专利名称：疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新的预防和治疗动脉粥样硬化疾病的疫苗。相应地，本发明提供的免疫原包括载脂蛋白或其片断或其类似物，其中天然形式的整个载脂蛋白至少具有下列一种活性(a)抑制载脂蛋白B和其受体结合，和，或，(b)抑制脂蛋白脂肪酶。在一个优选的例子中载脂蛋白为载脂蛋白C-III(ApoCIII)。包括所述免疫原的本发明所述的疫苗能长时间有效预防或减少动脉粥样硬化斑块形成，从而减少了能导致冠状或脑血管疾病的潜在的粥样硬化。因此本发明提供了一种新的治疗动脉粥样硬化的方法，该方法通过选择性地抑制人宿主内特异的载脂蛋白的活性来完成，本发明优选的方案中载脂蛋白是ApoCIII，所述方法包括给人服用能选择性抑制载脂蛋白活性的试剂。本发明还提供了治疗或预防动脉粥样硬化症的方法，通过主动或被动的接种疫苗导致病人具有能够结合载脂蛋白的抗体，载脂蛋白至少含有下述一种活性(a)抑制载脂蛋白B与其受体结合，和，或，(b)抑制脂蛋白脂肪酶；本发明的抗体在这方面优选与ApoCIII结合和抑制ApoCIII的活性。本发明还提供了免疫原和本发明所述的医学疫苗的应用及其它们的生产方法。
动脉粥样硬化症是在发达国家中导致死亡和残疾的原因，并还是世界范围内每年大约7.2到4.6百万的冠状和脑血管死亡的重要原因(动脉粥样硬化症的一般介绍见Harrison’s Principles of Internal Medicine(14thEdition，McGrawHill，p1345-1352)，Berliner，J.et a1.，1995，Circulation，912488-2496；Ross，R.，1993；Nature，362801)。希腊的命名是指损伤处动脉内膜增厚(硬化症)和油脂(athere)的集聚。
虽然许多普遍或全身性的危险因子预先导致了它们的发展，如含高胆固醇的食物和吸烟，该疾病可以通过循环影响截然不同的地方。例如，冠状动脉的粥样硬化症通常导致心绞痛和心肌梗塞的形成。同时，动脉的粥样硬化症导致中枢神经系统频繁的激发脑的暂时生局部缺血。在外周循环中，粥样硬化症可以导致间歇性跛行和坏疽并危及肢体发育能力。累及内脏循环可能导致肠系膜的局部缺血和肠梗塞。粥样硬化症可以直接影响肾(如导致肾动脉狭窄)，而且，肾是产生粥样硬化疾病的一个频发部位。
人的动脉粥样硬化形成需要许多年，通常是几十年。导致动脉粥样化的斑块在血管内层缓曼的阻塞可能导致慢性的临床表现为血液流动受限制(如稳定的诱导了心绞痛或可预言的和可复发的间歇性跛行)。另外还可能出现许多难以预料的急性临床事件，如斑块破裂后出现心肌梗塞或脑血管意外事件。粥样硬化症影响动脉节段的途径也会发生改变，使该疾病增加了异种性和复杂性。动脉粥样化通常是指血管狭窄病变或产生了限制血液流动的斑块，然而动脉硬化症也能导致伴随内腔流量增加的动脉瘤疾病的扩张和发生。动脉硬化症的这种表现频繁的存在于大动脉中，造成能发生破裂或切割向非狭窄或闭塞的易患病体质。
人们对导致动脉粥样硬化的斑块的起源已经做了深入的研究。在普通成年人中，动脉内膜层的细胞外基质中含有平滑肌细胞并被单层的血管内皮细胞所覆盖。在动脉粥样形成的最初阶段“脂肪条纹”在血管壁上发展导致了脂蛋白在动脉的内层区域的积聚和堆积。富含胆固醇的低密度脂蛋白(LDL)粒子是一种导致动脉粥样硬化的脂蛋白，其能够在血管壁积聚形成脂肪条纹。
一旦沉积在血管壁上，脂蛋白粒子将被化学修饰，包括氧化和非酶糖化。这些氧化和糖化脂蛋白粒子将引起身体上许多进一步损害的发生。这些化学修饰吸引在血管壁上的巨噬细胞，使之内化氧化的低密度脂蛋白并变成泡沫细胞从而开始启动称为斑块的身体损害。这就是动脉粥样硬化的斑块，临床表现为动脉粥样硬化症，它们或者限制血液的流动，或者引起动脉瘤，甚至诱发冠状破裂或者造成脑血管问题。
动脉粥样硬化是一个长期的过程，可能是几十年形成，它的产生是由于导致动脉粥样化和给予保护的脂蛋白不平衡造成的。例如，在循环系统中与高密度脂蛋白或HDL相关联的胆固醇(称为好的胆固醇)和与低密度脂蛋白或LDL相关联的胆固醇(称为坏的胆固醇)水平被认为是动脉粥样硬化概率增加的标志。(Harrison′s Principles of Internal Medicine(14thEdition，McGraw Hill，p1345-1352))。
体内流体中的胆固醇、胆固醇酯、三酰基甘油和其他的油脂是由一系列脂蛋白进行传输的，按照增加的密度将这些脂蛋白进行分类乳糜微粒、极低、低密度、中密度和高密度脂蛋白(分别是CM、VLDL、LDL、IDL和HDL)。脂蛋白复合物由一个疏水油脂核心和包围它的极性油脂以及载脂蛋白外壳组成。已知有十种载脂蛋白，A-1、A-II，B，CI，CII，CIII，D，E，H和J。这些载脂蛋白至少具有两种对于所有脂蛋白复合物都具有的相同功能，首先是它们能使它们携带的疏水脂质核心溶化，其次它们也涉及通过特殊的细胞吸收对胆固醇脂蛋白进行调节。不同种类的脂蛋白具有不同的功能，例如普遍认为在胆固醇酯中丰富的LDL与用于新细胞膜合成的胆固醇向外围组织的传输有关。
载脂蛋白之一的载脂蛋白C-III(ApoCIII)是肝脏和肠内产生的79个氨基酸的蛋白(Brewer et al.，J.Biol.Chem.(1974)，2494975-4984；Protter，A.A.，et al.，1984，DNA，3449-456；Fruchart，J.C.et al，1996，Drugs Affecting LipidMetabolism，(Eds..Gotto，A.M.et al.)，Kluwer Academic Publishers and FordazioneGiovanni Lorenzini，Netherlands，p631-638；Claveny，V.et al.，Arteriosclerosis，Thrombosis and Vascular Biology，15，7，963-971；US patent No.4,801,531；McConathy，W.J.et al.1992，Journal of Lipid Research，33，9951003)。Apo CIII是CM、VLDV和LDL的组成部分(Lenich et al.，C.，J.Lip.Res.(1988)29，755-764)，以三种同工型存在apo CIII0，apo CIII1 and apo CIII2。Apo CIII没有糖基化，但apo CIII1和apo CIII2糖基化了并分别有一和二个唾液酸残余物(Ito et al.，1989 J.lipd.Res.Nov 3011 1781-1787)。糖部分由与蛋白链中74位苏氨酸通过O-糖苷键连接的二糖β-D半乳糖基(1-3)α-N-乙酰基-D-半乳糖胺组成(Assman et al.，1989，BBA 541234-240)。人类正常的油脂血浆中，apoCIIIO，apo CIII1和apo CIII2分别是总apo CIII的14％，59％和27％。人类apoCIII的糖基化位置的突变并不影响它的分泌和油脂的连接(Roghani et al.，1988JBC 3417925-32)。
人类ApoCIII有下列氨基酸序列SEAEDASLLSFMQGYMKHATKTAKDALSSVQESQVAQQARGWVTDGFSSLKDYWSTVKDKFSEFWDLDPEVRPTSAVAA(SEQ ID.NO.1)apo CIII的血浆浓度与血浆的甘油三酸脂正相关。(Schonfeld et al.，Metabolism(1979)281001-1010；Kaslyap et al.，J.Lip.Res.(1981)22800-810)。肝脏灌注研究表明apo CIII抑制富甘油三脂脂蛋白(TRL)和它们残余物的吸收(Shelburne et al.，J.Clin.Inves.，(1980)65652-658，Windler et al.，J.Lip.Res.
