本公开涉及一种新型人松驰素类似物，包含其的药物组合物及其用途。
背景技术：
松弛素(Relaxin简称RLX)是一种多肽激素，其由哺乳动物的卵巢黄体分泌。松弛素在体内具有多种生理功能，包括松弛耻骨韧带、抑制子宫收缩、软化子宫颈、刺激乳腺发育、影响乳汁分泌。1926年，在研究妊娠期间骨盆带变化时，松弛素由FrederickHisaw首次发现。20世纪70至80年代，松弛素被认为是一种双链蛋白质。松弛素的结构与胰岛素相似。已经证实松弛素是肽类激素家族的成员之一。在人类当中，松弛素家族由7个基因所编码：RLN1、RLN2、RLN3(也作INSL7)、INSL3/RLF、INSL4/EPIL、INSL5/RIF2和INSL6/RIF1。人体循环中的大多数人类松弛素是基因RLN2编码的产物。RLN2的翻译产物是松弛素前体，该松弛素前体包括(从N端至C端)：24个氨基酸残基的信号肽序列、29个氨基酸残基的B链、104-107个氨基酸残基的连接序列，以及约24个氨基酸残基的A链。目前已明确，松弛素不仅在妊娠过程中发挥重要作用，而且对非妊娠动物的血管结构和功能也产生影响。松弛素具有广泛的生物学作用，包括在哺乳动物妊娠和机体老化过程中维持内环境的稳定、抗炎、心肌保护、扩张血管、促进伤口愈合，尤为重要的作用是抗纤维化。各种原因引起的心脏、肾脏病变最终均导致纤维化、结构改变、功能丧失的发生。因此，纤维化过程的有效抑制，是挽救脏器功能的重要措施。鉴于此，松弛素的抗纤维化作用可能成为未来抗纤维化治疗的有效措施。更为重要的是，松弛素可由心脏产生，并通过局部受体来保护心脏和调节细胞外基质。松弛素已成功地用于改善多种动物模型的心脏纤维化。因而，松弛素有望用于人类心脏纤维化性疾病的治疗(杜晓军，周娟，Baker心脏研究所)。现有技术中，在大肠杆菌中表达人松弛素(hRelaxin，野生型)前体；经过纯化后前体折叠复性；两步酶切(分别用CPB和胰蛋白酶)；再纯化得到有活性的产物松弛素。现有技术中的缺陷是：生产过程中需要蛋白复性、两步酶切和再纯化。繁多的步骤导致产量大大降低以及成本的提高，因为每一步都会涉及蛋白的损失。而且，外源酶(CPB、胰蛋白酶等)本身的成本高，酶的质量也会影响终产品的质量和产量。另一缺陷是，所表达的野生型松弛素活性低。这使得治疗剂量所需的重组蛋白的量增多，成本增加；而且所表达的野生型松弛素的低活性，给进一步开发蛋白修饰产品带来困难，因为修饰会损失蛋白的活性。针对现有技术的上述缺陷，通过对野生型松弛素的特定位点氨基酸改变，本公开进行了新型分子的设计，并发现了新型的人松弛素类似物，从而能非常好的解决上述问题。新的技术方案显示以下优点：1.松弛素特定位点的氨基酸改变，使所得的类似物能够在酵母细胞内完成正确的折叠，在这一过程中细胞自身的酶系统除去A和B链中的c-肽段。得到的完整有功能的活性分子被分泌到细胞外。通过一步纯化得到活性分子。省去现有技术所需的表达后复性、酶切、纯化等多个步骤。2.松弛素特定位点的氨基酸改变，使结构更加适应细胞内折叠、酶切和分泌，而且提高了生物学活性。这样可以减少单位剂量所需的重组蛋白质的量，从而降低成本。同时，因为活性提高，使得这样的类似物更加容易分子修饰物的开发。通过设计(松弛素序列中特定氨基酸的替换、缺失等)，本公开得到特定序列的人松驰素类似物。这种类似物能在真核表达系统(细胞)里完成松弛素前体的蛋白折叠、酶切；并且分泌到发酵液中时，本公开的人松驰素类似物是成熟的、完整、有功能的松弛素类似物。不仅如此，通过这些特定的设计所得到的松弛素类似物，其生物学活性比野生型松弛素高2倍以上。
技术实现要素：
