胸腺五肽可溶性微针及其制备方法与流程

本发明涉及药物制剂技术领域，特别是涉及一种胸腺五肽可溶性微针及其制备方法。

背景技术：

胸腺五肽(tp5)具有与胸腺生长素相同的全部生物活性，对机体免疫功能具有双向调节作用，可促进胸腺细胞的生长和分化，调节机体免疫功能失调，减轻自身免疫性疾病的症状和抗衰老作用。其可选择性地通过提升细胞内camp水平诱导thy-1的前胸腺细胞转化为thy-1的t细胞，活化或调节不同t细胞亚群的数目和功能，最终实现对整个机体免疫系统的双向调节，目前在临床上已经被广泛地应用。胸腺五肽主要用于治疗多种恶性肿瘤(如淋巴瘤)以及术后的感染与并发症、糖尿病及其所致的各种慢性并发症、慢性肝炎(如丙型肝炎，病毒性肝炎合并胆道感染、腹膜炎)、自身免疫性疾病(如类风湿性关节炎、红斑狼疮、肾小球肾炎、多发性硬化)、衰老体弱所致的免疫功能下降(动脉血管硬化和治疗老年性早期白内障)等。可见，胸腺五肽作为免疫调节剂，在许多治疗领域具有重要的应用价值。体内药代动力学及稳定性实验表明，tp5在血浆中的半衰期为30s。目前临床应用tp5治疗各类疾病的用药周期为7天至6个月不等，且国内外的上市剂型均为注射用冻干粉针，通常通过静脉注射或肌肉注射进行给药，其长期、频繁使用导致病人顺应性大大降低，用药极为不便。因此，开发一种新型的胸腺五肽制剂，可防止其在胃肠道内的酶解，降低频繁、长期注射带来的痛苦，是胸腺五肽制剂研究与开发过程中亟待解决的重要问题。

目前针对胸腺五肽的研究主要集中在其缓控释制剂上，包括缓释微球，脂质体、纳米粒、水凝胶，包括植物血凝素修饰plga纳米粒促进口服吸收、聚乳酸-乙醇酸共聚物(plga)和聚乳酸(pla)为载体材料包载胸腺五肽的缓释微球、鼻腔给药制剂等，但纳米粒存在载药量过低或者释放不完全的问题，微球有潜在的突释问题、长期鼻腔给药可能给呼吸系统造成一定程度的伤害等。因此，有必要采用其他手段更加有效地解决胸腺五肽给药不便的问题，如经皮给药技术等。

经皮给药系统(transdermaldrugdeliverysystem，tdds)，是指使药物通过皮肤经毛细血管吸收进入血液循环从而达到治疗效果的一类给药系统。自1979年美国fda批准第一个透皮贴剂—东莨菪碱贴片上市以来，经皮给药系统便展现出其独特的优势：避免胃肠道酶解和肝脏首过效应，大大减少注射给药带来的疼痛，使用方便，可维持人体血药浓度的稳定，降低不良反应。然而皮肤角质层是药物经皮吸收的主要障碍，特别是大分子药物。为了解决这一问题，目前应用的促进经皮吸收的方法有三大类：1.物理方法(离子导入，超声导入，电致孔等)，这类方法虽能很好促进大分子药物经皮吸收，但对皮肤有潜在的危害性，且给药不方便；2.化学方法(化学促渗剂，前体药物)，对小分子物质渗透速率影响明显，但对大分子药物无显著效果；3.药剂学方法(脂质体，微乳)，对结构复杂，稳定性较差的生物大分子可能造成活性的降低。近年来，微针作为促进经皮吸收的一种物理促渗技术被广泛关注，并得到了迅猛发展，以其给药方便、无痛等优点为大分子药物如蛋白质、多肽、dna等开发出了新剂型，大大提高了病人的顺应性。

微针(microneedle,mn)由长度在25μm-2000μm的微米级的针尖接连在基座上构成，可根据治疗需要调节针尖长度，并可根据治疗区域的变化改变形状。微针可有效刺穿皮肤最外层的屏障——角质层，利用在皮肤中形成的微米级的实体通道传递药物进入体循环或者在特定部位蓄积。与离子导入、电致孔、化学促渗剂等相比，微针促渗效果更为显著，且由于微针并未深入至真皮层的痛觉神经，其所产生的实体通道为微米级，对比注射手段，可大大降低给药时带来的痛感，提高了病人的顺应性。此外，微针亦可与其他促渗技术方法联用，进一步提高经皮给药效率。