(1985)26556-563)。而且体外试验表明apo CIII能抑制脂蛋白脂酶(LPL)和肝脂酶的活性(Brown and Bakinsky，Biochim.Biophs.Acta.(1972)46375-382；Krauss et al.，Circ.Res.(1973)33403-411；Wang et al.，J.Clin.Inves.(1985)75384-390；Mc Conathy et al.，J.Lip.Res.(1972)33995-1003；Kinnemen andEnholm，FEBS(1976)65354-357)。而且据报道apo CIII通过ApoB参与抑制LDL与LDL受体的结合(Fruchart et al.supra)。
最近转基因动物方面的研究结果进一步表明了apo CIII在血浆TRL新陈代谢中的作用(Aalto-Setala et al.，J.Clin.Invest.(1992)905 1889-1900.)。过量表达apo CIII的小鼠血浆中TRL的累积被证明与血浆中减少的VLDL和乳糜微滴的清除相关(Harrold et al.，J.Lip.Res.(1996)37754-760)，而且也有报道C载脂蛋白对于含apo-B脂蛋白的LDL受体的抑制作用(Clavey et al.，Arth.Thromb.and Vase.Biol.(1995)15963-971)。
早期动脉粥样硬化症免疫疗法领域的疫苗集中在将胆固醇作为免疫原来减少血清胆固醇的水平上(Bailey，J.M.et al.，1994，Biochemical SocietyTransactions，22，433S；Alving，C.and Swartz，G.M.，1991，Crit.Rev.Immunol.，10，441-453；Alving，C.and Wassef，N.M.，1999，Immunology Today，20，8，362-366)。其他的方法试图通过接种疫苗(WO 99/15655)改变胆固醇酯转移蛋白(CETP)的活性。为了抑制血胆固醇过多的兔子球状损伤后斑块的形成，某些作者描述了使用氧化的LDL作为免疫原(Nilsson，J.et al.，1997，JACC，30，7，1886-1891)。
令人惊讶的发现，采用主动或被动免疫疗法，或是通过减少或阻断某些促进载脂蛋白的动脉硬化症的功能，均可以抑制或改善动脉硬化症。
本发明提供动脉硬化症的预防或治疗的有效的免疫原，而且还提供通过将本发明的免疫原给以需要的人体来治疗动脉硬化症的方法。
本发明的免疫原包括从遭受或倾向动脉硬化症患者中存在的促进动脉粥样硬化斑块形成的载脂蛋白中选出的载脂蛋白。这些选择出的构成本发明优选载脂蛋白基础的那些载脂蛋白至少具有以下两个特性之一天然载脂蛋白能够(a)抑制载脂蛋白B结合到它的受体上，和/或(b)抑制脂蛋白脂肪酶。
本发明作为免疫原的载脂蛋白可以具有上述特性之一，但是最优选具有上述两种特性。具有两种特性的最优选的免疫原包括载脂蛋白CIII(ApoCIII)。
任何给定的载脂蛋白在抑制含有apo B的脂蛋白结合到它的受体上或脂蛋白脂酶的酶活性可以采用已知的技术进行测定。这些方法的例子如Fruchart etal，supra；McConathy et al.，supra；Shelburne et.al.supra和Windler et.al.supra.等进行了描述。
本发明的免疫原可以含有完整长度的天然载脂蛋白或者包含保持治疗或预防动脉硬化症的功能特性的片断、肽或mimotopes等。
例如，免疫原可以是完整长度，或包含比天然载脂蛋白完整长度短的天然载脂蛋白的片断。优选完整长度蛋白的片断小于80个氨基酸的长度，更优选小于50个氨基酸，更优选小于40个氨基酸，最优选长度在4到25个氨基酸长度。
作为本发明免疫原的载脂蛋白片断具有完整长度的载脂蛋白的功能，能够诱导生成抗载脂蛋白的抗体(当适合存在于免疫系统时)。而且，被片断诱导产生的抗体具有治疗动脉硬化症的功能，本发明优选的形式中，它们失去了被载脂蛋白施加的抑制Apo B与它的受体结合的作用，和/或脂蛋白脂肪酶的活性。
本发明中可以形成免疫原的肽能够从载脂蛋白表面抗原分离。本发明的发明人发现能用于本发明中的肽也是高度表面暴露的抗原决定基。根据上述观察，发明人设计一种方法，该方法能提供合适的表面抗原决定基，这些抗原决定基经过计算在5个残基的滑动窗口具有高的可到达的区域。
发明人发现载脂蛋白的优选区域有可到达的表面，采用分子模拟软件(MSI)计算出5个残余物的一个滑动窗口该表面大于502，优选比802更大。
含有这些表面抗原决定基氨基酸序列的肽形成了本发明的一部分。具有与这些肽相同特性的mimtopes和含有这种mimotopes的免疫原与载脂蛋白发生交叉免疫反应，也就形成了部分的本发明。
本发明的免疫原因此可以包含这些环绕载脂蛋白抗原决定基的分离的肽和mimotope。Mimotope定义为一个实体，它极为类似载脂蛋白抗原决定基，能够被识别载脂蛋白的抗体识别(Gheysen，H.M.，et al.，1986，合成作为抗原的肽；Wiley，Chichester，Ciba foundation symposium119，130-149；Gheysen，H.M.，1986，分子免疫，23，7，709-715)；或能够产生抗体，当与合适的载体结合时，该抗体与天然载脂蛋白发生交叉反应。
上述识别载脂蛋白的肽mimotopes能够通过添加、缺失或取代所选的氨基酸为特殊目的设计。因此为了易与蛋白载体共扼，可以对本发明的肽进行修饰。例如可以采用一些化学联结方法，包括末端半胱氨酸结合到载脂蛋白抗原决定基上。另外也可以将肽与蛋白载体共轭，从而在肽联结终端的末梢包括一个疏水端，这样自由的未共轭的肽的末端与载体蛋白表面保持关联，这样减少了肽的自由构象度，同时增加了肽存在于最近似于在完整载脂蛋白中发现的载脂蛋白肽构象的可能性。例如，肽可以改变为含有N端半胱氨酸和C端的疏水酰胺化的尾部。可以选择地，增加或取代一个或更多氨基酸的D立体异构形式可以创造出有益的衍生物，例如提高肽的稳定性。本领域技术人员可以理解这些修饰的肽或mimotopes可以是完整或部分的非肽mimotope，其中组成残基不一定局限于20种天然的氨基酸。另外可以通过本领域已知技术对肽进行环化处理，使之更接近于完整载脂蛋白中该肽序列的形状。
肽mimotopes也可以是天然载脂蛋白肽序列的逆序列，在这种序列中方向相反；或序列可以是完整的或至少是部分含有D立体异构体氨基酸(反序列)。而且，这些肽序列可以在性质上是逆反，在这样的序列中，方向是相反的，氨基酸是D立体异构形式。这样的逆或逆反肽有非自体的优点，从而克服在免疫系统中自身耐受的问题。
作为一种选择，肽mimotope可以通过能与载脂蛋白结合的抗体识别，所用技术如噬菌体显示技术(EP0 552 267 B1)。这种技术产生大量的模拟天然肽结构的肽序列，因此能够结合抗天然肽抗体，但是本身不必具有与天然载脂蛋白的显著的同源性。
本发明的最优选免疫原由AcoCIII或其片断、肽或minotope等组成。
ApoCIII免疫原可以是完整长度的天然蛋白人类ApoCIII 1-79，SEAEDASLLSFMQGYMKHATKTAKDALSSVQESQVAQQARGWVTDGFSSLKDYWSTVKDKFSEFWDLDPEVRPTSAVAA(SEQ ID NO.1).