本公开提供一种人松弛素类似物，其包含A链和B链，所述A链和B链的氨基酸序列分别如下式所示：A链：A1LYSALANKCCHVGCTKRSLARFC(24个氨基酸残基)B链：DSWMEEVIKLCGRB14LVRAQIAICGMSTWS(29个氨基酸残基)其中A1选自：Q、D、E和W；其中B14选自：E、D和N；任选地，B1和B2同时缺失；当A1为Q时，B14不为E或D。在本公开的一个实施方案中，提供一种如上所述的人松弛素类似物，其包含A链和B链，所述A链和B链的氨基酸序列分别如下式所示：A链：A1LYSALANKCCHVGCTKRSLARFC(24个氨基酸残基)B链：DSWMEEVIKLCGRB14LVRAQIAICGMSTWS(29个氨基酸残基)其中A1选自：Q、D、E和W；其中B14选自：E、D和N；当A1为Q时，B14不为E或D。在本公开一个实施方案中，所述的A1为D、E或W，优选为D。在本公开一个实施方案中，所述的A1为D，B14为D。具体地，实例为SEQIDNO：134(A链)和SEQIDNO：135(B链)，通过二硫键连接而形成的人松弛素类似物。在本公开一个实施方案中，所述的B14为D。在本公开一个实施方案中，一种如上所述的人松弛素类似物，其中所述的A链和B链的氨基酸序列选自如下组合：在本公开一个实施方案中，一种如上所述的人松弛素类似物，其中所述B链通过连接序列(本公开中简称L)与所述A链连接，所述连接序列的长度为1至15个氨基酸残基，优选为2至8个氨基酸残基，所述的连接序列的氨基酸序列选自：在本公开一个实施方案中，一种如上所述的人松弛素类似物，其中所述的人松弛素类似物的N端连接有信号肽序列(本公开中简称S)，所述信号肽序列的长度为4至15个氨基酸残基，优选6至11个氨基酸残基；更优选的，所述的信号肽序列的氨基酸序列选自：S1：EEGEPK，SEQIDNO：33，S2：EEGEPKR，SEQIDNO：34，和S3：MKKNIAFLLKRSEQIDNO：35。在本公开一个实施方案中，一种用于制备如上所述的人松弛素类似物的表达前体，表达前体的氨基酸序列选自SEQIDNO：1至SEQIDNO：26的一种或多种。表1.人松弛素类似物表达前体汇总本公开进一步提供一种人松弛素类似物的衍生物，其是如上所述的人松弛素类似物经PEG化修饰所得，换言之其中如上所述的人松弛素类似物被PEG分子所修饰。在一些实施方案中，所述的PEG分子的分子量为5-100KDa；在一些实施方案中，是10-80KDa；在一些实施方案中，15-45KDa；在一些实施方案中，20-40KDa；在一些实施方案中，所述的PEG分子为支链型或直链型。本公开进一步提供一种多核苷酸，其编码如上所述的人松弛素类似物的表达前体。多核苷酸选自DNA或RNA。技术人员理解，多核苷酸的互补序列也涵盖在本公开的范围内。本公开进一步提供一种含有如上所述多核苷酸的表达载体。本公开进一步提供一种转化有如上所述的表达载体的宿主细胞。在一些实施方案中，所述的宿主细胞为细菌，在一些具体实施方案中为大肠杆菌；在另一些实施方案中，宿主细胞为酵母菌，在一些具体实施方案中为毕赤酵母。本公开进一步提供一种药物组合物，其含有或由如下组成：a)一种或多种如上所述的人松弛素类似物、和/或一种或多种如上所述的人松弛素类似物衍生物，和b)一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。本公开进一步提供一种人松弛素类似物或其衍生物的可注射溶液，其含有溶解形式或可溶解形式的如上所述的药物组合物。应当理解，可注射溶液的干粉或冻干粉形式也涵盖在本公开的范围内。本公开进一步提供如上所述的人松弛素类似物、如上所述的人松弛素类似物衍生物、或如上所述的药物组合物、或如上所述的可注射溶液，在制备用于治疗或预防纤维化疾病或心血管疾病的药物中的用途，参见Cardiovasculareffectsofrelaxin；frombasicsciencetoclinicaltherapy，Nat.Rev.Cardiol.7，48-58(2010)；Relaxindecreasesrenalinterstitialfibrosisandslowsprogressionofrenaldisease，KindneyInternational，Vol.59(2001)，pp.876-882。本公开进一步提供一种治疗或预防纤维化疾病或心血管疾病的方法，该方法包括向所需的受试者施用治疗有效量的如上所述的人松弛素类似物或其衍生物，或如上所述的药物组合物。发明详述一、术语为了更容易理解本公开，以下具体定义了某些技术和科学术语。除非另有明确定义，否则本文使用的所有其它技术和科学术语都具有本公开所属领域的一般技术人员通常理解的含义。本公开所用氨基酸三字母代码和单字母代码如J.biol.chem，243，p3558(1968)中所述。