微针的结构与传统注射器的针头不完全相似，针头的形状既有对称圆锥形也有非对称斜面形等等。依据内部结构不同，微针可分为空心微针和实心微针；微针制备材料种类繁多，包括金属、陶瓷、硅、高分子聚合物等；根据微针的类型不同，采取给药方式有所不同，主要分为微创敷贴、包衣微针、可溶性微针、凝胶微针、微针注射这五大类，前四种为实心微针给药方式，后一种为空心微针给药方式。

其中，可溶性微针是由水溶性辅料或者可降解的高分子材料与药物混合形成。药物可直接存储在针尖中。刺入皮肤后，微针的针尖材料可在皮肤内少量的组织液的存在下溶解，迅速释放出药物以达到治疗的效果。针尖材料包括高分子聚合物或糖类。承载的药物可以是小分子化学物质，也可以是大分子如蛋白质、核酸。可溶性微针由基底与连接在基底的数十或数百个针尖构成，基座可作为一个施加压力的平台，施用后便可剥离，插入皮肤的针尖为有效给药部分。与基于金属或硅制备的固体微针的微创敷贴和包衣微针相比，可溶性微针有效规避了其施用过程中针尖可能断裂的风险，还可通过材料的选择实现药物释放行为的调节，也解决了给药后针头需要回收医疗废品的二次危害的问题，可实现一次性给药，操作方便。但目前，提高可溶性微针的机械强度以有效刺破角质层产生药物运输微孔道仍然是微针制剂研发过程中的一大问题。

技术实现要素：

基于此，本发明提供了一种胸腺五肽可溶性微针，该可溶性微针针尖具有良好的机械强度。

一种胸腺五肽可溶性微针，由针尖和基底组成，所述针尖由可生物降解材料、牛血清白蛋白(bsa)和胸腺五肽(tp5)的水溶液制备而成，所述可生物降解材料、牛血清白蛋白和胸腺五肽的质量比为25:3～15:0.5～15；所述可生物降解材料选自右旋糖酐(dex)、聚乙烯比咯烷酮(pvp)、聚乙烯醇(pva)、透明质酸(ha)、羧甲基纤维素(cmc)、二水-d-海藻糖中的至少一种；所述基底由高分子聚合物的溶液制备而成。

在其中一些实施例中，所述右旋糖酐为右旋糖酐40(dex40)、所述聚乙烯比咯烷酮为聚乙烯比咯烷酮k30(pvpk30)和/或聚乙烯比咯烷酮k90(pvpk90)。

在其中一些实施例中，所述可生物降解材料为右旋糖酐40。

在其中一些实施例中，所述针尖由右旋糖酐40、牛血清白蛋白和胸腺五肽的水溶液制备而成，所述右旋糖酐40、牛血清白蛋白和胸腺五肽的质量比为25:8～12:1～10。

在其中一些实施例中，所述右旋糖酐40、牛血清白蛋白和胸腺五肽的质量比为25:10:1～10。

在其中一些实施例中，所述右旋糖酐40、牛血清白蛋白和胸腺五肽的质量比为25:10:10。

在其中一些实施例中，所述水溶液中可生物降解材料、牛血清白蛋白和胸腺五肽的总浓度为0.3-0.5g/ml。

在其中一些实施例中，所述高分子聚合物为聚乙烯比咯烷酮和/或聚乙烯醇。

在其中一些实施例中，所述基底由聚乙烯比咯烷酮的乙醇溶液制备而成。

在其中一些实施例中，所述基底由聚乙烯比咯烷酮k90的乙醇溶液制备而成。

在其中一些实施例中，所述聚乙烯比咯烷酮k90的乙醇溶液中聚乙烯比咯烷酮k90的浓度为0.3-0.8g/ml。

在其中一些实施例中，所述聚乙烯比咯烷酮k90的乙醇溶液中聚乙烯比咯烷酮k90的浓度为0.4g/ml。

在其中一些实施例中，所述可溶性微针的针尖形状为圆锥形，针尖的高度为600～800μm，针尖的底部直径为250-350μm，相邻两针尖的圆锥顶部之间的距离为850-950μm。