作为一种选择，免疫原可以由完整的ApoCIII的片断组成，78个氨基酸长或更短，优选50个氨基酸长或更短，更优选40氨基酸或更短，最优选4到25个氨基酸长度范围内。特别优选肽的片断包含在成熟ApoCIII中氨基酸1-17、1-40、12-35、41-79、45-65、或45-76定义的区域内。这些优选的肽的肽序列是人类ApoCIII 1-17，SEAEDASLLSFMQGYMK(SEQ ID NO.2)人类ApoCIII 1-40，SEAEDASLLSFMQGYMKHATKTAKDALSSVQESQVAQQAR(SEQ ID NO.3)人类ApoCIII 12-35，MQGYMKHATKTAKDALSSVQESQV (SEQ ID NO.4)人类ApoCIII 41-79，GWVTDGFSSLKDYWSTVKDKFSEFWDLDPEVRPTSAVAA(SEQ ID NO.5)人类ApoCIII 45-65，DGFSSLKDYWSTVKDKFSEFW(SEQ ID NO.6)人类ApoCIII 45-76，DGFSSLKDYWSTVKDKFSEFWDLDPEVRPTSA(SEQ ID NO.7)ApoCIII免疫等价片断可以作为比ApoCIII自身更小的多肽，能够产生识别天然ApoCIII的免疫反应并具有治疗和预防动脉硬化症的功能。
可以用于本发明的免疫原的其他载脂蛋白是载脂蛋白CII或载脂蛋白E。
在本发明的一种特别优选的具体方案中，将载脂蛋白或片断与载体分子联结增强载脂蛋白或其片断的免疫性能。因此，肽或mimotope可以通过化学共价连接或遗传工程融合配体表达的方式结合，可选择使用接头序列。肽可以有两个或更多的甘氨酸残基作为接头序列，通常有一个末端暴露的半胱氨酸残基用于连接目的。例如，优选的一些肽列举如下MQGYMKHATKTAKDALSSVQESQVGGC(SEQ ID NO.8)CGGMQGYMKHATKTAKDALSSVQESQV(SEQ ID NO.9)DGFSSLKDYWSTVKDKFSEFWGGC(SEQ ID NO.10)CGGDGFSSLKDYWSTVKDKFSEFW(SEQ ID NO.11)可以采用本领域已知技术将载脂蛋白例如ApoCIII共价耦合到载体蛋白上。例如，可以采用含碳二亚胺、戊二醛或(N-[γ-马来酰亚胺丁基氧])琥珀酰亚胺酯、采用通常商业上可获得的例如CDAP和SPDP异源双功能接头(按照制造厂商的说明)进行直接共价耦合。在耦合反应后，通过透析方法、凝胶过滤方法、分级分离方法等能够容易的分离和提纯这种免疫原。
本领域的技术人员可以很容易知道本发明中的免疫原使用的载体的类型。载体的功能是为增强对载脂蛋白或载脂蛋白肽的免疫反应提供细胞因子辅助。本发明能够被使用的载体并非详尽的列表包括匙孔血蓝蛋白(KLH)、血清蛋白例如牛血清蛋白(BSA)、灭活的细菌毒素例如破伤风或白喉毒素(TT和DT)、或重组片断(例如TT的片断C的结构域1、或DT的移位结构域)、或结核菌素的提纯蛋白衍生物(PPD)。或者载脂蛋白或mimotopes或抗原决定基可以与载体以非共价方式连结，例如借助于脂质体载体或通过共吸附到铝盐上，这样可以添加提供T细胞辅助的免疫原或添加辅助免疫刺激剂。优选载脂蛋白、或片断或肽对载体的数目比率为1∶1到20∶1，并优选每个载体应该载有3到15个载脂蛋白或肽或片断。
在本发明的一个实施例中载体是流感嗜血菌的蛋白D(EP 0 594 610 B 1)。蛋白D是一种结合IgD的流感嗜血菌蛋白并由FORGREN申请了专利(WO91/18926，EP 0 594 610 B 1)。在某些情况下，例如在重组器官免疫原表达体系中使用蛋白D的片断是可取的，例如蛋白D1/3rd(含有蛋白DN-端100-110的氨基酸(WO 99/10375；WO 00/50077))。
另一种优选呈递载脂蛋白例如ApoCIII或本发明肽的方法是在重组融合分子中。例如，EP 0 421 635 B描述了使用嵌合的嗜肝DNA病毒核抗原粒子来呈递类病毒粒子中的外源肽序列。本发明的免疫原可以包括载脂蛋白或存在于包含乙肝核心(HepB核心)抗原的嵌合体粒子中的载脂蛋白肽。另外，重组融合蛋白可以含有本发明的mimotope和载体蛋白，例如流感病毒NS I。对于组成本发明部分的任何一种重组表达蛋白来说，编码所述免疫原的核酸也形成了本发明的一个方面。
因此，本发明优选免疫原包括存在于重组表达系统(例如HepB核)或与载体蛋白辍合的肽SEQ ID NO.1 or SEQ ID NO.2-7，从而重组表达系统或载体蛋白提供T细胞辅助以产生对SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2-7.的免疫反应。特别优选的免疫原只含有SEQ ID NO.4，或辍合或融合到载体蛋白以提供T细胞辅助能产生对SEQ ID NO.4的免疫反应。
本发明的另一个实例中，肽的免疫原性被T辅助细胞(TH)抗原决定基增强。因此，本发明的免疫原可以含有前述的肽和混杂的Th抗原决定基，可以作为化学共价物或纯粹合成的肽结构。载脂蛋白肽优选借助于间隔物(例如甘氨酸-甘氨酸)在载脂蛋白的N-或C-端点结合到Th抗原决定基上。免疫原可以含有1或更多的混杂Th抗原决定基和更优选2到5Th抗原决定基。
Th抗原决定基是含有Th抗原决定基的氨基酸序列。Th抗原决定基由连续的或不连续的抗原决定基构成。因此，并不是每一个Th的氨基酸都是抗原决定基的必需的部分。在具有众多MHC型的动物和人群中混杂的Th抗原是高度和广泛反应性的(Rartidos et al.(1991)＂Immune Responses in Mice FollowingImmunization with Chimeric Synthetic Peptides Representing B and T Cell Epitopesof Measles Virus Proteins＂J.of Gen.Virol.721293-1299 US 5,759,551)。可以使用的Th的结构域可以包括约10到50个氨基酸，优选约10到30个氨基酸。当多重抗原决定基存在时，每一个Th抗原决定基是相同或不同的。
Th抗原决定基包括如病原体起源的抗原决定基诸如肝炎表面或核心(peptide 50-69，Ferrari et al.，J.Clin.Invest，1991，88，214-222)抗原Th抗原决定基、百日咳毒素Th抗原决定基、破伤风毒素Th抗原决定基(例如P2(EP 0 378881 B1)和P30(WO 96/34888，WO 95/31480，WO 95/26365)、麻疹病毒F蛋白Th抗原决定基、沙眼衣原体主要外膜蛋白Th抗原决定基(例如P11，Stagg etal.，免疫学，1993，79，1-9)、耶尔森氏菌侵袭素和白喉毒素Th抗原决定基。其他的Th抗原决定基描述在US 5,759,551 and Cease et al.，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.84，4249-4253；和Partidos et al.，J.Gen.Virol，1991，72，1293-1299；WO 95/26365和EP 0 752 886 B中。