当应用于动物、人、实验受试者、细胞、组织、器官或生物流体时，“给予”、“施用”、“治疗”和“处理”是指外源性药物、治疗剂、诊断剂或组合物与动物、人、受试者、细胞、组织、器官或生物流体的接触。“给予”、“施用”、“治疗”和“处理”可以指例如治疗、药物代谢动力学、诊断、研究和实验方法。细胞的处理包括试剂与细胞的接触，以及试剂与流体的接触，其中所述流体与细胞接触。“给予”、“施用”、“治疗”和“处理”还意指通过试剂、诊断、结合组合物或通过另一种细胞，在体外和离体处理细胞。当应用于人、兽医学或研究受试者时，“处理”是指治疗处理、预防或预防性措施、研究和诊断应用。“治疗”意指给予患者内用或外用治疗剂，诸如给予患者包含本公开的任一种结合化合物的组合物，所述患者具有一种或多种疾病症状，而已知所述治疗剂对这些症状具有治疗作用。通常，在受治疗患者或群体中以有效缓解一种或多种疾病症状的量给予治疗剂。所述的有效缓解的量包括无论是通过诱导这类症状退化还是抑制这类症状发展到任何临床右测量的程度。有效缓解任何具体疾病症状的治疗剂的量(也称作“治疗有效量”)可根据多种因素变化，例如患者的疾病状态、年龄和体重，以及药物在患者产生需要疗效的能力。通过医生或其它专业卫生保健人士通常用于评价该症状的严重性或进展状况的任何临床检测方法，可评价疾病症状是否已被减轻。尽管本公开的实施方案(例如治疗方法或制品)在缓解每个患者都有的目标疾病症状方面，可能效果不同，但是根据本领域已知的任何统计学检验方法，如Studentt检验、卡方检验、Mann和Whitney的U检验、Kruskal-Wallis检验(H检验)、Jonckheere-Terpstra检验和Wilcoxon检验，确定其在患者中应当统计学意义上显著减轻目标疾病症状。除非另有说明，否则在本公开中所述的松弛素或人松驰素为人松驰素RLN2，其包含具有生物活性的全长序列或部分序列。人松驰素包含A链和B链，两者之间通过二硫键结合。本公开中所用人松驰素的序列描述参见GenBank序列号：EAW58770。本公开中用于作为阳性对照的人松驰素800828为野生型。本公开中所述的人松驰素类似物前体按照从氨基端至羧基端的顺序包含：信号肽序列、B链或其突变体、连接序列、A链或其突变体。其中信号肽序列的长度是4-15个氨基酸残基，优选6-11个氨基酸残基；B链或其变体的长度是29个氨基酸残基；连接序列的长度是1-15个氨基酸残基，优选2-8个氨基酸残基；以及A链或其变体的长度是约24个氨基酸残基。本公开中所述的突变体指在序列上进行氨基酸的修饰、替换、置换或取代。本公开的B链优选的突变为在B链第14位(简称B14)上将E替换为D，且A链第1位(简称A1)Q替换为D。本公开的序列缩写中，Ln表示本公开中的某种连接序列(如L1至L6)，Sn表示本公开中的某种信号肽序列(如S1、S2、S3)；DA1表示在A链第1个氨基酸突变为D，DB14表示在B链第14个氨基酸突变为D，DelB1，B2表示B链第1和2个氨基酸缺失；A(wt)，表示野生型无突变的A链，B(wt)，表示野生型无突变的B链。“保守修饰”或“保守置换或取代”是指：蛋白中的氨基酸残基被具有类似特征(例如电荷、侧链大小、疏水性/亲水性、主链构象和刚性等)的其它氨基酸残基所置换；即使蛋白中的这种氨基酸残基被频繁改变，也不改变蛋白的生物学活性。本领域技术人员知晓，一般而言，多肽的非必需区域中的单个氨基酸置换不改变生物学活性(参见例如Watson等(1987)MolecularBiologyoftheGene，TheBenjamin/CummingsPub.Co.，第224页，第4版)。另外，结构或功能类似的氨基酸残基的置换不大可能破环生物学活性。“有效量”包含足以改善或预防医学病症的症状或病症的量。有效量还意指足以允许或促进诊断的量。用于特定患者或兽医学受试者的有效量可依据以下因素而变化：如待治疗的病症、患者的总体健康情况、给药的方法、途径、和剂量、以及副作用严重性。有效量可以是避免显著副作用或毒性作用的最大剂量或给药方案。“外源性”指来源在生物、细胞或人体外产生的物质。“内源性”来源在细胞、生物或人体内产生的物质。