在其中一些实施例中，所述可溶性微针的基底的形状为边长为0.8-1.2cm的正方形。

本发明还提供了上述胸腺五肽可溶性微针的制备方法。

具体技术方案如下：

一种上述的胸腺五肽可溶性微针的制备方法，包括以下步骤：

(1)针尖溶液的制备：将所述可生物降解材料、牛血清白蛋白和胸腺五肽加入水中，搅拌溶解，即得针尖溶液；

(2)基底溶液的制备：将所述高分子聚合物加入溶剂中，搅拌或加热溶解，即得基底溶液；

(3)针尖的制备：取适量步骤(1)中所得的针尖溶液加入到微针阴模中，离心，使针尖溶液充满微针阴模的微孔道，回收多余的针尖溶液；

(4)基底的制备：在步骤(3)的基础上，加入适量步骤(2)所得的基底溶液于微针阴模上，离心；

(5)干燥：将制备好基底的微针进行干燥，即得所述胸腺五肽可溶性微针。

在其中一些实施例中，步骤(3)所述离心的转速为3800-4200rpm，温度为0-8℃，时间为8-15min。

在其中一些实施例中，步骤(4)所述离心的转速为2800-3200rpm，温度为0-8℃，时间为3-8min。

在其中一些实施例中，步骤(5)所述干燥为常温干燥20-28h。

本发明的胸腺五肽可溶性微针及其制备方法具有以下优点和有益效果：

本发明的发明人通过大量创造性实验研究发现，在特定的可生物降解材料中加入牛血清白蛋白做为针尖材料可以制备得到机械强度良好的胸腺五肽可溶性微针，该微针可有效刺破角质层产生药物运输微孔道。牛血清白蛋白的加入，可以增加针尖的机械强度，实现对皮肤的穿刺，可有效解决目前可溶性微针针尖机械强度低，无法产生经皮递药孔道的问题，本发明胸腺五肽可溶性微针可实现高效便捷的经皮药物传递。

本发明的胸腺五肽可溶性微针，牛血清白蛋白的加入还可以提高针尖中药物的载药量，可有效地提高微针针尖部分的含药量。

本发明的胸腺五肽可溶性微针，针尖是由水溶液制备得到，基底优选乙醇作为溶剂，可有效地提高微针针尖部分的含药量，同时不会对tp5的结构造成影响，可以保证所载tp5的活性。

本发明的胸腺五肽可溶性微针全部使用可生物降解的、生物相容性好的材料制备而成，刺入皮肤后，可在组织间液对针尖材料的溶解下快速释放药物，产生的微孔道直径小、扎入深度合适，未触及皮下痛觉神经，使用过程中产生痛觉低或无痛觉，可有效避免口服导致的胃肠道酶降解，降低长期注射给药给病人带来的痛苦和不便，且可由病人自行使用，大大提高了病人的顺应性。

本发明制备的可溶性微针可将胸腺五肽包裹于针尖中，以固态形式存在，无需冷藏储存或运输，可大大延长药物制剂的货架期。

本发明制备的胸腺五肽可溶性微针与静脉注射同等剂量的胸腺五肽注射剂可产生相当的免疫调节效应。

附图说明

图1为本发明制备的可溶性微针的扫描电镜图，其中a-h分别为实施例1制备的tp5-bsa-dmna-h的单个微针(a)、实施例2制备的tp5-bsa-dmna-m的单个微针(b)、实施例3制备的tp5-bsa-dmna-l的单个微针(c)、对比例1制备的tp5-dmna-h的单个微针(d)、对比例2制备的tp5-dmna-m的单个微针(e)、对比例3制备的tp5-dmna-l的单个微针(f)、实施例2制备的tp5-bsa-dmna-m的微针阵列(g)以及对比例2制备的tp5-dmna-m的微针阵列(h)；

图2为皮肤穿刺实验的致孔情况图，其中a～c分别为对比例1～3制备的tp5-dmna-h、tp5-dmna-m、tp5-dmna-l在西藏猪皮上进行穿刺实验的致孔情况，d～f分别为实施例1～3制备的tp5-bsa-dmna-h、tp5-bsa-dmna-m、tp5-bsa-dmna-l在西藏猪皮上进行穿刺实验的致孔情况；