本发明使用的肽能够按照众所周知的工艺固相步骤合成。可以通过利用T-moc或F-moc工艺步骤进行适当的合成。环化的肽能够采用众所周知的F-moc固相工艺步骤和聚酰胺树脂在完全自动化的装置中被合成出来。作为选择，本领域的技术人员熟知手工操作这些工艺所必需的实验室技术。对于固相合成技术和工艺，E.Atherton和R.C.Sheppard在＂固相肽合成实用合成方法＂(发表于IRL在牛津城大学推进(1989))中进行了描述。作为选择，肽可以采用重组方法进行生产，包括在细菌或哺乳动物细胞中表达编码mimotopes的核酸分子，然后纯化表达的mimotope。肽和蛋白质的重组表达技术是众所公知的，并在Maniatis，T.，Fritsch，E.F.and Sambrook et al.，Molecular cloning，a laboratory manual，2nd Ed.；Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpringHarbor，New York(1989)中进行了描述。
而且，本发明的组成部分包括编码本发明免疫原或肽、mimotope或其中衍生物或含有重组融合蛋白的免疫原的核酸部分。特别是提供了分离的编码SEQ ID.NO.1-7或含有SEQ ID.NO.1-7的免疫原的核酸分子。
本发明提供免疫原用于医药，用于动脉硬化症的治疗，用于制备成本发明的免疫原组合物或疫苗。
本发明的免疫原可以制备成免疫原组合物或疫苗，从而有效的预防或治疗动脉硬化症。包含本发明一种或多种免疫原的免疫原组合物或疫苗在前面已经有过描述。相应地这些疫苗中包括从那些促进动脉硬化斑块形成的载脂蛋白中选择出的载脂蛋白。优选含有载脂蛋白的免疫原疫苗，至少具有下面两种特性之一这种载脂蛋白具有抑制ApoB与受体结合的活性，和/或能够抑制脂蛋白脂肪酶的酶活性。
本发明最优选的疫苗或免疫原组合物含有ApoCIII或其片断或肽。最优选的疫苗含有ApoCIII或其片断，这些免疫原辍合或融合到载体蛋白上从而能提供T细胞辅助以发生抗这些ApoCIII或片断的免疫反应。
本发明的疫苗或免疫原组合物可以更进一步包含一种佐剂。用于本发明的合适的疫苗佐剂包括能够增强对于载脂蛋白免疫原抗体反应的那些佐剂。佐剂是众所周知(Vaccine Design-The Subunit and Adjuvant Approach，1995，Pharmaceutical Biotechnology，Volume 6，Eds.Powell，M.F.，and Newman，M.J.，Plenum Press，New York and London，ISBN 0-306-44867-X)。与本发明免疫原一起使用的优选佐剂包括铝或钙盐(例如氢氧化物或磷酸盐)。与本发明免疫原一起使用的优选佐剂包括铝或钙盐(氢氧化物或磷酸盐)、水包油乳剂(W095/17210，EP 0 399 843)，或特殊的载体例如脂质体(WO 96/33739)。特别优选从南美树Quillaja Saponaria Molina树皮获得的有辅助活性的免疫活性皂角苷提取物(例如Quil A)，它的生产方法在美国专利No.5,057,540已经公开。QS21(知名的QA21)中，例如QA17也被公开。3De-O-酰化单磷脂酰脂质A(3D-MPL)是Ribi Immunochem，Mpmtama制造的著名的佐剂。它可以采用GB 2122204B的方法制备。3D MPL的优选形式是有颗粒直径尺寸小于0.2μm的乳状液形式的3D-MPL(EP 0 689 454 B1).。
佐剂也包括但不局限于胞壁酰二肽和皂角苷例如Quil A，细菌脂多糖例如3D-MPL(3-O-deacylated monophosphoryl lipid A)，或TDM。作为更进一步的选择，这种蛋白质能够以脂质体这样的显微颗粒或非颗粒的聚氧乙烯醚的悬浮液的形式装入胶囊(WO 99/52549)。特别优选佐剂是3D-MPL和QS21(EP 0671 948 B1)的组合、含有3D-MPL和QS21(WO 95/17210，PCT/EP98/05714)的水包油乳剂、用其他载体(EP 0 689 454 B1)配制的MPL、或在含有胆固醇的脂质体中配制的QS21(WO 96/33739)、或免疫刺激寡核苷酸(WO 96/02555)。
本发明的疫苗一般按引发和加强剂量给予。加强剂量希望给以合适的间隔，或优选按照每年给一次药或当循环抗体的含量降低到所希望的水平以下时给药。加强剂量可以是没有原载体分子情况下的肽。这样的加强构建物可以含有一种可选择的载体或完全没有载体。
本发明的更进一步的方面是提供作为这里描述的用于医药的疫苗或免疫原组合物。
本发明的免疫原组合物或疫苗制剂可以通过全身或粘膜途径接种，用于保护或治疗对于动脉硬化症易感或患有动脉硬化症的哺乳动物。接种可以通过肌肉、腹膜、皮内或皮下注射；或口腔/食物、呼吸、泌尿生殖道的途径通过粘膜进行接种。
根据诱导免疫保护反应但不引起显著副作用的剂量选择每一种疫苗或免疫原组合物剂量中蛋白质的量。这个含量的变化取决于特定的免疫原和它是以什么方式存在。一般，每一剂含有1-1000ug蛋白质，优选1-500ug，优选1-100ug，最优选的范围是1到50ug。特定疫苗的最佳含量能够通过包括观察适合目标的免疫反应的标准研究来确定。初始的疫苗接种后，受体可以接受一个或几个适当间隔的加强免疫接种。
疫苗的制备在Voller等编辑的疫苗的新趋势和进展一书(University ParkPress，Baltimore，Maryland，U.S.A.1978)中进行了一般的描述。Likhite在美国专利4,372,945中，Armor等在美国专利4,474,757中公开了蛋白质与大分子的结合方法。
能够与构成本发明基础的免疫原同样的载脂蛋白结合的配体成为本发明一个重要的技术方案部分。通过给病人施用这样的配体可用于被动预防或治疗动脉硬化症疾病。
因此，本发明优选的配体是能够与载脂蛋白结合并能够限制其活性，这种载脂蛋白具有至少以下两种性质之一能够抑制载脂蛋白B结合到它的受体上，和/或能够抑制脂蛋白脂肪酶的酶活性。
本发明的配体优选能结合到具有上述活性之一的载脂蛋白上，但是最优选与具有两种活性的载脂蛋白结合。特别优选的是结合到载脂蛋白CIII(ApoCIII)的配体。
这样有用的配体的优选例子包括单克隆或多克隆抗体。例如在一个动物诱导产生的抗体可以被提纯并被动的施加给另一个动物用于预防或治疗动脉硬化症。通过现有技术可以将本发明的免疫原用于产生单克隆抗体杂交瘤(使用已知技术例如Kohler和Milstein，Nature，1975，256，p495)、人源化单克隆抗体或CDR嫁接单克隆。
这里的术语“抗体”是用于指具有有益抗原结合特异性的分子。本领域技术人员可以很容易理解这个术语可以覆盖具有相同或相似功能的多肽片断或抗体衍生物。这样的抗体片断或衍生物也倾向于包含在这里使用的术语抗体中。
本发明提供对本发明分离的免疫原产生的分离的抗体。本发明也提供能结合到ApoCIII上的多或单克隆抗体的制备物，特别优选的多或单克隆抗体能识别完整天然的ApoCIII如人类ApoCIII 1-17，D SEAEDASLLSFMQGYMK(SEQ ID NO.2)人类ApoCIII 1-40，SEAEDASLLSFMQGYMKHATKTAKDALSSVQESQVAQQAR(SEQ ID NO.3)人类ApoCIII 12-35，MQGYMKHATKTAKDALSSVQESQV(SEQ ID NO.4)人类ApoCIII 41-79，GWVTDGFSSLKDYWSTVKDKFSEFWDLDPEVRPTSAVAA(SEQ ID NO.5)人类ApoCIII 45-65，DGFSSLKDYWSTVKDKFSEFW(SEQ ID NO.6)人类ApoCIII 45-76，DGFSSLKDYWSTVKDKFSEFWDLDPEVRPTSA(SEQ ID NO.7).