本文使用的表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用，并且所有这类名称都包括后代。因此，表述“转化体”和“转化细胞”包括原代受试细胞和由其衍生的培养物，而不考虑转移数目。还应当理解的是，由于故意或非有意的突变，所有后代在DNA含量方面不可能精确相同。以上表述还包括与最初转化细胞具有相同功能或生物学活性的突变后代。在意指不同名称的情况下，其由上下文清楚可见。本文使用的“聚合酶链式反应”或“PCR”是指，例如美国专利号4,683,195中所述扩增的程序或技术。一般来说，需要获得来自目标区域末端或之外的序列信息，从而能够设计寡核苷酸引物；这些引物的序列与待扩增模板的对应链相同或相似。2个引物的5’末端核苷酸可以与待扩增材料的末端一致。PCR可用于扩增特定的RNA序列、来自总基因组DNA的特定DNA序列、以及由总细胞RNA转录而来的cDNA、噬菌体或质粒序列等。一般，参见Mullis等(1987)ColdSpringHarborSymp.Ouant.Biol.51：263；Erlich编辑，(1989)PCRTECHNOLOGY(StocktonPress，N.Y.)。本文使用的PCR被视为用于扩增核酸测试样品的核酸聚合酶反应法的一个实例，但不是唯一的实例；所述方法包括使用作为引物的已知核酸和核酸聚合酶，以扩增或产生核酸的特定部分。“任选”或“任选地”意味着随后所描述的事件或环境可以但不必发生。“药物组合物”表示含有一种或多种本文所述类似物或前体以及其他化学组分的混合物，其中其他组分例如生理学/可药用的载体和赋形剂。其他化学组分的目的是促进对生物体的给药，利于活性成分的吸收进而发挥生物活性。本公开中所述的用转化宿主细胞的步骤可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。获得的转化体可以用常规方法培养，其表达本公开的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。从表达前体产物中释放所述人松弛素类似物的化学和/或酶方法可用本领域技术人员熟知的常规技术进行，比如胰蛋白酶、羧肽酶B、赖氨酸内肽酶C等。具体实施方式实施例1、重组人松弛素800800的分子克隆和表达1、重组人松弛素800800表达载体的构建经过密码子优化的人松弛素800800的DNA序列通过OverlapPCR方法合成。由Invitrogen公司合成6条单链DNA片段作为合成引物，序列如下：800-引物1CTCGAGGATTCTTGGATGGAAGAAGTTATTAAGTSEQIDNO：36800-引物2CAATTTGAGCTCTAACCAATTCTCTACCACACAACTTAATAACTTCTTCCATCCAAGAASEQIDNO：37800-引物3AGAGAATTGGTTAGAGCTCAAATTGCTATTTGTGGTATGTCTACTTGGTCTAAGAGACASEQIDNO：38800-引物4ATGACAACACTTGTTAGCCAAAGCAGAGTACAATTGTCTCTTAGACCAAGTAGACATACSEQIDNO：39800-引物5CTTTGGCTAACAAGTGTTGTCATGTTGGTTGTACTAAGAGATCTTTGGCTAGATTTTGTSEQIDNO：40800-引物6GAATTCTTAACAAAATCTAGCCAAAGATCTCTTASEQIDNO：41松弛素的合成采用KODplus试剂盒(TOYOBO，Cat.KOD-201)，采用两步PCR完成。第一步PCR，25μL反应体系：2.5μL10×KOD缓冲液，2.5μL2mMdNTPs，引物1，2，3，4，5，6(10μM)各1μL，0.5μLKODplus，1μL25mMMgSO4，12.5μLddH2O。反应程序为94℃5分钟；94℃30秒钟，60℃30秒钟，68℃30秒钟，扩增30个循环后；再68℃30分钟以结束PCR扩增程序。第二步PCR，25μL反应体系：2.5μL10×KODbuffer，2.5μL2mMdNTPs，引物1和6(10μM)各1μL，1μL第一轮PCR产物，0.5μLKODplus，1μL25mMMgSO4，15.5uLddH2O。