一种制备育性减低植物的方法与流程

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种制备育性减低植物的方法。

背景技术：
植物雄性不育是一个与农业生产密切相关的植物学性状，是植物在发育过程中基因型表达与环境相互作用的结果。植株本身的雄性不育就可以在免去人工去雄的情况下作为遗传工具用于开发利用作物杂种优势，进行轮回选择，回交等育种研究。利用植物的雄性不育性培育各种雄性不育系，再借助遗传工程大量生产杂交种子，从而使许多作物特别是自花传粉作物的杂种优势得以在生产上利用，为大规模生产杂交种子提供了可能性。水稻是我国重要的粮食作物，水稻杂种优势和杂交育种方式的发现与常规育种相比增产20％以上，给水稻生产带来了巨大的贡献，在发现环境敏感的核不育水稻材料后，袁隆平院士又提出了两系选育法，使得水稻杂交育种策略更加简便，各方面的品质也得到了提高，产量又能提高5-10％。农垦58S是最早发现的光周期调节育型的雄性不育材料，它和它转育的粳稻和籼稻光敏不育系在一定温度范围可被长日照诱导不育，短日照诱导可育。由于同时又受到温度的影响，它们又被称为光温敏不育系。人们通过基因定位发现一个非编码的前体RNA调节了光温敏不育。但夏季异常低温(＜23度)会使得制种失败，因此光温敏不育材料的应用受到了一定的影响。植物生长发育除了收到光照和温度的影响外，湿度也是一个重要的环境因素，虽然湿度和水稻雄性不育的关系国内外都没有任何报道。但早在1993年拟南芥的研究中人们早就发现一类湿度相关的雄性不育的突变体pop1，它是由于突变体花粉表面含油层(tryphine)缺少长链脂肪酸和蜡质而使得花粉不能从柱头上吸水，从而导致授粉失败和不育(但突变体从相对环境湿度70％的环境移入相对湿度为90％的高湿箱，育性得到了恢复Preussetal.，GeneDev.19937：947-985)。发明公开本发明的一个目的是提供一种RNA干扰载体。本发明提供的RNA干扰载体，为将序列表中的序列1所示的DNA分子插入pH7GWIWG2(II)中得到的载体。上述RNA干扰载体为将序列表中的序列1所示的DNA分子通过同源重组插入pH7GWIWG2(II)中得到的载体；具体为将序列表中的序列1所示的DNA分子通过同源重组正向插入和反向插入pH7GWIWG2(II)中得到的载体。上述RNA干扰载体按照如下方法制备：1)将序列表中序列1所示的DNA分子与pDONR221载体进行BP反应，得到中间载体；2)将所述中间载体与pH7GWIWG2(II)载体进行LR反应，得到RNA干扰载体。上述序列表中序列1所示的DNA分子具体通过如下方法制备：以水稻的cDNA为模板，用引物对A进行PCR扩增，得到PCR产物即为序列表中序列1所示的DNA分子。所述引物对A由序列表中序列3所示的单链DNA和序列4组成的单链DNA组成。含有上述的RNA干扰载体的重组菌或转基因细胞系也是本发明保护的范围。上述的RNA干扰载体、上述的重组菌或转基因细胞系在培育水稻不育系或降低水稻育性的应用也是本发明保护的范围。本发明的第二个目的是提供一种培育转基因植物的方法。本发明提供的方法，为将上述的RNA干扰载体导入目的植物，得到转基因植物；所述转基因植物为如下1)或2)：1)不育转基因植物或2)所述转基因植物的育性低于所述目的植物；所述目的植物具体为单子叶植物；所述单子叶植物进一步具体为水稻。由上述的方法得到的转基因植物也是本发明保护的范围；所述转基因植物为不育转基因植物或育性减低的转基因植物；所述植物具体为单子叶植物；所述单子叶植物进一步具体为水稻。上述育性减低的转基因植物为转基因植物的育性低于目的植物的转基因植物。本发明的第三个目的是提供一种将目的植物培育为不育突变体或育性降低突变体的方法。本发明提供的方法，包括如下步骤：1)诱变目的植物种子和设计用于特异扩增目的植物中的三萜合酶编码基因的引物对B及标记荧光标记物的引物对B；所述诱变目的植物种子为用叠氮化钠诱变多粒目的植物种子，得到诱变种子；所述设计用于特异扩增目的植物中的三萜合酶编码基因的引物对B为根据所述目的植物中的三萜合酶编码基因设计用于特异扩增的引物对B，所述标记荧光标记物的引物对B中的每条引物标记不同荧光标记物，所述不同荧光标记物的波长不同；2)将所述诱变种子培养，得到第一代突变M1代群体；将所述第一代突变M1代群体自交，得到第二代突变M2代群体；3)提取第二代突变M2代群体中单株的基因组DNA；将n个M2代单株的基因组DNA混合得到一个DNA池；n为2-8；4)以每个所述DNA池为模板，用所述引物对B和所述标记荧光标记物的引物对B共同作为引物进行扩增，得到PCR产物；5)将所述PCR产物经核酸内切酶CELI酶切，得到DNA池对应酶切产物；6)电泳检测每一个所述DNA池对应酶切产物，若所述DNA池对应酶切产物在不同荧光标记物对应的波长下均产生亮点，则所述DNA池对应的n个M2代单株中有或候选有育性降低突变体或者不育突变体；若所述DNA池对应酶切产物在不同荧光标记物对应的波长下没有均产生亮点，则所述DNA池对应的n个M2代单株中没有或候选没有育性降低突变体或者不育突变体；所述育性降低突变体为育性低于所述目的植物的植株。