同时，本发明也提供了能分泌本发明的单克隆抗体配体的杂交瘤。
含有上述配体的药物组合物也构成了本发明的一个方面。本发明也提供了配体在医药及在制备治疗动脉硬化症药剂中的应用。
这里提供的动脉硬化症的被动治疗中，本发明的配体或抗体在需要时静脉注射进入病人的身体。给药的次数通过临床病人血浆中抗体浓度随时间下降的程度来决定，但是在任何情况下，每年给药的次数在1到52次之间，最优选在每年1到12次之间。抗体或配体的量按照疾病的严重程度或血浆中抗体的半衰期变化，优选的范围为每公斤病人体重1到10mg，优选每公斤病人体重1到5mg，最优选每公斤病人体重1到2mg。
本发明的免疫原、免疫原组合物、疫苗或配体可以施药给遭受或具有动脉硬化症疾病的患者，并可以有效的重新建立坏的脂蛋白(含有脂蛋白的apo B)与好的脂蛋白(含有脂蛋白的apo A-1)之间正确的平衡，并减少含有脂蛋白的apo B的循环时间。不希望被理论限制，发明人确信这些机制减少了含有脂蛋白的apo B在血管壁上的沉积和氧化，因此减少了动脉硬化症斑块的形成和扩大的危险。
因此，本发明提供了本发明的载脂蛋白免疫原在制备预防或治疗动脉硬化症的药物组合物方面的应用，也提供了含有本发明载脂蛋白或肽的免疫原和载体分子用于制备免疫预防和治疗动脉硬化症的疫苗方面的应用。因此，本发明的载脂蛋白也被提供用于医药及动脉硬化症的医药治疗或预防。
本发明也提供了一种动脉硬化症的治疗或预防的方法，包括向患有动脉硬化症或易感的患者提供本发明的免疫原组合物或疫苗或配体。
本发明提供的动脉硬化症的预防或治疗方法包括通过给患者施用本发明的疫苗，从而减少患者体内总的循环的甘油三酸脂的水平。特别是提供了通过给患者输入本发明的疫苗或配体减少患者体内循环的VLDL和LDL的量的方法。
本发明还提供了给患者接种一种疫苗后能够通过减少含有ApoB的脂蛋白的平均循环时间来预防或治疗动脉硬化症的方法。含有脂蛋白的ApoB的平均循环时间可以通过测量一个活体动物模型中含有脂蛋白的标记ApoB在哺乳动物血浆内的清除速度进行研究(含有脂蛋白的标记ApoB的半衰期)。
本发明优选治疗方法中的免疫原含有ApoCIII。令人惊奇的是，通过疫苗或配体，ApoCIII的靶向降低了坏的胆固醇(LDL)的负作用，但对好的胆固醇(HDL)没有负的作用。
本发明提供了治疗或预防动脉硬化症的方法，该方法能选择性抑制人体内具有动脉粥样硬化的载脂蛋白的活性，包括给人体施用一种药剂，该药剂能导致抑制至少下列一种所述人体内动脉粥样硬化的载脂蛋白的活性(a)抑制载脂蛋白B结合到它的受体上，和/或(b)抑制脂蛋白脂肪酶的活性。本发明相关方面是提供一种治疗或预防动脉硬化的方法，它通过提供一种药剂，这种药剂能选择性抑制人体内的ApoCIII活性，选择性抑制需要治疗或预防的人体内的ApoCIII的活性。这种药剂可以是免疫原组合物或含有ApoCIII的疫苗或片断，作为免疫原或可选择的药剂可以是能够阻断ApoCIII活性的配体(它阻止ApoCIII介导的脂蛋白脂肪酶抑制和ApoB对受体的结合)。本发明优选的配体是多或单克隆抗体。
治疗血浆中循环ApoCIII水平升高的患有动脉硬化个体的优选方法包括通过接种含有ApoCIII或片断作为人体免疫原的疫苗来降低循环ApoCIII的水平。
作为选择，本发明的相关方面，也提供一种治疗或预防动脉硬化的方法，它减少患者体内血浆中循环ApoCIII的水平，它给患者一种配体，这种配体能够抑制ApoCIII的活性，阻止ApoCIII介导脂蛋白脂肪酶和结合ApoB到受体。本发明优选的配体是多或单克隆抗体。
本发明也提供了一种治疗或预防动脉硬化的方法，它减少与脂蛋白ApoB分子相关联的ApoCIII分子的数目。正常的个体，约有一个ApoB存在于LDL粒子中，ApoB与1到5个ApoCIII分子相关联。患病的个体，ApoCIII分子增加到25个。因此，本发明提供一种治疗或预防动脉硬化方法，它减少在动脉硬化个体的LDL中每个ApoB分子与ApoCIII分子的比率从高患病状态水平(接近20到25比1)到治疗水平优选15∶1以下，更优选10∶1以下，更优选5∶1以下，优选3∶1以下，最优选接近1∶1ApoC∶ApoB。在含有ApoB的脂蛋白中的ApoCIII的水平可以通过悬液计测量悬液或电免疫扩散法测量测定(正常范围是2到3mg/dL)。
本发明也提供用于医药的ApoCIII的合成或重组生产方法。
本发明通过下面的举例来说明例1肽的合成ApoCIII肽(1-79，1-17，12-35，45-65和45-76(SEQ ID NO.s1，2，4，6和7))采用固相方法合成，它通过在Model ABI 433A(Applied Biosystems Inc.)自动合成仪上使用Boc/Bzl方法在Boc-Ala-PAM树脂合成完整的apoCIII，在MBHA树脂上合成其他片断。每一个氨基酸通过二环己基碳二亚胺/羟基苯并三唑连接两次，没有封端。保护族侧链如下Arg(Ts)，Asp(Ochex)，Glu(Ochex)，Lys(2-CI-Z)，His(Dnp)，Ser(Bzl)，Thr(Bzl)，Met(O)and Tyr(Br-Z)。按照这个序列，在His上的Dnp族从肽上去掉，在从它的支持物上剪切之前用10％β-巯基乙醇、5％的二异丙基乙胺在DCM中处理2小时并在NMP中处理2小时。然后肽基树脂用50％的TFA在DCM中处理20分钟去除氨末端Boc。肽从树脂分离，并同时按照低和高HF程序去除保护树脂(1g)在对甲酚(0.75g)、对甲苯硫酚(0.25g)和二甲亚砜(6.5ml)中于0℃下用无水的HF(2.5mL)进行处理。3小时后，氢氟酸和二甲亚砜通过真空蒸发和残余物清理器清除，用二乙醚萃取产物。反应容器再装入对甲酚(0.75g)、对甲苯硫酚(0.25g)和10ml的无水HF并在0℃使混合物反应1.5小时。通过蒸发去除氢氟酸并用二乙醚粉碎残余物。将残余物过滤，用二乙醚清洗并用200ml的10％浓度的乙酸水溶液萃取并冻干，粗产品采用反相HPLC在Vydac C 18柱上(4，6 x 250mm，5u，100 A)使用60分钟线性梯度从0到100％缓冲剂B(缓冲剂A0.05％TFA inH2O and缓冲剂B0.05％ TFA，60％ CH3CN in H2O)以0.7ml/min的流速分析，在215nm进行探测。合成的肽采用RP-HPLC进行提纯并用HPLC定性分析，采用光谱测量分子量。
例2 抗体生产例1合成的完整的ApoCIII用于生产多克隆兔的抗体。这种多克隆抗完整ApoCIII抗血清对其他更短的合成肽的反应性然后进行检验，从抗血清中提纯每一种肽的特定的抗体级分。
免疫接种肽ApoCIII(1-79)在完全弗氏佐剂(CFA)中乳化并每次皮下注射500ug，在第一次注射间隔15天的第二次注射采用相同的佐剂但注射了250ug的肽。免疫反应采用化验血液和ELISA系统筛选抗肽活性。