反应程序为94℃5分钟；94℃30秒钟，68℃60秒钟，扩增30个循环后；再68℃10分钟以结束PCR扩增程序。将PCR合成的DNA序列和pPIC9K表达载体(Invitrogen，Cat.K1750-01)分别进行EcoRI/XhoI(NewEnglandBiolabs，Cat.R0101S/R0146V)双酶切，得到的目的片段经1.2％琼脂糖凝胶回收，用T4DNA连接酶(NewEnglandBiolabs，Cat.M0202V)连接，转化DH5α感受态细胞(天根生化，Cat.CB101-02)，挑选阳性克隆由Invitrogen公司作测序分析。800前体DNA序列如下：GATTCTTGGATGGAAGAAGTTATTAAGTTGTGTGGTAGAGAATTGGTTAGAGCTCAAATTGCTATTTGTGGTATGTCTACTTGGTCTAAGAGACAATTGTACTCTGCTTTGGCTAACAAGTGTTGTCATGTTGGTTGTACTAAGAGATCTTTGGCTAGATTTTGTTAASEQIDNO：42上述DNA序列编码氨基酸序列如下：DSWMEEVIKLCGRELVRAQIAICGMSTWSKRQLYSALANKCCHVGCTKRSLARFCSEQIDNO：1。2、重组人松弛素800800表达载体的转化将5-10μg的上述步骤中得到的松弛素800800表达载体用SalI(Takata，Cat.D1080a)进行线性化。再加入1/10体积的3M醋酸钠，2倍体积的无水乙醇，充分混合后，放置于-20℃，2hr。混合物高速离心(13,000rpm)5min，去处上清，用75％乙醇清洗沉淀2次，将沉淀倒置晾干后，用10μLddH2O溶解。将线性化的质粒与80μL电转化感受态细胞(毕赤酵母GS115，Invitrogen，Cat.K1750-01)混合转入电转杯(BioRad，Cat.1652086)中，并置冰浴5min。将电转仪(BioRadMicropulser)参数设至2kV，25Ω，200uF，进行电转化。结束后迅速加入1ml冰浴的D-山梨醇(生工生物工程有限公司)混合，将100-300μl混合物涂布于MD培养板上，30℃培养3d至形成菌落。3、重组人松弛素800800表达克隆的G418筛选用3mlYPD培养基洗脱MD培养板上的菌落，重悬，并用分光光度计(Beckman，DU800)测定重悬的细胞浓度(1OD600＝5×107cell/ml)。将1×105细胞涂在4mg/ml浓度G418(GIBCO，Cat.11811-031)的YPD培养板上，30℃培养5d至形成菌落。4、重组人松弛素800800的诱导表达从YPD培养板上挑取单菌落置于4mLBMGY培养基，30℃，250rpm培养过夜。第二天检测OD600值，应处于2-6之间。离心机(BeckmanCoulter)室温低速(1,500g)离心5min收集细胞，并用BMMY培养基重悬至OD600为1.0。在培养基中加入1/200总体积的100％甲醇(终浓度为0.5％)，并于28℃，250rpm培养72hr，其中每24hr补加1/200总体积的100％甲醇。诱导结束后，离心机低速(1,500g)离心并收集上清。SDS-PAGE(Invitrogen，Cat.No.456-1083)电泳检测蛋白表达，挑选表达较好克隆进行下一步发酵。得到的重组人松弛素800800序列(WT，野生型)如下：B链(WT)DSWMEEVIKLCGRELVRAQIAICGMSTWSSEQIDNO：134A链(WT)QLYSALANKCCHVGCTKRSLARFCSEQIDNO：135。实施例2、重组人松弛素800801的分子克隆和表达1、重组人松弛素800801表达载体的构建松弛素800801用PCR的方法进行定点突变完成，由Invitrogen公司合成2条单链DNA片段作为定点突变引物，序列如下：801-引物1GTATGTCTACTTGGTCTAAGAGATCTTTGAAGAGACAATTGTACTCSEQIDNO：43801-引物2GAGTACAATTGTCTCTTCAAAGATCTCTTAGACCAAGTAGACATACSEQIDNO：44PCR定点突变以松弛素800800载体为模板，采用KODplus试剂盒(TOYOBO，Cat.KOD-201)25μL反应体系：2.5μL10×KOD缓冲液，2.5μL2mMdNTPs，引物1，2(10μM)各1μL，0.5μLKODplus，1μL25mMMgSO4，16.5μLddH2O。