专利名称：人血清白蛋白多聚体的单体化方法
技术领域：
本发明涉及人血清白蛋白多聚体的单体化的方法。具体指的是关于用碱性溶液处理(以下称之为“碱性处理”)人血清白蛋白多聚体进而得到单体的方法，其中的人血清白蛋白多聚体指的是在以人血浆为原料的制备人血清白蛋白的步骤中或者在应用基因重组技术制造人血清白蛋白的步骤中生成的人血清白蛋白多聚体。
本发明还涉及通过加入含有SH基化合物，抑制由于上述的碱性溶液处理造成的人血清白蛋白的分子内或者分子间的二硫键的不正确结合所致的错误交联的方法。
最初，HSA是根据Cone的低温乙醇分级法或者以这种方法为基准的方法，从人血浆得到HSA组分(HSA组分分级为V)后，进一步，通过利用各种纯化方法进行制备。并且，近年来，作为不依赖人血浆为原料的方法，应用基因重组技术开发了在酵母和大肠杆菌、枯草杆菌中生产人血清白蛋白的技术。
参考在酵母中(1)Production of Recombinant Human SerumAlbumin from Saccharomyces cerevisiae；Quirk，R.et.al，Biotechnology and AppliedBiochemistry 11，273-287(1989)、(2)Secretory Expression of the Human Serum Albumin Gene in theYeast，Saccharomyces cerevisiae；Ken.Okabayashi et.al，J.Biochemistry，110，103-110(1991)、(3)Yeast Systems for theCommercial Production of Heterologous proteins；Richard G.Buckholz and Martin A.G.Gleeson，Bio/Technology 9，1067-1072(1991)、在大肠杆菌(4)Construction of DNA sequences and theiruse for microbial production of proteins，in particular humanserum albumin；Lawn，R.M.，European Patent Appl.73，646(1983)、(5)Synthesis and Purification of mature humanserum albumin from E.coli；Latta，L.et.al.Biotechnique5，1309-1314(1897)、在枯草杆菌(6)Secretion of human serumalbumin from Bacillus subtilis；Saunders，C.W.et.al，J.Bacteriol.169，2917-2925(1987)。
人血清白蛋白的纯化方法一般使用蛋白质化学中常规使用的纯化方法，例如使用盐析法、超滤法、等电点沉淀法、电泳法、离子交换层析法、凝胶过滤层析法、亲和层析方法等。实际上，在纯化人血清白蛋白时，由于其中混有来自生物组织、细胞、血液等的多种污染物，所以采用上述方法的复杂组合进行纯化。
进行人血清白蛋白工业生产时，必须在不同于人的体内环境的各种条件下进行处理，因此生成了人血清白蛋白的多聚体。在临床应用人血清白蛋白时，尽管尚未见到报告这种多聚体对人体产生的坏影响，但是怀疑这种多聚体能够表现出新的抗原性。从医药的安全性角度出发，在医药用“人血清白蛋白”检验标准中规定了多聚体混入量的限度，因此在制造上，尽可能降低制剂中的多聚体含量是非常重要的课题。
已有几篇用于去除生产过程中产生的多聚体的报道。例如据报道组合使用各种层析技术(SepHadex G-25，DEAE-以及C E-SepHaroseCL-6B，sepHacryl S-200等)，从血浆乙醇分级分离的V组分中得到了纯度99％、凝集体(和“多聚体”同义)在1％以下的HSA(JOURNALOF APPLIED BIOCHEMISTRY5，282-292，1983)、或者向组分V中加入稳定剂，进行加热处理(50～70℃，1～10小时)后，利用硫酸铵和聚乙二醇以及等电点沉淀法，除去污染物和HSA聚集体(特愿昭63-265025)(特开平2-111728)。