从血清中分离抗体合并阳性血样然后采用27％的硫酸钠沉淀分离多克隆抗体。通过亲和色谱法从抗体中提纯肽特异性抗体。例1中产生的肽被连接到CH活性琼脂糖亲和柱状色谱(Pharmacia，Uppsala，Sweden)(Axen and al，1967)，全部提纯的抗体通过这些柱子。非保留的抗体凝胶上的蛋白质用磷酸盐缓冲等渗盐溶液冲洗(PBSPhosphate 50mmol/L，pH7.2，NaCI 150mmol/L)。肽凝胶上的非特定的级份用25mmol/L PBS清除。采用0.2M甘氨酸，pH2.8完成多克隆特异性IgG的洗脱。提纯的抗体立即对10mmol/l PBS进行透析并采用Amicon system(cut-off 100 kD)(Amicon，Beverly，USA)浓缩，按照蛋白含量进行检验(Lowry and al，1951)，然后在-30℃作为1ml小份(0，5mg)保存。
例3ApoCIII的抗原决定基的作图ELISA在用100ul/well的游离肽(5μg/ml)(1-17，12-35，45-65，45-76和ApoCIII(1-79))包被并在室温培养过夜之前，用0.1mol/L的磷酸缓冲盐溶液(PBS，pH7，2)冲洗微量滴定板(平底96孔EIA Costar，Dutscher)。然后，这些板用缓冲液冲洗四次并减少非特定的对微量滴定孔的粘着到最少量，这些板采用250pL/well的0.1M PBS缓冲剂中3％的牛血清清蛋白饱和并在37℃培养1小时。这些板再冲洗四次，用100uL的提纯的抗完整ApoCIII抗体(例2中生产的)在37℃培养2小时，用0.1M PBS缓冲液中的1％的牛血清白蛋白稀释，然后用PBS冲洗三次。为了评估免疫反应，100uL的稀释10000倍的抗兔IgG用过氧化酶标记，抗体在PBS缓冲液中的0.1％BSA(Sanofi-Diagnostics Pasteur，Marnes-La-Coquette，France)中加入各孔。在37℃培养2小时后，这些板用PBS冲洗四次并加入100uL底物溶液。底物溶液按照如下方法配制将30mg的o-苯二胺二盐酸化物溶于20mL pH5.5含有20uL 30％过氧化氢的0.1mmol/L磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液中。避光在室温反应30min后，在每个孔中加入100ul 1mmol/L的HCl停止反应。在492nm测得吸收光谱。
结果对应于全合成的apoCIII产生的提纯的多克隆抗体被用于在ELISA中检验其与肽的反应性，也对抗完整的ApoCIII(＂ApoCIII totale＂)抗体进行了测定。结果见
图1。结果表明对应于总ApoCIII产生的抗体识别了所有的肽1-17，12-35，4565和45-76。
例4 存在于脂蛋白中的ApoCIII的抗体的亲和力目的是检测对应于肽的不同的抗原决定基是否在脂蛋白中是可达的并确定每一种抗体级分对人类血浆纯化的脂蛋白(HDL，VLDL)的亲和性和对完整的ApoCIII的亲和性。
材料和方法如例2所述通过对不同肽结合到CH琼脂凝胶上的免疫亲和性来制备肽的特定抗体片断。
夹层ELISA在用100uL/well亲和纯化肽的特定抗体(10mg/L)包被之前用0.1mol/L的磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH7.2)冲洗微量滴定板(flat-bottom 96-well EIA；Costar，Dutscher)并在室温下培养过夜。然后用缓冲液冲洗4次并在37℃与100uL的样品稀释液培养2小时(四个不同的样品被接种1提纯的人类血浆ApoCIII的标准蛋白，2人类HDL，3人类VLDL和4合成的ApoCIII(1-79)。)。为了最大的减少微量滴定器壁上的非特异性结合，抗原在0.1M PBS缓冲液中的1％的牛血清白蛋白中进行稀释。为了评估免疫反应，100uL的用0.1％的BSA在PBS缓冲液中稀释2500倍的用过氧化酶标记的多克隆抗完整ApoCIII的抗体注入每一个孔中。在37℃培养2小时后，用PBS冲洗板四次并加入100μl底物。底物溶液按照如下方法制备30mg o-苯二胺二盐酸化物(Sigma Chemical Co.，St Louis，MO)溶于含有20ml 30％过氧化氢的pH5.5的2ml0.1mmol/L的磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液中。避光在室温下反应30分钟以后，加入每孔100uL的1mol/L HCl停止反应。在492nm读出吸收光谱。
结果结果表明所有抗-12-35(图2)、抗-45-65(图3)和抗-45-76(图4)的抗体识别了在溶液(图A)中游离的合成ApoCIII，具有与对应于总ApoCIII产生的多克隆抗体有近似同样的亲和力。图B表示VLDL的识别，图C表示HDL的识别、图D表示ApoCIII(1-79)的识别。在肽特异性抗体中，抗-12-35有与在标准血浆和HDL中对ApoCIII的最高亲和力。抗(12-35)和VLDL的反应类似于获得的与完整抗-apoCIII兔多克隆抗体的反应。
例5 不同抗体对于apoCIII结合到VLDL的作用目的是确定每一种抗体抑制ApoCIII与VLDL结合的能力。使用常规技术通过超速离心法从正常的甘油三酯(NTG)和高甘油三酯(HTG)患者中分离出VLDL级分。第三VLDL级分从NTG组制备，其中额外的ApoCIII在体外加载入VLDL颗粒(富化VLDL或VLDLE-CIII)。
放射标记对提纯的ApoCIII采用McFarlane方法的Bilheimer修饰进行放射性标记(Bilheimer等，1972，Biochim.Biophys.Acta，160，212-221)。AG2-X8树脂用1M的NaOH再生(5分钟)，用蒸馏水冲洗，然后用PBS 0.01M BSA1％(w/v)饱和。ApoCIII对PBS-EDTA 0.01M透析。0.5mCi125I加入到0.1ml的含有5ul 0.033M ICI溶液的放射性标记的缓冲液(1M氨基乙酸，1M NaCl)。制备的溶液与50ul的洗涤树脂混合。游离125I与树脂采用离心分离(1 minute在62200rpm)除去，然后通过对0.01M的PBS-ADTA透析回收apo CIII。
VLDL中的apo CIII的结合(抗apo CIII存在或不存在)20ug每种抗apo CIII抗体与等价量的125I-apo CIII一起在37℃培养2小时。脂蛋白(VLDL NTG，VLDLHTG或VLDL E-CIII)和抗体125I-apo CIII(w/w)混合；37℃培养1小时，没有结合的125I-apo CIII透析。对结合到脂粒子的125I-apo CIII和未结合的125I-apo CIII进行125I放射性测量，从而获得抗体对抑制apo CIII和脂蛋白结合能力的速率。
结果图5中的试验结果表示所有的抗体(抗完整的ApoCIII或特定的肽)对于VLDL中apo CIII的结合与抗apo CIII多克隆抗体相当。
例6，ApoCIII特异性抗体对于脂蛋白脂肪酶活性的作用目的是检验这种抗体保护脂蛋白脂肪酶免于apo CIII抑制的作用的能力。
乙酰肝素硫酸盐蛋白聚糖-结合脂蛋白脂肪酶的脂解作用的分析实验在96孔的微量滴定板中进行。将0.5ug的乙酰肝素硫酸盐蛋白聚糖(HSPG)在100ul的PBS 0.1M NaCl 0.15M pH7.2-7.4，4℃条件下在孔中培养18小时，用PBS冲洗3次，用含有1％(w/v)基本上游离的脂肪酸牛血清蛋白(BSA)在37℃封闭一小时。然后，这些孔用2μg的脂蛋白脂肪酶(LPL)在100ul的0.1M Tris20％甘油(v/v)中在pH8.5，4℃条件下培养2小时。没有固定的LPL用Tris缓冲液(0.1M Tris，pH8.5)洗三次。
