。简而言之，质粒DNA被包被到2μm的金颗粒上(DeGussa Corp.，South Plainfield，N.J.，USA)并装载到Tefzel管中，该管随后被切成1.27cm长以用做药筒，并在4℃下干燥储存直至使用。在典型的疫苗接种中，各个药筒含有0.5mg被包被的金颗粒，总量为0.5μg DNA/药筒。
实施例21
利用基因枪进行DNA疫苗接种后对HIV抗原的免疫反应用位于两个载体中的核酸所编码的抗原接种小鼠(n＝3/组)。P7077利用包含内含子A和外显子I的HCMV IE启动子(fcmv启动子)。P73I产生相同的抗原，但包含的是缺乏内含子A而包括外显子1的HCMV IE启动子(icmv启动子)。
质粒被给予到F1(C3H×Balb/c)小鼠的腹部皮肤切开的靶位点。在第0天，对小鼠以2×0.5μg DNA进行最初免疫，在第35天用2×0.5μg DNA进行加强免疫，在第40天时用IFN-γ Elispot检测细胞反应。
·P73I -空载体·P7077 -空载体·P7077 GRN -(fCMV启动子)Gag，RT，Nef·P73I GRN -(iCMV启动子)Gag，RT，Nef·P73I GR3N-(CMV启动子)优化的Gag，优化的RT，Nef·P7077 GN -(fCMV启动子)Gag，Nef·P73I GN -(iCMV启动子)Gag，Nef细胞毒素T细胞反应细胞毒素T细胞反应通过对5天后收集的脾细胞用CD8+T细胞-限制性IFN-γELISPOT进行分析来评估。经颈部离位杀死小鼠，将脾收集到冰冷的PBS中。将梳理出脾细胞放入磷酸缓冲盐溶液中(PBS)，随后溶解红血细胞(在含有155mM NH4Cl、10mM KHCO3、0.1mM EDTA的缓冲液中1分钟)。用PBS洗涤两次除去颗粒物质后，单个细胞悬浮液按等分放入事先用俘获的IFN-γ抗体包被的ELISPOT平板中，并用CD8-限制性同源肽(Gag、Nef或RT)刺激。过夜培养后，加入抗-小鼠IFN-γ-生物素标记抗体(Pharmingen)继而加入链霉抗生物素-偶联的碱性磷酸酶即可观察到产生IFN-γ的细胞，用图象分析进行定量测定。
该实验结果显示于图20、21和22中。
实施例22疫苗构建体的免疫原性1.细胞实验细胞免疫反应包括细胞毒素CD8细胞和辅助CD4细胞。检测特异性CD8和CD4细胞的灵敏方法是ELIspot分析，它可用于定量测定能够分泌干扰素-γ或IL-2的细胞。ELIspot分析基于俘获的从各个细胞分泌的细胞因子。简而言之，特化的微量滴定板用抗-细胞因子抗体包被。从免疫动物分离的脾细胞与含有已知表位(CD8)或蛋白(CD4)的特异性肽一起培养过夜。如果细胞经刺激释放细胞因子，它们将在滴定板表面上各个产生细胞的位置周围与抗体结合。在细胞被溶解和洗涤平板后，细胞因子仍然保持与包被抗体结合。该分析利用生物素/抗生物素蛋白扩增系统、以与ELISA分析相似的方式进行。斑点的数量与细胞因子产生细胞的数量相等。
对6个构建体均记录了可对如下K2d-限制性小鼠表位Gag(AMQMLKETI)、Nef(MTYKAAVDL)和RT(YYDPSKDLI)发生反应的CD8细胞数量，以及可对Gag和RT蛋白发生反应的CD4细胞数量。这些实验的结果经统计学分析，且根据构建体的免疫原性进行分级。结果显示于图23中。
2.体液实验从两个实验中进行加强免疫后7和14天，收集血液样品用于抗体分析。分离血清并冰冻储存直到可以用特异性ELISA分析测定抗体的滴定度。检测了所有样品对Gag、Nef和RT的抗体。简而言之，ELISA平板用相关蛋白包被。洗去多余的蛋白质后，将稀释的血清样品加入到加样孔中进行培育。洗去血清样品，加入与适当的tag偶联的抗小鼠抗血清。培养平板并在平板读出器上读取数据。结果显示于图24中。
3.抗体数据在四个实验中测定了所有六个构建体的抗体滴定度。构建体p73i-GNR始终对Gag不产生抗体反应，对Nef产生有限的抗体反应。其原因不清楚，由于分离自同一小鼠的脾细胞中观察到T-细胞反应，表明Gag蛋白是体内表达的。
产生Gag特异性抗体的等级如下RNG＞GRN＞NRG＞RGN＞NGR＞GNR分析细胞免疫数据该目的是在3个免疫学实验中根据点记数资料对6个构建体进行分级。按下述三类反应进行评估在第7天(初次免疫始后7天)CD8对Gag、Nef和RT发生反应，第35天(加强免疫后7天)CD4对Gag和RT发生反应，第35天(加强免疫后7天)CD8对Gag、Nef和RT发生反应。
每个反应(例如CD8对Gag的反应)使用SAS第8版中的线性混合效果模型进行模拟。不管具体的抗原(Gag、Nef或RT)存在与否，也不管IL-2存在与否，该模型包括构建体的固定效果。另外，对于CD8的反应，其数据可从各个小鼠获得，受检者作为随机效果被包含于模型中。所述模型包括相互作用以考虑到构建体在抗原(存在/缺乏)和IL-2(存在/缺乏)之间的各个组合中的不同效果。