反应程序为94℃5分钟，94℃30秒钟，60℃30秒钟，68℃12分钟，扩增30个循环后，再68℃12分钟以结束PCR扩增程序。在PCR产物中直接加入内切酶DpnI(NEBCat.R0176L)1μL消化5小时后，转化DH5α感受态细胞(天根生化，Cat.CB101-02)，挑选阳性克隆由Invitrogen公司作测序分析。801前体DNA序列如下：GATTCTTGGATGGAAGAAGTTATTAAGTTGTGTGGTAGAGAATTGGTTAGAGCTCAAATTGCTATTTGTGGTATGTCTACTTGGTCTAAGAGATCTTTGAAGAGACAATTGTACTCTGCTTTGGCTAACAAGTGTTGTCATGTTGGTTGTACTAAGAGATCTTTGGCTAGATTTTGTTAASEQIDNO：45上述DNA序列编码氨基酸序列如下：DSWMEEVIKLCGRELVRAQIAICGMSTWSKRSLKRQLYSALANKCCHVGCTKRSLARFCSEQIDNO：22、重组人松弛素800801的转化、筛选、诱导表达重组人松弛素800801的转化、筛选、诱导表达同实施例1。得到的重组人松弛素800801序列(WT，野生型)如下：B链(WT)DSWMEEVIKLCGRELVRAQIAICGMSTWSSEQIDNO：134A链(WT)QLYSALANKCCHVGCTKRSLARFCSEQIDNO：135。实施例3、重组人松弛素800802的分子克隆和表达1、重组人松弛素800802表达载体的构建松弛素800802用PCR的方法进行定点突变完成，由Invitrogen公司合成2条单链DNA片段作为定点突变引物，序列如下：802-引物1GTCTACTTGGTCTAAGAGAAAGCCAACTGGTTACGGTTCTAGAAAGAAGAGACAATTGTACTCTGCSEQIDNO：46802-引物2GCAGAGTACAATTGTCTCTTCTTTCTAGAACCGTAACCAGTTGGCTTTCTCTTAGACCAAGTAGACSEQIDNO：47PCR定点突变以松弛素800801载体为模板，采用KODplus试剂盒(TOYOBO，Cat.KOD-201)25μL反应体系：2.5μL10×KODbuffer，2.5μL2mMdNTPs，引物1，2(10μM)各1μL，0.5μLKODplus，1μL25mMMgSO4，16.5μLddH2O。反应程序为94℃5分钟，94℃30秒钟，60℃30秒钟，68℃12分钟，扩增30个循环后，再68℃12分钟以结束PCR扩增程序。在PCR产物中直接加入内切酶DpnI(NEBCat.R0176L)1μL消化5小时后，转化DH5α感受态细胞(天根生化，Cat.CB101-02)，挑选阳性克隆由Invitrogen公司作测序分析。802前体DNA序列如下：GATTCTTGGATGGAAGAAGTTATTAAGTTGTGTGGTAGAGAATTGGTTAGAGCTCAAATTGCTATTTGTGGTATGTCTACTTGGTCTAAGAGAAAGCCAACTGGTTACGGTTCTAGAAAGAAGAGACAATTGTACTCTGCTTTGGCTAACAAGTGTTGTCATGTTGGTTGTACTAAGAGATCTTTGGCTAGATTTTGTTAASEQIDNO：48上述DNA序列编码氨基酸序列如下：DSWMEEVIKLCGRELVRAQIAICGMSTWSKRKPTGYGSRKKRQLYSALANKCCHVGCTKRSLARFCSEQIDNO：3。2、重组人松弛素800802的转化、筛选、诱导表达重组人松弛素800802的转化、筛选、诱导表达同实施例1。