然后制备VLDL的4个级分P1含有在体外与ApoB一起富集的人类血浆纯化的VLDL；P2含有在体外与ApoB和ApoE一起富集的人类血浆纯化的VLDL。其他级分通过用ApoCIII(P1/ApoCIII富集和P2/ApoCIII富集)富集从P1和P2中制备。这四个级分然后用兔抗完整ApoCIII培养。
通过加入100ul的脂蛋白到LPL包被的板(0.055到0.5mg/ml的0.1MTris，pH8.4和1.5％BSA(w/v))并在37℃培养开始进行脂解反应。20分钟后加入100ul Tris缓冲剂，Triton X-100(2％(v/v)，终浓度)，停止反应，最后浓缩。100ul的脂解脂蛋白从每个孔中取样，在-20℃冷冻，然后采用NEFA-CKit(Wako chemicals Neuss，Germany)按照制造商的说明书测量浓缩的游离脂肪酸。
结果实验结果如图6所示，在抗ApoCIII抗体存在的所有的情况下，脂蛋白脂肪酶的活性都增大。
例7，抗体对于胆固醇排出的作用目的是检验抗ApoCIII抗体对于HDL的可能的负作用。
1.分离脂蛋白采用连续超速离心分离和Kbr进行密度调整，以密度为1，063-1，21从新鲜的正常的脂血的人类血浆中分离HDL，在d＝1，21浮选冲洗和对0，01M磷酸盐缓冲盐水，pH7.4透析。
2.免疫亲和色谱法分离含有ApoCIII的脂蛋白采用免疫亲和色谱法将抗CIII抗体结合到活性凝胶4B上，制备含有ApoCIII的HDL和不含ApoCIII的HDL。用0.01M磷酸盐缓冲盐溶液，pH7.4的EDTA 0.1g/L洗脱含ApoCIII的HDL并用3M硫氰酸钠洗脱不含ApoCIII的HDL。含ApoCIII的HDL对0.01M磷酸盐缓冲盐溶液，pH7.4，EDTA 0.1g/L进行透析。纯的HDL级分称为HDLt，保留的含ApoCIII的级分称为HDL CIII，未吸附的HDL级分称为非CIII的HDL。
3.接种条件小鼠肝细胞Fu5AH以25000细胞/mL和每孔2ml的量接种在12孔板的每一个孔中，用极限基本培养基95％(GIBCOBRL)进行培养，并用青霉素(100ug/mL)，链霉素(100g/mL)谷氨酰胺酶(2mM)和5％(v/v)新生小牛血浆补充。在细胞脂质放射性标记之前，细胞在潮湿的5％CO2大气，37℃下成长2天。
我们每个样品用3个孔，为了控制流出物正确性，我们使用-负对照1mL的极限基本培养基-正对照100ug/mL的HDL3-内部对照-20℃下储存的人类正常脂血血浆合并物并以2,5％(v/v)的浓度使用-标记胆固醇负载对照在用样品培养之前进行细胞的放射活性测量。
4.Fu5AH细胞的放射性标记。-放射性标记胆固醇[1α，2α，(n)3H)胆固醇加入细胞得到最后的浓度1uCi/孔-在N2条件下蒸发XuCi-加1mL乙醇并在60℃培养45到60分钟。
-在N2下蒸发-加50μL乙醇并在60℃培养15到30分钟-加等体积的极限基本培养基(MEM)和新生小牛血浆得到最后终浓度为MEM中的5％，并在37℃培养30分钟。
-加入MEM获得最后的体积。
-在放射性标记存在(2mL/well)的条件下细胞生长3天。
5.胆固醇流出物为了确保标记在细胞中均匀分布，在流出之前，标记培养基用含0.5％牛血清白蛋白的MEM代替24小时。
-用细胞磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗一次并在37℃、5％的CO2中培养3小时到HDL的终浓度为50μg/mL(500uL/孔)。在用细胞培养之前，HDL用不同的抗体以15μg/mL的量在37℃预先培养2小时。
-由每孔中除去含血清的培养基终止排出阶段并用PBS冲洗3次细胞。每孔取出的细胞移入500L的氢氧化钠(0.1mol/L)中。
-我们加入4mL的闪烁液(Optiphase′Hisafe′3，WALLAC)，在一分钟内用液体闪烁计数器(WALLAC 1410)对250uL的培养基或细胞悬浮液进行计算。
排出物百分比的计算如所示[dpm培养基/(dpm培养基+dpm细胞]*100结果通过免疫亲和法将含ApoCIII的HDL与不含ApoCIII的HDL分离。在不同的浓度测定有和没有抗完整ApoCIII或抗12-35抗体的不同级分(总HDL，HDL-CIII和非CIII HDH)中的胆固醇排出。结果如图7和8所示。胆固醇排出物的所有试验证实抗体不影响HDL的功能。
例8，肽辍合物的制备和免疫性制备了含肽12-35和45-65辍合于牛血清白蛋白(BSA)的免疫原，配制成疫苗，并对小鼠进行了肌肉注射。
合成了四种肽，一组以序列12-35为基础的肽和另一组以ApoCIII序列45-65为基础的肽。每一组肽都有GGC接头，存在于肽的N-端或C-端12-35COOHMQGYMKHATKTAKDALSSVQESQVGGC(SEQ ID NO.8)12-35NH2CGGMQGYMKHATKTAKDALSSVQESQV(SEQ ID NO.9)45-65COOHDGFSSLKDYWSTVKDKFSEFWGGGC(SEQ ID NO.10)45-65NH2CGGDGFSSLKDYWSTVKDKFSEFW(SEQ ID NO.11)这些肽被顺丁烯二酰亚胺化学作为蛋白质载体辍合到BSA。从Pierce购买的BSA预先用succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)-cyclohexane-1-carboxylate(SMCC)接头活化。SMCC也可以从任何主要的制造商购买并按照制造商的说明使用。在用过量的半胱氨酸胺反应停止之前，在室温下经过两小时用过量的肽借助SMCC将BSA辍合到载体上，随后对磷酸盐缓冲液进行透析。 合成的可溶的辍合免疫原的分析表明大约19个肽辍合到每一个BSA载体分子上。
通过含有皂角苷QS21，3-de-O-acylated monophosphoryl lipid A(3D MPL)和WO 95/17210描述的水包油乳剂(鲨烯和α-维生素E油相)的佐剂系统，免疫原被混合制备成疫苗。这些疫苗含有25ug的免疫原，并以0、14、28的间隔给BalbC小鼠注射；在第28天和48天采集血浆样品。然后采用ELISA化验法(板不是用ApoCIII就是用对应的肽包被)，分析这些血浆的抗完整ApoCIII和抗肽的滴度，结果用中点滴度表示。
结果结果表明所生产的肽免疫原有高的免疫原性，并诱导产生与天然完整ApoCIII强烈交叉反应的抗体。以组为单位获得的实验结果是高度一致的，表明在第三次注射后，有明显的加强。10组中的每一只小鼠的实验结果见表1。
表1 post II鼠抗肽IgG滴度(28天)
表2 post III鼠抗肽IgG滴度(42天)
表3 post II鼠抗完整ApoCIII IgG滴度(28天)
表4 post III鼠抗完整ApoCIII IgG滴度(42天)