通过模型，在抗原(存在/缺乏)和IL-2(存在/缺乏)的各个组合中，分别评估了各个构建体和p7313(对照组)之间的校正平均反应的差异，及p值以显示差异是否具有统计显著性。基于抗原存在而IL-2缺乏时的差异和p值，对构建体进行分极，即具有最大差异的构建体的值为6，其次为5等，但是对于其差异在5％的水平上差异不显著的任何构建体均为0。
模型假定——残差随常数方差正态分布，使用图解方法和灵敏度分析进行评估，其中首先对反应取对数，接着取平方根而将反应转换模型值。构建体的等级对与模型假定的背离不敏感。
分别计算了各个实验中的各个反应的等级，对于所有3个实验中计算了3类反应的等级之和。下表显示了3个实验总的等级之和。
结合3个免疫学实验，3类反应中各个反应的构建体的等级之和。
在第35天时，对于两类反应而言RNG具有最高的等级。而第二高的等级是第7天的RGN。在第35天，对于两组反应而言RGN也都显示了比较高的等级。
权利要求
1.一种核苷酸序列，编码HIV-1 gag蛋白或其含有gag表位的片段，以及第二HIV抗原，或编码所述第二HIV抗原的表位的片段，并与异源启动子可操作地连接。
2.如权利要求1所述的核苷酸序列，其中所述第二抗原选自Nef或其含有nef表位的其片段，或反转录酶(RT)或其含有RT表位的片段。
3.如权利要求1或2所述的核苷酸序列，其中所述gag蛋白包含p17。
4.如权利要求3所述的核苷酸序列，其中所述gag蛋白还包含p24。
5.如权利要求1-4中任何一项所述的核苷酸序列，其中对所述gag序列进行密码子优化以与高度表达的人类基因中的密码子利用率相似。
6.如权利要求1-5中任何一项所述的核苷酸序列，其中所述序列编码HIV-1 gag蛋白或含有gag表位的片段、nef蛋白或含有nef表位的片段、以及RT蛋白或含有RT表位的片段，优选顺序为RT、Gag、Nef或RT、Nef、Gag。
7.如权利要求2-6中任何一项所述的核苷酸序列，其中对所述RT序列或其片段进行密码子优化以与高度表达的人类基因相似。
8.如权利要求1-7中任何一项所述的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码nef蛋白或其表位。
9.一种核苷酸序列，选自·Gag(p17，p24)，Nef截短物·Gag(p17，p24)(密码子优化的)，Nef(截短物)·Gag(p17，p24)，RT、Nef(截短物)·密码子优化的Gag(p17，p24)，RT，Nef(截短物)·密码子优化的Gag(p17，p24)，密码子优化的RT，Nef截短物·RT(密码子优化的)，密码子优化的Gag(p17，p24)，Nef截短物·RT(密码子优化的)，Nef截短物，gag p17，密码子优化的p24。
10.如权利要求1-9中任何一项所述的核苷酸序列，其中所述异源启动子是HCMV IE基因的启动子。
11.如权利要求10所述的核苷酸序列，其中所述启动子的5’端含有外显子1。
12.一种含有如权利要求1-11中任何一项所述的核苷酸序列的载体。
13.一种如权利要求12所述的载体，其中所述载体是双链DNA质粒。
14.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有如权利要求1-11中所述的核苷酸序列或权利要求12或13中所述的载体以及药用的赋形剂、稀释剂、载体或佐剂。
15.如权利要求14所述的药物组合物，其中所述药物组合物适合于肌肉内或皮内给药。
16.如权利要求14或15所述的药物组合物，其中所述载体是金小珠。
17.一种皮内给药装置，其中含有权利要求14、15或16所述的药物组合物。
18.一种治疗患病或易感疾病的患者的方法，包括给予安全和有效量的如权利要求14-16中任何一项所述的药物组合物。
19.如权利要求1-11中任何一项所述的核苷酸序列、如权利要求12或13所述的载体、或如权利要求14-16中任何一项所述的组合物在药物中的用途。
20.权利要求1-11中任何一项所述的核苷酸序列在生产治疗疾病的药物中的应用。
21.一种生产如权利要求1-11中任何一项所述的核苷酸的方法，包括将编码HIV-1 gag蛋白或其片段以及第二HIV蛋白或其片段的核苷酸序列与异源启动子序列可操作地连接。
全文摘要
本发明提供的核苷酸序列，编码了HIV－1 gag蛋白或其含有gag表位的片段以及第二HIV抗原，或编码所述第二HIV抗原表位的片段，并与异源启动子可操作地连接。优选的核苷酸序列进一步编码nef或其片段和RT或其片段。
文档编号A61K39/39GK1606624SQ02823087
公开日2005年4月13日 申请日期2002年9月18日 优先权日2001年9月20日
发明者A·贝顿, P·F·埃尔特尔, G·W·古, A·利尔, J·P·蒂特, C·A·范维利 申请人:葛兰素集团有限公司