可是，所有这些方法都是在HSA的制造过程中，从所产生的含有HSA多聚体的溶液中去除该种多聚体，制造出不含有这种多聚体的HSA的方法。因此，如果根据上述的方法，将能够转换成单体的多聚体去除后，只是废弃掉，伴随去除操作不可避免的造成单体收率的损失。HSA制剂是一种对患者进行大量给药性质的制剂，与其他蛋白质制剂相比，需要扩大的生产量，因此在工业上期待有尽可能降低多聚体的含量能够高效率进行HSA生产的制造方法。
本发明的第二目的是提供一种在人血清白蛋白的制造过程中，用于抑制在进行碱性溶液处理(包括层析法等)步骤中所形成的人血清白蛋白分子内错误交联或HSA自体或者HSA和其他的夹杂物形成的分子间错误交联的方法。
此外，本发明的第三目的是提供高安全性的人血清白蛋白医药用品。
本发明者等人就上述情况进行了刻苦的研究，结果发现在碱性条件下，将含有多聚体的HSA或者rHSA水溶液放置适当时间后，这种多聚体能够转换成单体。本发明者等人进一步发现，用添加含有诸如半胱氨酸的SH基的化合物的处理液处理上述的碱性溶液，能够抑制HSA的分子内以及/或者分子间的错误交联。
本发明是基于上述的发现完成的。
本发明的第一部分提供人血清白蛋白多聚体的单体化方法，以碱性溶液处理人血清白蛋白的多聚体为特征。
本发明的第二部分提供以在含有SH基化合物存在的情况下，进行碱性溶液处理人血清白蛋白的多聚体为特征的将人血清白蛋白多聚体单体化的方法。
本发明第三部分提供在碱性溶液处理人血清白蛋白的多聚体进行单体化时，用来抑制人血清白蛋白的错误交联的方法，以人血清白蛋白溶液在含有SH基化合物存在的情况下，用碱性溶液处理为特征。
本发明的第四部分提供根据第一部分的单体化方法得到的多聚体含量很低的HSA。
本发明的第五部分提供了根据第一、第二或第三部分的方法得到的不含有该复合体的HSA。
本发明的第2方法以在人血清白蛋白的制造过程中，在将人血清白蛋白多聚体进行单体化的时候所使用的碱性溶液中存在含有SH基化合物为特征。
通常情况下，蛋白质溶液进行碱性化时，蛋白质分子内的半胱氨酸残基的巯基能够在蛋白质分子内或者蛋白质分子间形成二硫键(包括二硫键交换反应)。此时，发生二硫键不正确交联，能够产生与天然蛋白质的立体构型不同的蛋白质。这种二硫键的不正确交联能够在分子内或者分子间发生。因此，当混有多种不同的夹杂物时，能够和这些污染物之间形成二硫键，产生新型物质。将这种错误的二硫键交联称为“错误交联”。一旦通过错误交联形成了新型物质，去除这种物质是非常困难和麻烦的。这种新型物质通过表现出新的抗原性和其他原因等，可能引起用药患者发生过敏反应等的副作用。根据本发明的第2方法，能够有效的抑制由于碱性化而产生的人血清白蛋白分子内或者分子间的错误交联，可以制造更高纯度的人血清白蛋白。
在本发明中所使用的人血清白蛋白多聚体的来源没有特别的限制，血浆来源的HSA或者根据基因重组技术生产得到的HSA(以下称之为“rHSA”)的衍生物都可以提供进行碱性化处理。以下，将HSA以及rHSA的多聚体均称之为“多聚体”。
进行血浆来源的HSA制造的时候，能够预测到在制造的各个步骤中生成的多聚体的量，在任何一个步骤中生产的含有多聚体的水溶液都可以使用。例如低温乙醇分级分离的组分V的水溶液、将组分V提供用于进一步纯化步骤(层析法或者热处理等)时在随后的各个纯化阶段所产生的含有多聚体的水溶液等。
同样也能够使用rHSA制造时在各个制造步骤中所产生的含有多聚体的水溶液。例如rHSA产生宿主的培养物、这种培养物用于进一步制造步骤(层析、热处理等)，在任何生产步骤中生产的含有多聚体的水溶液等。在这里所说的培养物指的是培养上述宿主的培养液以及按照通常使用的方法将宿主破碎得到的含有宿主破碎液的物质。
作为rHSA生产所使用的宿主，只要是能够生产rHSA的宿主，没有特殊的限制。例如可以使用酵母、细菌、动物细胞、植物细胞等，其中较好的是酵母。
在制造过程中，用碱性溶液处理HSA或者rHSA中含有的多聚体时的HSA或者rHSA的浓度，只要是能够溶解HSA或者rHSA的浓度，没有特殊限制，其中较佳的是100mg/mL以下的浓度。