图3为实施例1～3和对比例1～3制备的胸腺五肽可溶性微针的ndp情况；

图4为对比例1制备的tp5-dmna-h的针尖溶于水后的tp5溶液与tp5水溶液、tp5和dex40的水溶液的圆二色谱图；

图5为实施例1～3中制备的胸腺五肽可溶性微针与胸腺五肽溶液用于免疫抑制大鼠后的脏器系数对照图；

图6为实施例1～3中制备的胸腺五肽可溶性微针与胸腺五肽溶液用于免疫抑制大鼠后sod活性和mda值变化图。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图进一步阐述本发明，但实施例仅是为了进一步详细叙述本说明，并不限制本发明的权利要求。

以下实施例中，如无特殊说明，原料均来源于市售。

实施例1胸腺五肽可溶性微针的制备

本实施例进行高剂量的胸腺五肽可溶性微针(tp5-bsa-dmna-h)的制备，其针尖形状为圆锥形，针尖的高度为800μm，针尖的底部为直径300μm的圆形，相邻两针尖的圆锥顶部之间的距离为900μm，基底为边长1cm的正方形。该可溶性微针的制备包括如下步骤：

1、针尖溶液的制备

精密称取可生物降解材料(dex40)0.2501g、bsa0.1000g、胸腺五肽原料药物0.1000g，加水1ml，搅拌溶解，得到均一的粘稠水溶液，即得针尖溶液。

2、基底溶液的制备

精密称取高分子聚合物(pvpk90)1.0002g，加入乙醇2.5ml，搅拌均匀后待其溶胀过夜，即得基底溶液。

3、可溶性微针含药针尖的制备

取步骤1中所得的针尖溶液适量加入到微针阴模中，置于离心机中在4℃的条件下以4000rpm的转速离心10min，使针尖溶液充满微针阴模的微孔道，随后将多余的针尖溶液刮走以回收。

4、可溶性微针空白基底的制备

在步骤3的基础上，加入适量步骤2所得的基底溶液于微针阴模上，置于离心机中在4℃的条件下以3000rpm的转速离心5min。

5、将制备好基底的微针置于干燥器中常温干燥24h，用镊子轻轻取下，即得tp5-bsa-dmna-h。

实施例2胸腺五肽可溶性微针的制备

本实施例进行中剂量的胸腺五肽可溶性微针(tp5-bsa-dmna-m)的制备，其针尖形状为圆锥形，针尖的高度为800μm，针尖的底部为直径300μm的圆形，相邻两针尖的圆锥顶部之间的距离为900μm，基底为边长1cm的正方形。该可溶性微针的制备包括如下步骤：

1、针尖溶液的制备

精密称取可生物降解材料(dex40)0.2501g、bsa0.1000g、胸腺五肽原料药物0.0500g，加水1ml，搅拌溶解，得到均一的粘稠水溶液，即得针尖溶液。

2、基底溶液的制备

精密称取高分子聚合物(pvpk90)1.0000g，加入乙醇2.5ml，搅拌均匀后待其溶胀过夜，即得基底溶液。

3、可溶性微针含药针尖的制备

取步骤1中所得的针尖溶液适量加入到微针阴模中，置于离心机中在4℃的条件下以4000rpm的转速离心10min，使针尖溶液充满微针阴模的微孔道，随后将多余的针尖溶液刮走以回收。

4、可溶性微针空白基底的制备

在步骤3的基础上，加入适量步骤2所得的基底溶液于微针阴模上，置于离心机中在4℃的条件下以3000rpm的转速离心5min。

5、将制备好基底的微针置于干燥器中常温干燥24h，用镊子轻轻取下，即得tp5-bsa-dmna-m。

实施例3胸腺五肽可溶性微针的制备

本实施例进行低剂量的胸腺五肽可溶性微针(tp5-bsa-dmna-l)的制备，其针尖形状为圆锥形，针尖的高度为800μm，针尖的底部为直径300μm的圆形，相邻两针尖的圆锥顶部之间的距离为900μm，基底为边长1cm的正方形。该可溶性微针的制备包括如下步骤：

1、针尖溶液的制备

精密称取可生物降解材料(dex40)0.2501g、bsa0.1000g、胸腺五肽原料药物0.0100g，加水1ml，搅拌溶解，得到均一的粘稠水溶液，即得针尖溶液。