得到的重组人松弛素800802序列(WT，野生型)如下：B链(WT)DSWMEEVIKLCGRELVRAQIAICGMSTWSSEQIDNO：134A链(WT)QLYSALANKCCHVGCTKRSLARFCSEQIDNO：135。实施例4、重组人松弛素800802-1的分子克隆和表达1、重组人松弛素800802-1表达载体的构建松弛素800802-1用PCR的方法进行定点突变完成，由Invitrogen公司合成4条单链DNA片段作为定点突变引物，序列如下：802-1-引物1GTTATTAAGTTGTGTGGTAGAGATTTGGTTAGAGCTCAAATTGSEQIDNO：49802-1-引物2CAATTTGAGCTCTAACCAAATCTCTACCACACAACTTAATAACSEQIDNO：50802-1-引物3GTTCTAGAAAGAAGAGAGATTTGTACTCTGCTTTGGSEQIDNO：51802-1-引物4CCAAAGCAGAGTACAAATCTCTCTTCTTTCTAGAACSEQIDNO：52PCR定点突变以松弛素800802载体为模板，突变过程同实施例2。800802-1前体DNA序列如下：GATTCTTGGATGGAAGAAGTTATTAAGTTGTGTGGTAGAGATTTGGTTAGAGCTCAAATTGCTATTTGTGGTATGTCTACTTGGTCTAAGAGAAAGCCAACTGGTTACGGTTCTAGAAAGAAGAGAGATTTGTACTCTGCTTTGGCTAACAAGTGTTGTCATGTTGGTTGTACTAAGAGATCTTTGGCTAGATTTTGTTAASEQIDNO：53上述DNA序列编码氨基酸序列如下：DSWMEEVIKLCGRDLVRAQIAICGMSTWSKRKPTGYGSRKKRDLYSALANKCCHVGCTKRSLARFCSEQIDNO：4。2、重组人松弛素800802-1的转化、筛选、诱导表达重组人松弛素800802-1的转化、筛选、诱导表达同实施例1。得到的重组人松弛素类似物800802-1序列如下：B链(DB14)DSWMEEVIKLCGRDLVRAQIAICGMSTWSSEQIDNO：137A链(DA1)DLYSALANKCCHVGCTKRSLARFCSEQIDNO：138。实施例5、重组人松弛素800803的分子克隆和表达1、重组人松弛素800803表达载体的构建松弛素800803用PCR的方法进行定点突变完成，由Invitrogen公司合成2条单链DNA片段作为定点突变引物，序列如下：803-引物1GTCTACTTGGTCTAAGAGAAAGCCAACTGGTTACGGTTCTAGAAAGAGACAATTGTACTCTGCSEQIDNO：54803-引物2GCAGAGTACAATTGTCTCTTTCTAGAACCGTAACCAGTTGGCTTTCTCTTAGACCAAGTAGACSEQIDNO：55PCR定点突变以松弛素800801载体为模板，突变过程同实施例2。800803前体DNA序列如下：GATTCTTGGATGGAAGAAGTTATTAAGTTGTGTGGTAGAGAATTGGTTAGAGCTCAAATTGCTATTTGTGGTATGTCTACTTGGTCTAAGAGAAAGCCAACTGGTTACGGTTCTAGAAAGAGACAATTGTACTCTGCTTTGGCTAACAAGTGTTGTCATGTTGGTTGTACTAAGAGATCTTTGGCTAGATTTTGTTAASEQIDNO：56上述DNA序列编码氨基酸序列如下：DSWMEEVIKLCGRELVRAQIAICGMSTWSKRKPTGYGSRKRQLYSALANKCCHVGCTKRSLARFCSEQIDNO：5。2、重组人松弛素800803的转化、筛选、诱导表达重组人松弛素800803的转化、筛选、诱导表达同实施例1。得到的重组人松弛素800803序列(WT，野生型)如下：B链(WT)DSWMEEVIKLCGRELVRAQIAICGMSTWSSEQIDNO：134A链(WT)QLYSALANKCCHVGCTKRSLARFCSEQIDNO：135。实施例6、重组人松弛素800803-1的分子克隆和表达1、重组人松弛素80...