序列表<110>史密丝克莱恩比彻姆生物有限公司(SmithKline Beecham Biologicals S.A.)<120>疫苗<130>B45212<160>11<170>FastSEQ for Windows Version 3.0<210>1<211>79<212>PRT<213>人ApoCIII肽<400>1Ser Glu Ala Glu Asp Ala Ser Leu Leu Ser Phe Met Gln Gly Tyr Met1 5 10 15Lys His Ala Thr Lys Thr Ala Lys Asp Ala Leu Ser Ser Val Gln Glu20 25 30Ser Gln Val Ala Gln Gln Ala Arg Gly Trp Val Thr Asp Gly Phe Ser35 40 45Ser Leu Lys Asp Tyr Trp Ser Thr Val Lys Asp Lys Phe Ser Glu Phe50 55 60Trp Asp Leu Asp Pro Glu Val Arg Pro Thr Ser Ala Val Ala Ala65 70 75<210>2<211>17<212>PRT<213>人ApoCIII肽<400>2Ser G1u Ala Glu Asp A1a Ser Leu Leu Ser Phe Met Gln Gly Tyr Met1 5 10 15Lys<210>3<21l>40<212>PRT<213>人ApoCIII肽<400>3Ser Glu Ala Glu Asp Ala Ser Leu Leu Ser Phe Met Gln Gly Tyr Met1 5 10 15Lys His Ala Thr Lys Thr Ala Lys Asp Ala Leu Ser Ser Val Gln Glu20 25 30Ser Gln Val Ala Gln Gln Ala Arg35 40<210>4<211>24<212>PRT<213>人ApoCIII肽<400>4Met Gln Gly Tyr Met Lys His Ala Thr Lys Thr Ala Lys Asp Ala Leul 5 10 15Ser Ser Val Gln Glu Ser Gln Val20<210>5<211>39<212>PRT<213>人ApoCIII肽<400>5Gly Trp Val Thr Asp Gly Phe Ser Ser Leu Lys Asp Tyr Trp Ser Thr1 5 10 15Val Lys Asp Lys Phe Ser Glu Phe Trp Asp Leu Asp Pro Glu Val Arg20 25 30Pro Thr Ser Ala Val Ala Ala35<210>6<211>21<212>PRT<213>人ApoCIII肽<400>6Asp Gly Phe Ser Ser Leu Lys Asp Tyr Trp Ser Thr Val Lys Asp Lys1 5 10 15Phe Ser Glu Phe Trp20<210>7<211>32<212>PRT<213>人ApoCIII肽<400>7Asp Gly Phe Ser Ser Leu Lys Asp Tyr Trp Ser Thr Val Lys Asp Lys1 5 10 15Phe Ser Glu Phe Trp Asp Leu Asp Pro Glu Val Arg Pro Thr Ser Ala20 25 30<210>8<211>27<212>PRT<213>人ApoCIII肽<400>8Met Gln Gly Tyr Met Lys His Ala Thr Lys Thr Ala Lys Asp Ala Leu1 5 10 15Ser Ser Val Gln Glu Ser Gln Val Gly Gly Cys20 25<210>9<211>27<212>PRT<213>人ApoCIII肽<400>9Cys Gly Gly Met Gln Gly Tyr Met Lys His Ala Thr Lys Thr Ala Lys1 5 10 15Asp Ala Leu Ser Ser Val Gln Glu Ser Gln Val20 25
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权利要求
1.一种用于治疗动脉粥样硬化的免疫原，其中包括载脂蛋白或其肽或其片断，全长形式的载脂蛋白至少具有下列一种活性(a)抑制载脂蛋白B与其受体结合，和，或(b)抑制脂蛋白脂肪酶。
2.权利要求1所述的免疫原，其中载脂蛋白具有两种活性。
3.权利要求1所述的免疫原，其中载脂蛋白是ApoCIII或其片断，肽或mimotope。
4.权利要求3所述的免疫原，其中ApoCIII被耦合或融合到蛋白载体中。
5.权利要求1-4中任一权利要求中所述的免疫原，其中免疫原是从SEQID NO.1-7中选择的一个序列。
6.一种包括权利要求1-5中任一权利要求所述的免疫原和佐剂的疫苗。
7.一种通过选择性抑制人宿主中导致动脉粥样硬化的载脂蛋白的活性来治疗和预防动脉粥样硬化症的方法，包括提供给需要这种治疗或预防的人宿主一种制剂，该制剂能抑制至少一种下述载脂蛋白的活性(a)抑制载脂蛋白B结合到其受体上，和，或(b)抑制脂蛋白脂肪酶。
8.一种通过选择性抑制人宿主内ApoCIII的活性来治疗或预防动脉硬化症的方法，包括提供给需要这种治疗或预防的人宿主一种制剂，该制剂能选择性抑制ApoCIII活性。
9.权利要求7或8所述的方法，其中制剂是一种包括作为一种免疫原的ApoCIII或其片断的疫苗。
10.权利要求7或8所述的方法，其中试剂是ApoCIII的配体。
11.权利要求10所述的方法，其中配体是一种抗体。
12.权利要求7-11所述的方法，其中制剂阻断了ApoCIII-介导的脂蛋白脂肪酶抑制和ApoB结合到其受体上。
全文摘要
本发明涉及一种新的治疗和预防性治疗动脉粥样硬化疾病的疫苗。相应地本发明提供的免疫原由载脂蛋白或其片断或其衍生物及其混合物组成，它们全长天然形式的载脂蛋白具有至少下列一种活性(a)抑制载脂蛋白B与其受体结合，和，或(b)抑制脂蛋白脂肪酶。优选的实施例中载脂蛋白是载脂蛋白C－III(ApoCIII)。包含本发明所述免疫原的疫苗可以有效的阻止或减少动脉硬化症的斑块的形成和延长其周期，同时可以有效的减少动脉硬化带来的冠状或脑血管疾病。相应地，本发明还提供一种新的通过选择性抑制人宿主中特异的载脂蛋白活性来治疗动脉硬化症的方法，其中优选载脂蛋白是ApoCIII，该方法包括向人给药选择性抑制载脂蛋白活性的试剂。也提供了一种通过主动或被动接种疫苗使病人产生具有结合含下列至少一种活性的载脂蛋白的抗体的方法来治疗或延缓动脉硬化症(a)抑制载脂蛋白B和其受体结合，和，或(b)抑制脂蛋白脂肪酶；在本发明的一方面抗体优选能结合和消除ApoCIII的活性。更进一步提供了本发明的免疫原或疫苗在医药中的应用和生产它们的方法。
文档编号C07K14/47GK1418106SQ01805933
公开日2003年5月14日 申请日期2001年3月1日 优先权日2000年3月3日
发明者J·－C·弗鲁查特, P·蒙泰尼, R·帕尔曼蒂尔, M·P·范梅赫伦 申请人:史密丝克莱恩比彻姆生物有限公司