2、基底溶液的制备

精密称取高分子聚合物(pvpk90)1.0001g，加入乙醇2.5ml，搅拌均匀后待其溶胀过夜，即得基底溶液。

3、可溶性微针含药针尖的制备

取步骤1中所得的针尖溶液适量加入到微针阴模中，置于离心机中在4℃的条件下以4000rpm的转速离心10min，使针尖溶液充满微针阴模的微孔道，随后将多余的针尖溶液刮走以回收。

4、可溶性微针空白基底的制备

在步骤3的基础上，加入适量步骤2所得的基底溶液于微针阴模上，置于离心机中在4℃的条件下以3000rpm的转速离心5min。

5、将制备好基底的微针置于干燥器中常温干燥24h，用镊子轻轻取下，即得tp5-bsa-dmna-m。

对比例1不含bsa的胸腺五肽可溶性微针的制备

本实施例进行不含bsa的高剂量的胸腺五肽可溶性微针(tp5-dmna-h)的制备，其针尖形状为圆锥形，针尖的高度为800μm，针尖的底部为直径300μm的圆形，相邻两针尖的圆锥顶部之间的距离为900μm，基底为边长1cm的正方形。该可溶性微针的制备包括如下步骤：

1、针尖溶液的制备

精密称取可生物降解材料(dex40)0.2501g、胸腺五肽原料药物0.1000g，加水1ml，搅拌溶解，得到均一的粘稠水溶液，即得针尖溶液。

2、基底溶液的制备

精密称取高分子聚合物(pvpk90)1.0000g，加入乙醇2.5ml，搅拌均匀后待其溶胀过夜，即得基底溶液。

3、可溶性微针含药针尖的制备

取步骤1中所得的针尖溶液适量加入到微针阴模中，置于离心机中在4℃的条件下以4000rpm的转速离心10min，使针尖溶液充满微针阴模的微孔道，随后将多余的针尖溶液刮走以回收。

4、可溶性微针空白基底的制备

在步骤3的基础上，加入适量步骤2所得的基底溶液于微针阴模上，置于离心机中在4℃的条件下以3000rpm的转速离心5min。

5、将制备好基底的微针置于干燥器中常温干燥24h，用镊子轻轻取下，即得tp5-dmna-h。

对比例2不含bsa的胸腺五肽可溶性微针的制备

本实施例进行不含bsa的中剂量的胸腺五肽可溶性微针(tp5-dmna-m)的制备，其针尖形状为圆锥形，针尖的高度为800μm，针尖的底部为直径300μm的圆形，相邻两针尖的圆锥顶部之间的距离为900μm，基底为边长1cm的正方形。该可溶性微针的制备包括如下步骤：

1、针尖溶液的制备

精密称取可生物降解材料(dex40)0.2501g、胸腺五肽原料药物0.0500g，加水1ml，搅拌溶解，得到均一的粘稠水溶液，即得针尖溶液。

2、基底溶液的制备

精密称取高分子聚合物(pvpk90)1.0000g，加入乙醇2.5ml，搅拌均匀后待其溶胀过夜，即得基底溶液。

3、可溶性微针含药针尖的制备

取步骤1中所得的针尖溶液适量加入到微针阴模中，置于离心机中在4℃的条件下以4000rpm的转速离心10min，使针尖溶液充满微针阴模的微孔道，随后将多余的针尖溶液刮走以回收。

4、可溶性微针空白基底的制备

在步骤3的基础上，加入适量步骤2所得的基底溶液于微针阴模上，置于离心机中在4℃的条件下以3000rpm的转速离心5min。

5、将制备好基底的微针置于干燥器中常温干燥24h，用镊子轻轻取下，即得tp5-dmna-h。

对比例3不含bsa的胸腺五肽可溶性微针的制备

本实施例进行不含bsa的低剂量的胸腺五肽可溶性微针(tp5-dmna-l)的制备，其针尖形状为圆锥形，针尖的高度为800μm，针尖的底部为直径300μm的圆形，相邻两针尖的圆锥顶部之间的距离为900μm，基底为边长1cm的正方形。该可溶性微针的制备包括如下步骤：

1、针尖溶液的制备

精密称取可生物降解材料(dex40)0.2501g、胸腺五肽原料药物0.0100g，加水1ml，搅拌溶解，得到均一的粘稠水溶液，即得针尖溶液。

2、基底溶液的制备

精密称取高分子聚合物(pvpk90)1.0000g，加入乙醇2.5ml，搅拌均匀后待其溶胀过夜，即得基底溶液。

3、可溶性微针含药针尖的制备

取步骤1中所得的针尖溶液适量加入到微针阴模中，置于离心机中在4℃的条件下以4000rpm的转速离心10min，使针尖溶液充满微针阴模的微孔道，随后将多余的针尖溶液刮走以回收。