HSA或者rHSA的多聚体进行单体化时的碱性溶液的pH较佳的是8～11，更佳的是8.5～9.5，最佳的是9.0。
碱性处理液中使pH碱性化时所使用的化学物质没有特殊的限定。例如碱性有机化合物、碱性无机化合物，具体指的是氨、氨盐、碱性金属的氢氧化物(例如氢氧化钠、氢氧化钾)、硼酸盐、磷酸盐、醋酸盐、草酸盐、柠檬酸盐、三羟氨基甲烷以及由上述2种以上的混合物组成的组中选用的物质。
所加入的化学物质，根据含有多聚体水溶液的浓度不同而有所差异，在使HSA或者rHSA不发生变性的范围内使用。
在人血清白蛋白的多聚体的单体化时，将含有多聚体的水溶液进行碱性化后，所定的放置时间较好是15分钟以上，更好是3小时以上。放置时间的上限没有特殊限定。
进行碱性处理的温度，在使HSA或者rHSA不发生变性的温度以下即可。例如0～65℃、较好是10～40℃、更好是在室温(约25℃)。
作为碱性溶液处理时HSA或者rHSA的溶液中存在的含有SH基的化合物，只要是含有SH基官能团的化合物即可，没有特殊的限制。优选含有SH基的低分子量的化合物。具体指的是半胱氨酸、巯乙胺、胱胺和蛋氨酸等。优选采用半胱氨酸。对1～100mg/mL的HSA或者rHSA浓度，添加含有SH基化合物以达到终浓度为0.1～50mM较好，达到0.2～15mM更好，达到0.5～5mM最好。
在应用基因重组技术的制造中，将分泌这种rHSA的宿主培养液或者这种rHSA产生宿主破碎后直接将破碎物进行低速离心分离后，通过阳离子交换、阴离子交换、凝胶过滤、盐析、螯合层析、疏水性层析以及吸附层析等多种纯化方法以及这些方法的组合等进行高纯度产品的制备。
此外，血浆来源的HSA例如人来源的血浆进行低温乙醇分级分离，得到含有含量约90％的HSA的组分V后，利用前述的纯化方法进行纯化。低温乙醇分级分离前，可以进行热处理以防止蛋白水解酶的降解作用。
本发明第1方法，可以用于前述的HSA或者rHSA的制造过程中的任何步骤。用在pH5以下的条件下进行人血清白蛋白溶液处理步骤较好，例如能够有效的用于阳离子交换层析、阴离子交换层析后所生成的多聚体的单体化。
本发明的第2方法，可以用于前述的HSA或者rHSA的制造过程中的任何步骤。用于pH5以下的条件下进行血清白蛋白溶液的处理步骤较好，例如能够有效的用于阳离子交换层析、阴离子交换层析后所生成的多聚体利用碱性溶液处理进行单体化。
表1
实施例2采用0.5M的氢氧化钠进行rHSA多聚体的单体化按照调制例1的方法进行制备，将含有26.10％的多聚体的rHSA的10％水溶液(50ml)中添加0.5M的氢氧化钠溶液(2.8ml)，调整pH为9。之后，在室温放置5小时，在适当的时间间隔进行样本收集，将样本加到配有预先用0.1M KH2PO4/0.3M NaCl缓冲液平衡化的TSKgel G300 SW(Tosoh公司制备)的凝胶过滤柱的高效液相色谱上。根据其分析结果，计算出所用溶液的白蛋白多聚体的含量。经5个小时的碱性化处理，多聚体向单体转换，经确认得到了良好的rHSA多聚体的单体化效果(表2)。
表2
实施例3向按照调制例1的方法进行制备得到的含有rHSA组分50ml中添加半胱氨酸至其终浓度为0～15mM，之后，再向其中添加0.5N的氢氧化钠溶液(2.8ml)，调整pH为9.0。之后，在室温放置5小时。然后向该溶液中添加醋酸水溶液，调整pH为7.0，结束碱性溶液处理。根据常规方法，在进行该溶液的SDS-PAGE(10-20％梯度凝胶)之后，进行蛋白质印迹。用羊抗-人血清白蛋白作为第一抗体，用抗羊IgG-HRP偶联物作为第二抗体，根据化学发光使其发色转移显影至膜上。
图1显示的是以未添加半胱氨酸的碱性溶液处理前后的蛋白质印迹分析的结果。检测到用碱性溶液处理后的试验材料②形成由于分子内错误交联分子量约为68000的rHSA。添加各种浓度的半胱氨酸，用碱性溶液进行处理，将条带进行考马斯染色，以解析软件(Collage Ver.3)测定各个条带的浓度。结果如图3所示。各个数值是相对未添加半胱氨酸时的条带的浓度为100％的相对值。
表3
可以看到由于在进行碱性化处理时有半胱氨酸存在，结果能够有效的抑制人血清白蛋白的分子内错误交联。