上述方法中，在所述步骤6)后还包括如下步骤：将有或候选有育性降低突变体或者不育突变体的n个M2代M2代单株的基因组DNA分别与所述目的植物的基因组DNA混合作为模板，重复步骤4)-5)，得到M2代单株对应的酶切产物；电泳检测每一个所述M2代单株M2代单株对应的酶切产物，若所述M2代单株对应的酶切产物在不同荧光标记物对应波长下均产生亮点，则所述M2代单株为或候选为不育突变体或育性降低突变体；若所述M2代单株对应的酶切产物在不同荧光标记物对应波长下没有均产生亮点，则所述M2代单株不为或候选不为不育突变体或育性降低突变体。上述方法中，步骤1)中，所述叠氮化钠诱变多粒目的植物种子为将所述多粒目的植物种子浸泡在浓度为2mM的叠氮化钠水溶液中6h；室温浸泡即可。所述三萜合酶的氨基酸序列为序列表中的序列2；所述不同荧光标记物为波长为682nm的荧光标记物DY-682和波长为782nm的荧光标记物DY-782；所述三萜合酶编码基因的核苷酸序列具体为序列表中的序列5；所述引物对B为如下1)-3)中的任意一种：1)由序列表中序列6所示的单链DNA分子和序列表中序列7所示的单链DNA分子组成；2)由序列表中序列8所示的单链DNA分子和序列表中序列9所示的单链DNA分子组成；3)由序列表中序列10所示的单链DNA分子和序列表中序列11所示的单链DNA分子组成；所述目的植物为单子叶植物；所述单子叶植物为单子叶禾本科植物；所述单子叶禾本科植物具体为水稻。上述育性降低突变体为育性低于目的植物的突变体，在具体实施例中，目的植物具体为水稻，育性降低突变体具体为育性低于水稻的突变体。由上述的方法制备的不育突变体或育性降低突变体也是本发明保护的范围。上述育性降低突变体，其保藏号为CGMCCNO.6150。上述的转基因植物或上述的不育突变体或育性降低突变体在杂交制种中的应用也是本发明保护的范围。上述育性降低突变体为育性低于目的植物的突变体，所述目的植物为单子叶植物；所述单子叶植物为单子叶禾本科植物；所述单子叶禾本科植物具体为水稻；在具体实施例中，育性降低突变体具体为育性低于水稻的突变体。本发明的第四个目的是提供一种获得不育突变体或育性降低突变体的方法。本发明提供的方法，为沉默或失活目的植物中的三萜合酶编码基因，得到不育突变体或育性降低突变体；所述育性降低突变体为育性低于所述目的植物的植株。上述方法中，所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物；所述单子叶植物具体为单子叶禾本科植物；所述单子叶禾本科植物为水稻、小麦、大麦、高粱或玉米；所述水稻的三萜合酶的氨基酸序列为序列表中的序列2；所述水稻的三萜合酶编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列5；所述小麦的三萜合酶的氨基酸序列为序列表中的序列15；所述小麦的三萜合酶编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列14；所述大麦的三萜合酶的氨基酸序列为序列表中的序列17；所述大麦的三萜合酶编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列16；所述高粱的三萜合酶的氨基酸序列为序列表中的序列18；所述高粱的三萜合酶编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列19；所述玉米的三萜合酶的氨基酸序列为序列表中的序列20；所述玉米的三萜合酶编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列21。上述沉默或失活目的植物中的三萜合酶编码基因的方式具体可以采用RNA干扰目的植物中三萜合酶编码基因表达或点突变目的植物中三萜合酶编码基因；上述方法中，所述沉默或失活水稻中的三萜合酶编码基因为如下1)-3)中至少一种：1)将所述水稻中的三萜合酶编码基因的第764核苷酸残基G突变为A；2)将所述水稻中的三萜合酶编码基因的第809核苷酸残基G突变为A；3)将所述水稻中的三萜合酶编码基因的第1431核苷酸残基G突变为A。本发明的第五个目的是提供一种恢复或提高出发植物育性的方法。本发明提供的方法，包括如下步骤：在出发植物的开花期，保持植物花序生长湿度为80-100％；所述出发植物为不育突变体或育性降低突变体。上述方法中，所述不育突变体或育性降低突变体为上述的转基因植物或上述的不育突变体或育性降低突变体。上述方法中，所述保持植物花序生长湿度的时间为1周；所述保持植物花序生长湿度的方法为将所述出发植物的整个花序包裹；所述包裹具体采用塑料袋套在整个花序上或保鲜膜覆盖整个花序。上述筛选的育性降低突变体P34E8为OsOSC8突变株(即为突变体S6)，已于2012年05月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为CGMCCNo.6150，分类命名为水稻Oryzasativa。除非特别指出或是单独定义，本文所使用的科学和技术术语具有本发明所属领域技术人员共知的、无歧义的相同含义。另外，本文所述的材料、方法以及实施案例本意在于说明和阐述而非限制或限定。