4、可溶性微针空白基底的制备

在步骤3的基础上，加入适量步骤2所得的基底溶液于微针阴模上，置于离心机中在4℃的条件下以3000rpm的转速离心5min。

5、将制备好基底的微针置于干燥器中常温干燥24h，用镊子轻轻取下，即得tp5-dmna-l。

试验例1实施例1～3和对比例1～3的胸腺五肽可溶性微针的表征

采用扫描电镜对制备的可溶性微针(tp5-dmna)的表面形貌进行表征。方法如下：将该可溶性微针的单个针尖或整个微针阵列粘于导电胶一侧，导电胶另一侧黏在金属台板上，样品喷金涂膜后在扫描电镜下观察，操作电压为15kv，放大倍数为10～100倍。由图1(a-f)所见，两种不同处方辅料制备的tp5-dmna微针贴片的扫描电镜图尺寸、表面形态并没有明显的区别。tp5-bsa-dmna和tp5-dmna两种微针贴片在不同的剂量下，制备所得表面均光滑平整，单个微针为规整的圆锥形，针壁并没有出现空洞等现象，长度统一，形状外观均与阴模设计一致，从图1(g-h)所见整体微针排列规整，以正方形矩阵的方式均匀分布于基层，证明了无论处方辅料是否含有bsa，并不会改变辅料溶液完全填充阴模微针的能力与干燥后成型能力及形态。

采用西藏猪背部皮肤进行可溶性微针的皮肤穿刺实验。将冷冻保存的猪皮置于生理盐水中浸泡解冻30min，拭干，角质层向上平铺于平板上。利用双面胶将tp5-dmna-h固定到质构仪的探头上。穿刺实验测试时，控制探头以2mm/s的速度向平板移动，直到微针接触到角质层。当探头探测到压力为0.05n时，设定该压力为触发压力，改变探头移动的速度为0.5mm/s继续向下移动；当探头探测到压力为10n时，停止移动并维持30s。最后反方向移开探头，立即用0.4％台盼蓝溶液涂染西藏猪皮表面，10min之后用生理盐水冲刷表面，用棉球擦拭干净，观察皮肤表面的染色微孔并用电子相机拍摄图片。如图2所示，仅有tp5-bsa-dmna-h、tp5-bsa-dmna-m、tp5-bsa-dmna-l可以在西藏猪离体皮肤扎出明显的孔洞(参见图2中的d～f)，而tp5-dmna-h、tp5-dmna-m、tp5-dmna-l无法在皮肤上留下明显的孔洞(参见图2中的a～c)。bsa作为一种辅料而并非模型蛋白，其加入有效地提高了微针整体的机械强度，使微针可有效刺破角质层产生药物运输微孔道。

将干燥后的tp5-bsa-dmna-h、tp5-bsa-dmna-m、tp5-bsa-dmna-l、tp5-dmna-h、tp5-dmna-m、tp5-dmna-l微针贴片取出模具，用手术刀片小心割离针尖和基底，分别置于离心管，并分别用800μl去离子水溶解，每个实施例/对比例的样品平行三份，利用高效液相色谱法(hplc)进行针尖或基底中tp5浓度的测定。根据色谱图的峰面积计算tp5溶液浓度，以每片100根微针的数量计算每片贴片的针尖、基底载药量。以针尖药物分布率(needledrugloadingproportion,ndp)考察微针药物的分布情况，通过以下公式计算ndp：

其中，mn代表针尖中tp5的量，mb代表基底中tp5的含量。由图3可见，在高剂量的tp5的处方中，含bsa的tp5-dmna对比不含bsa的tp5-dmna有更高的ndp，bsa的加入可以一定程度上提高针尖中药物的载药量。