如果根据本发明的第1方法，在人血清白蛋白的制造过程中，将在以前的技术中去除并且废弃的人血清白蛋白多聚体以非常简单、低成本的方法实施碱性溶液处理法，有效的将其转变为单体。其结果，能够提供制剂中多聚体的量少于用以前的技术所得到的，安全性高的人血清白蛋白制剂。
此外，如果根据本发明的第1方法，只用碱处理即可将人血清白蛋白的多聚体向单体转换进而回收，因此不会造成在从前的方法中由于排除了多聚体而造成的人血清白蛋白的损失，能够高效率的进行人血清白蛋白单体的回收。因此，本发明的方法有可能在人血清白蛋白的制造时大幅度的减少成本。
如果根据本发明的第2方法，血浆中的HSA或者应用基因重组技术得到的rHSA制造工艺的氧化环境下，能够特异并有效的降低生产的人血清白蛋白的分子内或者分子间的错误交联。
此外，根据本发明，能够得到减少了由于错误交联生成的作为人体给药时产生过敏反应等副作用的原因的新型物质的高纯度的人血清白蛋白。
权利要求
1.人血清白蛋白多聚体的单体化的方法，其特征在于以碱性溶液处理人血清白蛋白的多聚体。
2.人血清白蛋白多聚体的单体化的方法，其特征在于，在含有SH基化合物存在下，用碱性溶液处理人血清白蛋白的多聚体。
3.一种方法，是在用碱性溶液处理人血清白蛋白的多聚体使之单体化时，作为抑制人血清白蛋白错误交联的方法，其特征在于，在含有SH基化合物存在下，用碱性溶液处理该人血清白蛋白溶液。
4.权利要求2或3中所记载方法，其中含有SH基化合物的浓度为0.1～50mM。
5.权利要求4中所记载方法，其中含有SH基化合物的浓度为0.2～15mM。
6.权利要求5中所记载方法，其中含有SH基化合物的浓度为0.5～5mM。
7.权利要求2至6中任何一项所记载方法，其中含有SH基化合物为低分子化合物。
8.权利要求2至7中任何一项所记载，其中含有SH基化合物选自半胱氨酸、巯乙胺、胱胺和蛋氨酸。
9.权利要求1至8中任何一项所记载的，其中人血清白蛋白是根据基因重组技术生产的重组人血清白蛋白。
10.权利要求9中记载的方法，其中碱性溶液的pH值为8～11。
11.权利要求10中记载的方法，其中碱性溶液的pH值为8.5～9.5。
12.权利要求11中记载的方法，其中碱性溶液的pH值为9.0。
13.权利要求1至12任何一项中记载的方法，其中碱性溶液处理时间为15分钟以上。
14.权利要求13中记载的方法，其中碱性溶液处理时间为2～8小时。
15.权利要求14中记载的方法，其中碱性溶液处理时间为3～4小时。
16.权利要求1至15任何一项中记载的方法，其中碱性溶液处理在0～65℃进行。
17.权利要求16中记载的方法，其中碱性溶液处理在室温进行。
18.权利要求1至17任何一项中记载的方法，其中碱性溶液由选自碱性有机化合物和碱性无机化合物的物质制备而成。
19.权利要求1至18任何一项中记载的方法，其中碱性溶液由选自氨、氨盐、碱性金属的氢氧化物、硼酸盐、磷酸盐、醋酸盐、草酸盐、柠檬酸盐、三羟氨基甲烷以及由上述2种以上的混合物的物质制备而成。
20.权利要求1至19任何一项中记载的方法，其中碱性溶液由选自氨、氢氧化钠、氢氧化钾、硼酸、硼酸盐、三羟氨基甲烷以及上述2种以上的混合物的物质制备而成。
全文摘要
一种用碱性溶液处理人血清白蛋白多聚体，使人血清白蛋白多聚体单体化的方法。根据本方法，能够非常简便、低价、有效的将人血清白蛋白多聚体转变成单体。作为用碱性溶液处理人血清白蛋白多聚体使之单体化时抑制人血清白蛋白的错误交联的方法是一种以将该人血清白蛋白溶液在含有巯基SH基团化合物存在下，进行碱性溶液处理。根据本方法，能够在进行血浆中的HSA或者应用基因重组技术获得rHSA的制造环节的氧化环境下，特异并且有效的抑制血清白蛋白的分子内或者分子间发生错误交联。减少作为进行人体给药时可能引发过敏等副作用的原因的由于错误交联所生成新型物质的量，进而得到高纯度的人血清白蛋白。
文档编号C07K14/435GK1406247SQ01805647
公开日2003年3月26日 申请日期2001年10月24日 优先权日2000年10月24日
发明者野内俊伸, 沟上宽, 田嶋义高, 横手公幸, 足达聪, 宫津嘉信, 田边哲郎, 牛尾义高, 柴田伸一 申请人:财团法人化学及血清疗法研究所