附图说明图1为RNAi株系蛋白的westernblot检测结果图2为RNAi株系的自然结实率和保湿处理后结实率统计结果图3为检测到的突变体的电泳图图4为野生型(WT)和突变体(P34E8)的花序(A、B)、小花(C、D，bars＝0.5cm)、碘-碘化钾染色(E、F，bars＝100μm)和Alexander染色(G、H，bars＝100μm)图5为野生型(WT)和突变体(P34E8)花粉在培养液中的萌发情况，bars＝100μm图6为不同时间野生型(WT)和突变体(P34E8)花粉在柱头上的粘附、萌发情况，bars＝100μm图7为野生型(WT)和突变体(P34E8)正反交后花粉在柱头上的粘附、萌发情况，bars＝100μm图8为野生型(WT)、突变体(P34E8)及保湿处理后纯合突变体花序结实情况，bars＝2cm图9为大麦和小麦中同源基因的片段的扩增图10为禾本科作物中OsOSC8的同源蛋白序列的比对和可能有效的突变位点实施发明的最佳方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中的定量试验均重复三次，结果取平均值或平均值±标准差。水稻中三萜合酶OsOSC8蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2；编码该蛋白的基因的核苷酸序列为序列表中的序列5。实施例1、RNA干扰制备育性降低的转基因水稻一、OsOSC8的RNA干扰载体的获得1、Gateway中间载体pDONR221/osc8-1的获得根据OsOSC8的基因序列涉及引物如下：引物对采用invitrogen公司gateway技术，在正义链引物5’端加入attB1序列，反义链引物5’端加入attB2序列。引物对1：sense：5′-AAAAAGCAGGCTGGCTGCACGGATAGAGTT-3′(序列3)antisense：5′-AGAAAGCTGGGTGCCTGTATGGCTGAGAAA-3′(序列4)提取水稻中花11(OrazysativaL.sspjaponica；记载在Zhong-HaiRenetal.，2005，Aricequantitativetraitlocusforsalttoleranceencodesasodiumtransporter.NatureGenetics37，1141-1146；公众可从中国科学院植物研究所获得)总RNA，反转录得到cDNA。以上述得到的cDNA为模板，用引物对1进行PCR扩增，得到大小为200bp左右的片段1；经过测序，片段1的核苷酸序列为序列表中的序列1；引物对1各2pmol，PCRMix(GenestarA112-01)10ul，cDNA2ul，加水至20ul，PCR程序94℃3分钟，30次循环(94℃30秒，55℃30秒，72℃30秒)，72℃，10分钟。将得到的片段1等摩尔与pDONR221载体(invitrogen12535-037)混合，在25度下保温1小时，即进行BP反应(invitrogen11789-020)生成入门载体，热击转化大肠杆菌DH5α，涂布在饱含50mg/L卡那霉素的LB平板上，培养过夜得到转化子(简单原理：由于原质粒pDONR221包含一段致死基因ccdB，其转化子不能成活，只有将ccdB基因替换为外源片段的菌落才能生长)。BP反应程序：25℃孵育1h后，加入1μl蛋白酶K，混匀后37℃孵育10min。将转化子进行菌落PCR，用引物对1进行PCR扩增，将能够得到200bpPCR产物条带的单菌落保存为阳性克隆。取阳性克隆的质粒，送去测序，结果为阳性克隆的质粒为将序列表中的序列1插入pDONR221载体中得到的载体，命名为pDONR/osc8-1。2、Gateway终端载体pH7GWIWGII-osc8-1的获得(即OsOSC8RNAi干扰载体)将上述1得到的载体pDONR/osc8-1与pH7GWIWG2(II)(Dammeetal.，SomaticCytokinesisandPollenMaturationinArabidopsisDependonTPLATE，WhichHasDomainsSimilartoCoatProteins.plantcell，2006，18：3502-3518，公众可从中国科学院植物研究所获得)进行等摩尔混合，在25度保温1小时，即进行LR反应(invitrigen11791-020)，混合物热击转化大肠杆菌DH5α，涂布到含有100mg/L的壮观霉素平板上，37度培养过夜，分别得到转化子(原理同BP反应)。LR反应程序：25℃孵育1h后，加入2μl蛋白酶K，混匀后37℃孵育10min。提取转化子中单个菌落的质粒，送去测序，结果为转化子单克隆中包含的质粒命名为pH7GWIWGII-osc8-1，其包括正向插入pH7GWIWG2(II)载体的序列表中的序列1所示的DNA分子和反向插入pH7GWIWG2(II)载体的序列表中的序列1所示的DNA分子，为RNA干扰载体。二、OsOSC8的RNA干扰载体获得育性降低的转基因植物1、重组农杆菌的获得将由上述一得到的RNA干扰载体pH7GWIWGII-osc8-1在1800V电击转化农...