试验例2对比例1的胸腺五肽可溶性微针中药物的稳定性表征

利用圆二色谱对微针制剂中包裹的tp5的二级结构进行表征。由于本发明中实施例1所制备的微针贴片中用于增强针尖机械强度的针尖辅料bas为蛋白质，可能干扰多肽类药物tp5的色谱吸收，因此选用对比例1所制备的tp5-dmna-h考察制备过程对tp5的二级结构的影响。用手术刀片小心将对比例1中制备的tp5-dmna-h的针尖与基底分离，将针尖溶于去离子水中，制备得到微针中回收的tp5水溶液；取与微针载药量等量的tp5样品与等量微针针尖材料混合溶于去离子水中，得到tp5与dex40的物理混合溶液；取与微针载药量等量的tp5样品溶于去离子水中，得tp5水溶液。将以上三种溶液稀释到适当浓度，测定各个样品的圆二色谱。由图4可见，未经处理、与dex40辅料混合、微针溶解释放的三种tp5溶液的圆二色谱吸收峰与吸收强度高度一致，没有明显的差异。由于本发明中，基底采用乙醇作为溶剂，可有效地提高微针针尖部分的含药量，但乙醇的扩散可能会对针尖中的多肽或蛋白结构造成变性或不良影响，通过cd色谱图可证实乙醇作为基底溶剂并不会对tp5的结构造成影响，可以保证所载tp5的活性。

试验例3实施例1～3的胸腺五肽可溶性微针的大鼠体内药效学评价

实验方法：sd大鼠42只，spf级，雌性，体重180～220g，实验前未服用其它任何药物。参比制剂为胸腺五肽溶液，由购于成都凯捷生物科技有限公司的胸腺五肽溶于生理盐水制备而成。受试制剂为实施例1～3中制备的胸腺五肽可溶性微针。42只sd大鼠随机分为6组，分别命名为1～6组，每组7只，用于体内药效学研究。

实验开始前先建立免疫抑制模型。除第1组外，其余5组大鼠以35mg/(kg*d)的剂量腹腔注射免疫抑制剂环磷酰胺溶液，其注射用粉末购于江苏恒瑞医药股份有限公司，用生理盐水配制成1mg/ml的环磷酰胺溶液，连续注射三天，使大鼠免疫功能受到抑制。第1组作为空白对照组，腹腔注射生理盐水35ml/kg，连续注射三天。

模型建立成功后，进行药效学评价。第1组大鼠作为空白对照组、第2组大鼠作为阴性对照组，均接受尾静脉注射生理盐水1ml/kg，连续注射七天。第3组大鼠作为阳性对照组，尾静脉注射胸腺五肽溶液，胸腺五肽的剂量为100μg/kg；第4组大鼠在耳朵内侧皮肤使用实施例1中制备的tp5-bsa-dmna-h(tp5：850μg/kg)，第5组大鼠在耳朵内侧皮肤使用实施例2中制备的tp5-bsa-dmna-m(tp5：300μg/kg)，第6组大鼠在耳朵内侧皮肤使用实施例3中制备的tp5-bsa-dmna-l(tp5：100μg/kg)，连续给药7天。最后一次给药后24h，对每只大鼠进行称重，腹腔静脉取血500μl，收集于涂有肝素钠的1ml离心管中，立即进行流式细胞术与试剂盒检测。随后颈椎脱臼法处死6组大鼠，收集每只大鼠的胸腺与脾脏，称重，计算脏器系数。脏器系数(organindex)的计算公式如下：

其中wo为胸腺或脾脏的质量，w为大鼠的体重。如图5所示，阴性对照组(第2组)脾脏、胸腺系数均低于空白对照组(第1组)，可以确证免疫抑制模型建立成功。给药组(第3～6组)的脾脏与胸腺系数数值均高于模型组(阴性对照组)，对免疫抑制大鼠的脏器系数均有所提高，差异具有统计学意义(p<0.05)，验证了胸腺五肽可溶性微针药效与注射组相当。

1、流式细胞术的样品制备与检测：

取用肝素抗凝的全血100μl，加入cd3:fitc/cd4:rpe或者cd3:fitc/cd8:rpe荧光抗体10μl，涡旋振荡充分混匀，不能过于剧烈，在避光条件下室温孵育15分钟，然后向管中加入红细胞裂解液，涡旋充分混匀，再将离心管在37℃水浴中避光放置30min完全溶血后，以1000rpm的转速离心5min,弃去上清液，再用pbs两次洗涤，除去未结合的抗体，800rpm离心6min，弃去上清液，再用0.5mlpbs重悬细胞，上流式细胞仪。如表1所示，对比第1组，大鼠注射环磷酰胺后的第2组大鼠的t细胞表面抗原cd4+/cd8+的比值显著性下降(p<0.05)，从免疫指标证明了注射足够量的环磷酰胺可以建立免疫抑制模型。不同剂量的胸腺五肽可溶性微针(第4～6组)与胸腺五肽溶液(第3组)给药后，各组大鼠cd4+/cd8+的比值均有所改善，与第2组对比有显著性差异(p<0.05)，表明胸腺五肽可溶性微针有一定的免疫调节效果，可使cd4+/cd8+恢复正常。统计学分析表明，第3～6组之间没有显著差异，说明胸腺五肽可溶性微针贴片与静脉给药效果相当。

表1外周血t淋巴细胞亚群比例的变化(n＝7)

a:p<0.05vsgroup1；b:p<0.05vsgroup2.

2、丙二醛(maleicdialdehyde,mda)试剂盒检测：

(一)组成与配制：

(1)试剂一：液体20ml/1瓶，室温保存。

(2)试剂二：液体12ml/1瓶，用时每瓶加340ml双蒸水混匀，4℃保存。

(3)粉剂1支，用时将粉剂加入到90℃～100℃的热双蒸水60ml中(在溶解过程中适当加热)，充分溶解后用双蒸水补足至60ml再加冰醋酸60ml,混匀，配好的试剂避光保存。

(4)标准品：10nmol/ml四乙氨基丙烷5ml/1瓶，4℃保存。

(二)操作流程

表2mda测定操作步骤

按照表2所示，往试管中依次加入10nmol/ml标准品\无水乙醇或者测试样品、试剂一，摇动几下试管下确保混匀各加入的试剂，再加入指定剂量的试剂二和试剂三，用涡旋仪充分混匀后，用保鲜膜扎紧试管口，用针头刺破一小孔，在95℃中水浴(或用锅盖掀开煮沸)40min，取出后用流水冷却，随后3500～4000rpm/min离心10分钟，取上清液在532nm测定其吸光度，用蒸馏水调零，测定各试管的吸光度。

(三)血清中mda含量的计算公式

血清中mda含量＝(测定管吸光度-测定空白管吸光度)/(测定管吸光度-标准空白管吸光度)×标准品浓度(10nmol/ml)×样本测试前稀释倍数。结果如图6所示。

3、超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,sod)试剂盒检测

(一)组成与配制

(1)试剂一：贮备液，10ml/瓶(天冷或放置于冰箱中会有部分结晶产生，需热水浴溶解后使用)，试剂一应用液配制，用时每瓶10ml贮备液加蒸馏水稀释到100ml，4℃保存；

(2)试剂二：液体10ml/瓶，4℃保存；

(3)试剂三：液体10ml/瓶，4℃保存；

(4)试剂四：贮备液，50μl×2支，4℃保存；4号稀释液，10ml/瓶，4℃保存；

(5)试剂五：粉剂1支，用时加70℃热双蒸水75ml溶解后备用，若加热过程中水分蒸发，必须加蒸馏水补充至75ml，配好后避光4℃保存。

(6)试剂六：粉剂1支，用的时候加蒸馏水75ml溶解后备用，配好后避光4℃保存。

显色剂为按试剂五：试剂六：冰乙酸＝3:3:2的体积比配制，4℃保存。

(二)操作流程

表3sod酶活性测定操作步骤

按表3所示一次加入指定量的各试剂于离心管中，混匀后再加入显色剂充分混匀，室温放置10分钟，在波长550nm测定各试管的吸光度，蒸馏水调零，比色。

(三)血清中sod活力计算公式

sod活力(u/mgprot)＝(对照管吸光度-测定管吸光度)/对照管吸光度/50％×反应体系的稀释倍数×样本测试前倍数。结果如图6所示。

如图6所示，接受连续三天的环磷酰胺溶液腹腔注射的第2组大鼠血液sod活性下降，mda值显著性升高，几乎增大为正常组(第1组)水平的两倍。第3～6组大鼠接受连续七天不同剂型的tp5给药后，第3组大鼠的mda值和sod活性均恢复到正常水平(p<0.05)，不同剂量的微针贴片组与正常组(第1组)对比，sod活性和mda水平无显著性差异。sod酶活力与mda水平辅助性地证实了胸腺五肽可溶性微针给药途径的可靠性。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。